組織塊貼壁法培養(yǎng)SD大鼠腹主動脈平滑肌細胞及鑒定

譚元生，唐文利，王順民，張 穩(wěn)

20世紀末有研究表明，血管平滑肌細胞（VSMC）過度生長是高血壓條件下血管重構(gòu)的經(jīng)典機制［1，2］。平滑肌細胞異常增殖和纖維化引起血管壁增厚和管腔狹窄，造成血管重構(gòu)，可促進高血壓等疾病的形成和發(fā)展，并可影響心、腦、腎等重要器官的結(jié)構(gòu)與功能，最終導(dǎo)致這些器官功能衰竭，是導(dǎo)致心血管疾病死亡的主要原因之一。近年來隨著研究進展的深入，抑制血管平滑肌增殖對心腦血管疾病的預(yù)防受到越來越多學(xué)者的關(guān)注。體外培養(yǎng)血管平滑肌細胞是研究血管平滑肌細胞生物特性的基礎(chǔ)。本實驗利用SD大鼠腹主動脈成功分離、培養(yǎng)出血管平滑肌細胞，希望能為該類實驗研究提供純度高、結(jié)構(gòu)和功能良好的平滑肌細胞。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級SD大鼠，雄性，體重（100～150）g（由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供）。

1.2 儀器與試劑 倒置相差顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠，中國）；熒光倒置顯微鏡（OLYMPUS公司，日本）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo Forma公司，美國）；胎牛血清（杭州四季青生物制品公司，中國）；DMEM 培養(yǎng)基（Hy－clon公司）；胰酶細胞消化（Trypsin－EDTA Solution）含0.25%胰酶和0.02%EDTA （碧云天，美國）；小鼠抗大鼠SMα－actin單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司，中國）；即用型SABC免疫組化染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，中國）；3，3’－氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，中國）；青霉素鈉、硫酸鏈霉素（碧云天，中國）。

1.3 細胞培養(yǎng)

1.3.1 原代培養(yǎng) 將SD大鼠斷頸處死，在無菌條件下取其腹主動脈段，立即置于含青霉素鈉、硫酸鏈霉素的無菌PBS液體中。將其移入超凈工作臺上，在盛有PBS液的培養(yǎng)皿上清除結(jié)締組織，完整剝除動脈外膜。用PBS液漂洗（2～3）次后，縱向剖開血管，將血管內(nèi)膜面向上平鋪于培養(yǎng)皿上，用眼科彎鑷鈍性刮除內(nèi)膜，以去除內(nèi)皮細胞，動作輕柔以免破壞血管中膜。剪去血管兩端鉗夾過的組織，再用PBS液清洗3次，放入盛有含20%胎牛血清、青霉素鈉100U／mL，硫酸鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，用眼科彎剪反復(fù)將其剪成1 mm×1mm左右的小組織塊，用彎頭吸管移入培養(yǎng)瓶中。以0.5cm左右的間距將組織塊均勻分布于培養(yǎng)瓶底部。輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，讓瓶底朝上并向瓶內(nèi)注入含20%胎牛血清、青霉素鈉100U／mL，硫酸鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液（3～4）mL，然后瓶蓋旋松，置于CO2培養(yǎng)箱中靜置5h～6h使組織塊干涸并與瓶底貼壁附著后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，使組織塊完全浸入培養(yǎng)液中，繼續(xù)靜置于（37℃，5%CO2，95%空氣，保持一定濕度）CO2培養(yǎng)箱中3d～5d。待有細胞從組織塊周圍游出后換液，以后2d～3d換液1次。

1.3.2 細胞換液 當(dāng)細胞增殖旺盛，培養(yǎng)液由桃紅色變?yōu)辄S色時，則需換液。在超凈工作臺上，吸棄原培養(yǎng)基，用PBS液輕輕沖洗2遍后，加入新鮮含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基4mL繼續(xù)培養(yǎng)，也可進行半量或1／3量換液。換液時應(yīng)動作輕柔，盡量不要碰到組織塊。

1.3.3 細胞傳代 至單層細胞鋪滿近培養(yǎng)瓶底的80%～90%以上傳代。將原代細胞瓶內(nèi)的培養(yǎng)液小心吸棄，加入PBS液2mL輕晃培養(yǎng)瓶沖洗細胞2次，吸棄，加0.25%胰酶液2mL在37℃消化約40s。在倒置顯微鏡下見細胞回縮、變圓，細胞成片收縮呈球形時，立即加入含血清培養(yǎng)基終止消化。然后輕輕吹打瓶壁細胞使其完全脫落，形成的細胞懸液在鏡下計數(shù)，按1∶2接種。周期為5d～7d。首次傳代時，脫落的組織塊可以轉(zhuǎn)移到新的25cm培養(yǎng)瓶中，靜置于37℃的CO2孵箱中，按原代培養(yǎng)方法使組織塊重新貼壁。24h后可見細胞重新貼壁生長。以后2d～3d換液1次，1周左右后細胞再次長成致密單層時即可再次傳代。未消失的組織塊會隨細胞換液、傳代而除去，待細胞傳代至（4～7）代，即可用于實驗。

1.4 平滑肌細胞鑒定

1.4.1 細胞形態(tài)學(xué)觀察 用倒置相差顯微鏡觀察細胞大小、形態(tài)、生長特點及排列方式等。

1.4.2 細胞存活率的檢測 消化傳代的細胞懸液9滴，加入1滴0.4%臺盼藍液，混勻后3min內(nèi)吸取1滴于血球計數(shù)器上，置顯微鏡下觀察，凡著色細胞均為不正常細胞或死亡細胞。共計數(shù)1 046個細胞。

1.4.3 細胞免疫組化 第5代對數(shù)生長期的細胞懸液接種到（先放置2張7mm×22mm蓋玻片）培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)2d～3d取出蓋玻片，PBS漂洗5min×3次，4%的多聚甲醛室溫下固定（20～30）min，PBS再次漂洗5min，3次，然后按照即用型SABC免疫組化染色試劑盒和DAB顯色試劑盒說明書逐條進行操作。

2 結(jié) 果

2.1 平滑肌細胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察 原代培養(yǎng)6d～7d，倒置顯微鏡下可觀察到少量細胞自組織塊邊緣游出，形態(tài)呈梭形或長梭形，但不是所有的組織塊周邊都有，漸向外生長形成細胞暈，進而形成細胞簇，大小略有差異。傳代后80%～90%的細胞可重新貼壁生長，繼續(xù)培養(yǎng)，數(shù)量逐漸增加，4d～6d后長成致密細胞層，出現(xiàn)“峰－谷”狀結(jié)構(gòu)細胞恢復(fù)為梭形或長梭形外觀，細胞大小趨于一致。

2.2 細胞存活率 臺盼藍液染色共計數(shù)1 046個細胞，其中30個陽性，約有95%以上的細胞染色呈陰性，表明培養(yǎng)的細胞消化傳代后成活率較高。

2.3 細胞組織學(xué)鑒定 培養(yǎng)第5代的細胞經(jīng)特異的SMα－actin免疫細胞化學(xué)染色后，胞漿著棕黃色，呈陽性表達。結(jié)果表明，所得細胞為典型的平滑肌細胞。

3 討 論

血管平滑肌細胞是構(gòu)成血管壁組織結(jié)構(gòu)及維持血管張力的主要細胞成分，其結(jié)構(gòu)和功能的改變是導(dǎo)致高血壓、動脈粥樣硬化和血管成形術(shù)后再狹窄等多種心血管病的細胞病理學(xué)基礎(chǔ)［3］。目前常用的血管平滑肌細胞培養(yǎng)方法有酶消化法［4］和組織貼塊法。其中，酶消化法由于所需組織量較大、實驗操作復(fù)雜、消化酶價格昂貴、酶作用時間不易掌握、消化酶本身對細胞有毒性作用等原因，常常不是細胞培養(yǎng)的首選方法。而組織貼塊法具有操作簡單易行、存活率較高、純度較高、實驗重復(fù)性高等優(yōu)點，成為許多研究者獲取原代平滑肌細胞的重要途徑。本研究采用了組織塊培養(yǎng)法，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及免疫組化方法鑒定和臺盼藍液染色檢查細胞成活率高，形態(tài)學(xué)和功能良好。

本實驗體會有：①每次實驗前要仔細檢查準(zhǔn)備工作，制定具體實驗步驟，先把本次實驗所需的PBS、DMEM培養(yǎng)液、實驗藥品配制，分裝好并移入超凈工作臺，檢查酒精燈、酒精棉球等消毒用品，紫外下消毒30min。②嚴格無菌操作過程。包括實驗環(huán)境與操作臺面消毒、試劑消毒，以及洗手、關(guān)門、換鞋換衣等細節(jié)，處死動物后用75%酒精浸泡6min，取動脈宜在細胞培養(yǎng)室超凈工作臺內(nèi)進行。③在貼壁法培養(yǎng)血管平滑肌細胞過程中，仍然存在一些需要注意的問題：取材時嚴格無菌操作，動作輕柔，避免大力牽拉血管造成損傷，不利于后期細胞的生長。④組織塊不應(yīng)剪切過小，1mm×1mm大小適中，組織邊緣要求整齊、光滑，這樣利于細胞從組織塊中游離出和生長。組織塊間距應(yīng)為5mm，以保證細胞從組織塊游出后有足夠的生長空間并保持局部細胞密度的均勻，從而獲得盡量多的原代細胞。

因此，在今后的類似實驗中研究者應(yīng)不斷在實踐中摸索、改進，為獲取純度、存活率高的平滑肌細胞提供扎實的基礎(chǔ)。

本實驗嚴格按照實驗流程，整個過程嚴格無菌操作，最終通過實驗鑒定，獲得了較為理想的大鼠腹主動脈平滑肌細胞，為接下來即將進行中藥含藥血清干預(yù)平滑肌細胞增殖的實驗提供了存活率、純度都較高的實驗材料。

［1］ 楊傳華，陸峰，張翠英.高血壓血管重塑與絡(luò)病的相關(guān)性［J］.山東中醫(yī)雜志，2005，24（11）：643－645.

［2］ Gohlke P，Lamberty V，KuwerL，etal.Vascularre modeling insystemic hypertension［J］.Am J Cardiol，1993，71：2E－7E.

［3］ 戴恩來，薛國忠，武俊斌，等.大鼠血管平滑肌細胞的貼塊法培養(yǎng)［J］.中國兒科雜志，2007，3（2）：47－48.

［4］ 王明勇，陳楓，陳莊.酶消化法分離老齡SD大鼠血管平滑肌細胞［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2011，12（40）：3482－3483.