促紅細(xì)胞生成素在腦缺血性損傷中的研究進(jìn)展

王曉芳，王 妮，胡曉飛綜述，呂曉紅審校

促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)曾被認(rèn)為是由腎臟和肝臟分泌的一種激素樣物質(zhì)，用于促進(jìn)紅細(xì)胞生成。近些年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)了EPO 的神經(jīng)保護(hù)作用，本文主要對(duì)EPO 在腦缺血性損傷中的作用及作用機(jī)制做一綜述。

1 EPO 在腦缺血性損傷中的保護(hù)作用

1.1 內(nèi)源性EPO 在腦缺血性損傷中的保護(hù)作用 大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外研究表明，內(nèi)源性EPO 參與了多種因素對(duì)腦缺血性損傷的保護(hù)作用。Konstantin Prass 等將Sv129/J 小鼠在8%O2中進(jìn)行不同時(shí)間缺氧預(yù)適應(yīng)(hypoxia preconditioning，HP)，之后結(jié)扎一側(cè)大腦中動(dòng)脈，不同的時(shí)間間隔后給予缺血后再灌注，最后比較大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)域的腦梗死面積，并分別用反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)、電泳遷移率變動(dòng)分析檢測EPO 基因的表達(dá)，結(jié)果表明在腦缺血48 h 或72 h 前給予3～5 h 的HP，可使短暫局部腦缺血后腦梗死面積明顯減小，并且在HP60 min 后EPO mRNA 增加了7 倍，注射可溶性的促紅細(xì)胞生成素受體(erythropoietin receptor，EPOR)可減少40%HP 的保護(hù)作用，這說明了在HP 對(duì)腦缺性損傷的保護(hù)作用中內(nèi)源性EPO 是重要的中介物［1］。另有研究證明了EPO 也參與了缺氧后適應(yīng)對(duì)腦缺血性損傷的保護(hù)作用，Claire Leconte 等在體內(nèi)和體外腦缺血模型中，缺血一段時(shí)間后給予慢性間斷性缺氧，后發(fā)現(xiàn)小鼠腦梗死面積、原代神經(jīng)元的存活率均較對(duì)照組明顯改善，同時(shí)在體外研究中還發(fā)現(xiàn)EPO mRNA 水平也是升高的，而注射可溶性的EPOR 可以部分抵消缺氧后適應(yīng)對(duì)腦缺血性損傷的保護(hù)作用，這提示了內(nèi)源性EPO 也參與了這種保護(hù)作用［2］。此外，近年來還有研究證實(shí)了銀杏內(nèi)酯B、馬齒莧乙醇提取物對(duì)腦缺血性損傷的保護(hù)作用也是部分依賴于穩(wěn)定低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)后促進(jìn)生成的內(nèi)源性EPO［3，4］。

1.2 外源性EPO 在腦缺血性損傷中的保護(hù)作用 隨著內(nèi)源性EPO 對(duì)腦缺血性損傷的保護(hù)作用被發(fā)現(xiàn)，許多研究學(xué)者將外源性EPO 應(yīng)用于腦缺血性損傷中，且同樣發(fā)現(xiàn)它的神經(jīng)保護(hù)作用。Hralova M 等預(yù)先向大鼠腹腔內(nèi)注射EPO 5000 U/Kg，10 min 后局部注射內(nèi)皮素造成局部腦缺血，然后通過局部運(yùn)動(dòng)功能描述及水迷宮實(shí)驗(yàn)比較局灶性腦缺血1 w前和3 w 后的運(yùn)動(dòng)功能和認(rèn)知功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rhEPO 預(yù)適應(yīng)可以明顯改善局部腦缺血后的運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能［5］。在體外研究中，rhEPO 預(yù)處理的保護(hù)作用也被證實(shí)。將原代皮質(zhì)神經(jīng)元在暴露于致死性缺氧之前給予24 h rhEPO 預(yù)處理，能夠明顯減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量［6］。除此以外，EPO 的后處理也在腦缺血性損傷中被證明有保護(hù)作用。在SD 大鼠局部腦缺血模型中，再灌注初期開始給予rhEPO 治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在缺血后2 h、再灌注24 h 時(shí)治療組中大鼠的腦梗死面積、腦水腫均顯著減輕，神經(jīng)功能缺損也得到了改善［7］。綜上可見外源性EPO 對(duì)于預(yù)防和治療缺血性腦血管病的有效性。

2 EPO 在腦缺血性損傷中的保護(hù)機(jī)制

2.1 參與EPO 在腦缺血性損傷中的保護(hù)作用的信號(hào)傳導(dǎo)通路 一項(xiàng)發(fā)表于“Nature”的研究指出EPO 作用于EPOR激活JAK2(janus activating kinase 2，JAK2)，使核因子-kappaB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)抑制物IκB 磷酸化后與NFκB 分離，即激活NF-κB，后者進(jìn)入細(xì)胞核，與DNA 片段結(jié)合，從而介導(dǎo)抗細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)，抵抗N-甲基-D-天門冬氨酸(N Methyl D Aspartate，NMDA)或是NO 對(duì)神經(jīng)元的毒性作用;同時(shí)研究結(jié)果也強(qiáng)調(diào)了JAK2、NF-κB 的激活對(duì)于EPO 介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用的必要性，但需注意的是，只有神經(jīng)元中的NF-κB 平穩(wěn)而持久的激活才可以發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，在膠質(zhì)細(xì)胞中或是急促的激活卻會(huì)產(chǎn)生不良作用［8］。之后另一研究對(duì)此作出了補(bǔ)充，EPO 作用于EPOR 后同樣激活JAK2，不同的是，JAK2 激活磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K)，而后者又激活蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)，使bcl-2(B-cell lymphoma-2，bcl-2)蛋白家族中促細(xì)胞凋亡蛋白BAD 磷酸化后與抑制細(xì)胞凋亡蛋白bcl-XL 或bcl-2 分離，即激活了Bcl-xL 或bcl-2，而bcl-2 被普遍認(rèn)為能夠通過保護(hù)線粒體膜的完整性和抑制線粒體細(xì)胞色素C 的釋放抑制細(xì)胞凋亡，bcl-xL 同樣也具有抗細(xì)胞凋亡作用［9］。另外JAK-STAT 通路也被一些研究證明參與了EPO 對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子(signal transducers and activators of transcription，STAT)家族包括7種轉(zhuǎn)錄因子，腦缺血再灌注損傷本身可以激活STAT1、STAT3，其中被激活的STAT1 能夠通過轉(zhuǎn)錄因子依賴和非依賴的途徑促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡，而被激活的STAT3 是發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的，EPO 則是通過促進(jìn)激活JAK2/STAT3 來發(fā)揮保護(hù)作用的，即EPO 作用于EPOR 激活JAK2 后，使STAT3 磷酸化，后者進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，從而提高神經(jīng)元的存活能力，促進(jìn)組織重塑，抑制細(xì)胞凋亡［10～12］。進(jìn)一步的研究還證明了腦缺血性損傷中STAT3 的激活可以在一定程度上抑制STAT1 的激活，原因可能是EPO 激活STAT3 后，使細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制分子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)表達(dá)上調(diào)，從而進(jìn)一步抑制了STAT1 的表達(dá)，也可能是STAT1、STAT3 競爭同一受體的作用［11］;另外JAK2激活STAT3 后，還可以上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)的表達(dá)，而在體外神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞系分化神經(jīng)元中和動(dòng)物模型中都證明了TIMP-1 參與了EPO 對(duì)腦缺血損傷保護(hù)作用，并且伴隨著TIMP-1 的上調(diào)還發(fā)現(xiàn)了基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的下調(diào)［13］。

2.2 腦缺血性損傷中EPO 對(duì)于血腦屏障的保護(hù)作用近些年來，一些研究學(xué)者還發(fā)現(xiàn)了在腦缺血性損傷中EPO對(duì)血腦屏障的保護(hù)作用。Ratilal BO 等先用rhEPO 預(yù)處理Wistar 大鼠10 min 后再結(jié)扎右側(cè)大腦中動(dòng)脈60min，在再灌注24 h 時(shí)觀察到腦梗死面積、腦梗死區(qū)退化的神經(jīng)元數(shù)量、磷酸化Akt 的表達(dá)和定位與對(duì)照組相比未見明顯差別，但腦水腫、神經(jīng)功能缺損的嚴(yán)重程度、血管周圍水腫卻是減輕的，這提示了此時(shí)EPO 是通過對(duì)血腦屏障的保護(hù)間接發(fā)揮作用的，而不是通過抗神經(jīng)元凋亡作用來直接發(fā)揮作用的［14］。有研究者對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)rhEPO 預(yù)處理可能通過下調(diào)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNFα)、NFκB 亞基p65 使緊密連接相關(guān)蛋白1(ZO-1)、封閉蛋白-5(Clandin-5)、閉合蛋白(Occludin)的表達(dá)增多，從而維持緊密連接的完整性，降低血腦屏障的通透性［15］。

2.3 腦缺血性損傷中EPO 增加血管生成反應(yīng) 另外，在腦缺血性損傷中EPO 對(duì)于血管生成的作用也在受到關(guān)注。Young Jae Kim 等在SD 大鼠腦缺血再灌注損傷后給予連續(xù)4 d rhEPO 治療，14 d 后通過免疫組化技術(shù)觀察到脈絡(luò)叢和大腦血管中的內(nèi)皮祖細(xì)胞生成增加，說明了EPO 可以促進(jìn)血管生成，并且該研究還發(fā)現(xiàn)rhEPO 可能直接作用于大腦中的血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)后者產(chǎn)生更多的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、腦衍生營養(yǎng)因子(brain derived growth factor，BDGF)加速血管再生和少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cells，OPCs)的再生［16］。之后又有研究者發(fā)現(xiàn)EPO 可以募集內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)至組織損傷區(qū)域，形成微脈管結(jié)構(gòu)，然后在VEGF、Ang-1 的參與下，促進(jìn)和維持微脈管的完整性［17］。

2.4 腦缺血性損傷中EPO 的保護(hù)作用與促進(jìn)神經(jīng)再生有關(guān) Shingo T 等在體內(nèi)研究和體外研究中發(fā)現(xiàn)了EPO 可以促進(jìn)多能神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元前體細(xì)胞分化，并且STAT5、NF-κB、神經(jīng)母細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)移因子(achaete scute complex homolog 1，Mash1)參與了該作用機(jī)制［18］。還有研究者進(jìn)行了進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)EPO 能夠促進(jìn)SVZ 區(qū)神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖、遷移到損傷的紋狀體區(qū)，并且可以促進(jìn)神經(jīng)祖細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，抑制向星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化［19］。以上結(jié)果均表明了腦缺血損傷中EPO 的保護(hù)作用與促進(jìn)神經(jīng)再生有關(guān)。

2.5 腦缺血性損傷中EPO 的保護(hù)作用與抗氧化應(yīng)激有關(guān) 氧化應(yīng)激是腦缺血性損傷的重要機(jī)制之一，近年來有研究證明EPO 也可以通過參與抗氧化應(yīng)激發(fā)揮腦保護(hù)作用。在永久性局灶腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭?，缺? h 后給予EPO 治療，在缺血24 h 后取出腦組織行免疫組化技術(shù)和Western blot 檢測細(xì)胞核因子紅系-2 相關(guān)因子(nuclear factor erythroid 2-related factor，Nrf2)、Ⅰ型血紅素氧合酶(heme oxygenase-1，HO-1)陽性細(xì)胞數(shù)量和含量，發(fā)現(xiàn)在rhEPO 治療組、模型組、假手術(shù)組中依次降低，并且發(fā)現(xiàn)了治療組腦組織中H2O2濃度明顯降低［20］。結(jié)合以往研究結(jié)果，該研究提示了rhEPO可以促進(jìn)激活Keap1-Nrf2/ARE 抗氧化應(yīng)激通路，即rhEPO可以使Keap1(Kelch-like ECH-associated protein1，Keap1)與Nrf2 分離，從而激活Nrf2，后者進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)原件(antioxident response element，ARE)結(jié)合，從而介導(dǎo)一系列抗氧化酶基因的表達(dá)，包括HO-1，發(fā)揮保護(hù)作用［20］。

2.6 腦缺血性損傷中EPO 的保護(hù)作用與抗炎性作用有關(guān) 此外，在腦缺血性損傷中還有研究證明了EPO 的抗炎作用。Villa P 等將大鼠一側(cè)大腦中動(dòng)脈結(jié)扎后立即給予rhEPO 治療，24 h 后發(fā)現(xiàn)梗死區(qū)內(nèi)白細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯減少、星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化明顯受到抑制，另外通過免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、白細(xì)胞介素-6(inferleuKi-6，IL-6)、單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)均較對(duì)照組降低了50%以上，同樣的結(jié)果在體外實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)。該學(xué)者又進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，卻發(fā)現(xiàn)rhEPO 并非直接作用于表達(dá)EPOR 的星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等炎性作用相關(guān)細(xì)胞，通過抑制炎性介質(zhì)的合成和釋放發(fā)揮抗炎作用，而是通過對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，減少神經(jīng)元的凋亡，從而減弱了炎性作用，即抗炎作用次于神經(jīng)保護(hù)作用［21］。Raluca Reitmeir 等在短暫局部腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭羞€發(fā)現(xiàn)了EPO 可以明顯減少腦缺血半球中的炎性因子IL-1β、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等表達(dá)，從而抑制腦萎縮、加快神經(jīng)功能的恢復(fù)［22］。

2.7 腦缺血性損傷中EPO 的其他保護(hù)機(jī)制 近些年來研究者們還發(fā)現(xiàn)EPO 對(duì)腦缺血性損傷的其他保護(hù)機(jī)制。EPO 能夠通過抑制絲裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)的磷酸化，減少細(xì)胞質(zhì)膜上組織Ⅳ型水通道蛋白(aquaporin-4，AQP4)含量，從而減輕糖氧奪獲/復(fù)氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/Reox)后星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞水腫、線粒體腫脹［23］;也可以通過激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，恢復(fù)AQP4 的磷酸化水平，下調(diào)AQP4 的表達(dá)，分別起到對(duì)AQP4 的快速調(diào)節(jié)和緩慢調(diào)節(jié)作用，從而減輕糖氧奪獲/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/Rep)后星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞水腫［24］。以上均是在體外星形膠質(zhì)細(xì)胞中證明了EPO 與AQP4 的關(guān)系，也有研究者在體內(nèi)做了相關(guān)研究。Olivier Brissaud 等在新生大鼠腦缺血缺氧后超急性期通過磁共振彌散加權(quán)成像和免疫組化技術(shù)觀察到外源性EPO 可以使腦損傷面積減少40%，同時(shí)AQP4 的表達(dá)含量上調(diào)，該研究者推測可能是AQP4 的上調(diào)與清除腦組織中過剩的水至血液中有關(guān)［25］。還有研究發(fā)現(xiàn)了EPO 在腦缺血性損傷中可改善突觸可塑性，作用機(jī)制與它可以導(dǎo)致突觸可塑性相關(guān)基因Egr2、Arc 等上調(diào)有關(guān)［26］。另外在局部腦缺血損傷急性期后EPO 的治療可以抑制腦缺血損傷區(qū)域的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞化，下調(diào)損傷對(duì)側(cè)大腦半球抗可塑性蛋白神經(jīng)黏蛋白(neurocan)、ephrin B1 的表達(dá)同時(shí)上調(diào)促可塑性蛋白sprr1 的表達(dá)促進(jìn)損傷對(duì)側(cè)錐體束發(fā)出突觸至去神經(jīng)分布的區(qū)域，加快神經(jīng)功能恢復(fù)［22］。此外還發(fā)現(xiàn)了EPO 在腦缺血性損傷的保護(hù)作用與代謝酶類調(diào)節(jié)有關(guān)。EPO 預(yù)處理可以使原代神經(jīng)元中的二磷酸核苷激酶A(nucleoside diphosphate kinase A，NDPKA)上調(diào)，神經(jīng)元內(nèi)NDPKA 的上調(diào)或是外源性應(yīng)用NDPKA 重組蛋白均可以提高腦缺血性相關(guān)損傷的動(dòng)物模型中神經(jīng)元的生存能力［27］。在全腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭型庠葱訣PO 可激活海馬腹側(cè)神經(jīng)元的NOS，從而刺激第2 信使cGMP 介導(dǎo)的信號(hào)通路增加突觸的可塑性［28］。還有研究發(fā)現(xiàn)EPO 能夠通過抑制磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH)減少腦缺血再灌注損傷后大鼠缺血半暗帶中神經(jīng)元的凋亡［29］。

3 展 望

EPO 在腦缺血損傷中的保護(hù)作用已經(jīng)被大量研究所證實(shí)，它的保護(hù)機(jī)制也日趨明朗化，但仍需進(jìn)一步探索。此外EPO 在腦缺血性損傷中保護(hù)作用的效率性、安全性以及如何將其以最大效率合理利用到腦缺血性損傷的治療中同樣有待進(jìn)一步研究。這些工作或許可以為腦缺血性損傷的治療提供一種新的可能性。

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