急性呼吸窘迫綜合征患者肺泡灌洗液蛋白組學(xué)研究進(jìn)展

急性呼吸窘迫綜合征患者肺泡灌洗液蛋白組學(xué)研究進(jìn)展

任珊1，2席修明1

作者單位： 100000 北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)?fù)興醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科1

050051 河北省人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科2

【關(guān)鍵詞】急性呼吸窘迫綜合征；肺泡灌洗液；蛋白組學(xué)

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是以嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克等多種肺內(nèi)外危險(xiǎn)因素導(dǎo)致的以肺泡毛細(xì)血管損傷為主要病理特征，以非心源性肺水腫和頑固性低氧血癥為主要臨床表現(xiàn)的疾病。盡管現(xiàn)有的醫(yī)療救助水平已有明顯提高，但從原始的ARDSnet研究起，ARDS的發(fā)生率和總體病死率實(shí)質(zhì)上沒(méi)有變化，成人病死率仍在40%以上[1-3]。ARDS往往是多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)中最先出現(xiàn)的器官損害，而MODS作為ARDS最嚴(yán)重并發(fā)癥，它的發(fā)生將意味著需要更加密集和高昂醫(yī)療的投入，其嚴(yán)重的并發(fā)癥和高病死率對(duì)各國(guó)醫(yī)療事業(yè)來(lái)說(shuō)，都是一個(gè)沉重的負(fù)擔(dān)。

一、ARDS柏林定義

1994年歐美共識(shí)會(huì)議(The American-European Consensus Conference, AECC)提出的ARDS診斷標(biāo)準(zhǔn)一直被沿用多年。這一診斷指標(biāo)相對(duì)簡(jiǎn)單易行，但是其中的一些定義比較模糊，需要人為判斷(如對(duì)胸片的判讀)，缺乏客觀性，同時(shí)易受其他因素干擾(如氧合指數(shù)能體現(xiàn)疾病嚴(yán)重程度，同時(shí)受到吸入氧濃度和呼氣末正壓的影響)，因此，應(yīng)用這個(gè)診斷標(biāo)準(zhǔn)無(wú)法及時(shí)、有效和準(zhǔn)確的對(duì)疾病進(jìn)行診斷[4-5]。2012年提出“ARDS柏林定義”，內(nèi)容為[6]: (1) 1周內(nèi)明確的危險(xiǎn)因素后新出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)癥狀或呼吸系統(tǒng)癥狀明顯加重；(2)胸部影像(胸部X 線片或CT) 顯示用滲出、肺部結(jié)節(jié)、肺葉或肺段不張不能完全解釋的雙側(cè)肺部浸潤(rùn)陰影；(3)不能用心力衰竭或液體超負(fù)荷來(lái)解釋呼吸衰竭，沒(méi)有危險(xiǎn)因素情況時(shí)，需使用超聲心動(dòng)圖等客觀依據(jù)來(lái)排除靜水壓增高引起的呼吸衰竭；(4)根據(jù)呼氣末正壓≥5 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)時(shí)的PaO2/FiO2，將ARDS分為：輕度、中度和重度3個(gè)嚴(yán)重程度級(jí)別，即輕度ARDS：200 mmHg

目前，ARDS的發(fā)病機(jī)制可能與肺內(nèi)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)、肺內(nèi)凝血和纖溶系統(tǒng)的紊亂、肺泡和毛細(xì)血管內(nèi)皮的損傷等多種機(jī)制有關(guān)，這些機(jī)制的相互作用、相關(guān)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)、發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)理和ARDS早期識(shí)別的特異性生物學(xué)標(biāo)志物都不甚清楚。生物學(xué)功能最終是由蛋白質(zhì)直接實(shí)現(xiàn)的，蛋白組學(xué)研究已成為組學(xué)時(shí)代的重要組成部分，Walter等[7]提出：未來(lái)基因組學(xué)和蛋白組學(xué)的快速發(fā)展將對(duì)ARDS做出更大的貢獻(xiàn)。盡管對(duì)ARDS發(fā)病機(jī)制的理解不斷加深，對(duì)于預(yù)測(cè)ARDS進(jìn)展和危險(xiǎn)分層仍然是有限的，生物學(xué)標(biāo)志物能夠有助于識(shí)別發(fā)生ARDS的風(fēng)險(xiǎn)性、評(píng)估療效、預(yù)測(cè)預(yù)后、優(yōu)化臨床試驗(yàn)入選標(biāo)準(zhǔn)，為人類(lèi)疾病研究提供新的手段和依據(jù)。蛋白組學(xué)方法能夠?yàn)檠芯空咛峁〢RDS中蛋白質(zhì)定位、修飾、相互作用及功能，在ARDS的蛋白網(wǎng)絡(luò)中許多高度聯(lián)系的結(jié)點(diǎn)蛋白并沒(méi)有深入研究，蛋白組學(xué)技術(shù)可能是發(fā)現(xiàn)新的生物學(xué)標(biāo)志物的重要方法。

二、ARDS蛋白組學(xué)研究進(jìn)展

蛋白組學(xué)技術(shù)在危重癥領(lǐng)域的應(yīng)用逐漸廣泛深入，目前多項(xiàng)臨床與基礎(chǔ)研究關(guān)于ARDS與正常血漿或肺泡灌洗液有多種差異蛋白表達(dá)，還有針對(duì)ARDS發(fā)病的不同時(shí)期及不同預(yù)后的比較。

1. 臨床研究：在ARDS發(fā)病過(guò)程中(1 d、3 d、7 d)對(duì)肺泡灌洗液蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，應(yīng)用定量電泳技術(shù)找到37種差異蛋白，基因富集分析顯示這些差異蛋白主要是炎癥、感染及損傷蛋白，網(wǎng)絡(luò)分析準(zhǔn)確預(yù)測(cè)出ARDS發(fā)病機(jī)制中的重要介質(zhì)，如：腫瘤壞死因子α、白介素1β、白介素6、脂多糖結(jié)合蛋白、p38絲裂原活化蛋白激酶等。這些蛋白在ARDS中相互作用，為疾病發(fā)病機(jī)制和預(yù)后評(píng)估提供新思路[8]。

Poon等[9]應(yīng)用蛋白組學(xué)方法分析嚴(yán)重ARDS患者預(yù)后因素，經(jīng)western blot驗(yàn)證后確認(rèn)血清血小板因子4(platelet factor 4, PF4)下降和β血小板球蛋白(β-thromboglobulin, β-TG)升高提示預(yù)后差，在ARDS病情進(jìn)展中起指導(dǎo)和預(yù)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)、治療決策等作用。

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)引起的呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎(ventilator-associated pneumonia, VAP)患者肺泡灌洗液差異蛋白比較，在ALI組中有無(wú)VAP組間發(fā)現(xiàn)76種差異蛋白表達(dá)，對(duì)這些蛋白進(jìn)行功能學(xué)分析提示VAP促炎途徑激活，Nguyen等[10]鑒定并驗(yàn)證了其中三種蛋白：S100A8, 乳鐵蛋白(lactotransferrin, LTF)、輔肌動(dòng)蛋白 1 (actinin 1, ACTN1)在肺損傷發(fā)生和VAP發(fā)展過(guò)程中的作用，并通過(guò)ROC曲線下面積得出結(jié)論：將三種指標(biāo)綜合分析是ALI患者是否發(fā)生VAP的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

ARDS在滲出期(第一天)和恢復(fù)期(第五天)對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞蛋白表達(dá)的差異，在滲出期蛋白表達(dá)擴(kuò)大和保持了炎癥反應(yīng)，恢復(fù)期蛋白下調(diào)炎癥反應(yīng)，可避免進(jìn)一步組織損傷和肺內(nèi)炎癥進(jìn)展，蛋白可引起功能的改變，為ALI/ARDS診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后提供了有價(jià)值的生物學(xué)標(biāo)志物。135種蛋白在滲出期和恢復(fù)期有表達(dá)差異，其中17種蛋白表達(dá)在恢復(fù)期明顯增加，10種蛋白在滲出期呈明顯高表達(dá)。X選擇S100A9(恢復(fù)期)和HSP27(滲出期)進(jìn)行western bolt驗(yàn)證，通過(guò)鑒定蛋白尋找炎癥反應(yīng)規(guī)律、細(xì)胞骨架組織、氧化應(yīng)激、細(xì)胞調(diào)亡和代謝，以期探索早期診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物[11]。

應(yīng)用同位素相對(duì)標(biāo)記與絕對(duì)定量技術(shù)(Isobaric tag for relative and absolute quantitation, iTRAQ)技術(shù)研究ARDS和正常人血漿蛋白差異比較，ARDS組根據(jù)病因不同分為直接肺損傷和間接肺損傷，16種蛋白在ARDS組與正常組表達(dá)有差異，其中11種蛋白在直接肺損傷和間接肺損傷中均有表達(dá)，5種蛋白僅在間接肺損傷中有所表達(dá)，生物學(xué)過(guò)程主要為脂質(zhì)運(yùn)輸和補(bǔ)體激活，分子功能主要為脂質(zhì)運(yùn)輸、絲氨酸肽酶。信號(hào)網(wǎng)絡(luò)分析顯示多種重疊蛋白，包括：急性期反應(yīng); 肝臟X受體/維甲類(lèi)X受體 (liver X receptor/ retinoid x receptor, LXR/RXR) 、活化的farnesoid X (FXR)/RXR 、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、動(dòng)脈粥樣硬化、白介素-12、補(bǔ)體系統(tǒng)、細(xì)胞因子、一氧化氮等，為ARDS的診斷提供了新的候選生物學(xué)標(biāo)志物并闡述了其潛在病理學(xué)機(jī)制[12]。

近期一項(xiàng)研究分析ARDS幸存者與死亡者蛋白表達(dá)差異，開(kāi)始機(jī)械通氣后分為早期組(1～7 d)和晚期組(8～35 d)，根據(jù)預(yù)后可分為早期存活者和早期死亡者、晚期存活者三組[13]。通過(guò)iTRAQ標(biāo)記進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定蛋白，并應(yīng)用ELISA法進(jìn)行驗(yàn)證可見(jiàn)Clara細(xì)胞分泌蛋白、膜突蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶9，這些蛋白在早期死亡者中水平升高。在早期存活者中，纖溶酶原、抗凝血酶Ⅲ、因子12、血漿銅藍(lán)蛋白表達(dá)活躍，在早期死亡者中，S-100與硫氧化還原蛋白表達(dá)升高。基因富集分析顯示：在早期存活者與死亡者中，早期存活者可表達(dá)出免疫反應(yīng)激活、細(xì)胞陽(yáng)離子穩(wěn)態(tài)、鐵離子穩(wěn)態(tài)、凝血激活、凝血抑制等。死亡者可表達(dá)出膠原代謝過(guò)程、葡萄糖分解過(guò)程、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組。

2. 基礎(chǔ)研究：Menoret等[14]通過(guò)吸入金黃色葡萄球菌腸毒素A，增強(qiáng)毛細(xì)血管通透性和細(xì)胞損傷、增加肺中蛋白和細(xì)胞因子濃度以制造ALI小鼠模型，通過(guò)肺泡灌洗液尋找在臨床癥狀出現(xiàn)前預(yù)測(cè)ALI的生物學(xué)標(biāo)志物，應(yīng)用蛋白組學(xué)方法比較吸入金黃色葡萄球菌腸毒素A16h后的肺泡灌洗液與僅應(yīng)用賦形劑治療的小鼠肺泡灌洗液，在吸入金黃色葡萄球菌腸毒素A的肺泡灌洗液中出現(xiàn)細(xì)胞色素b5和細(xì)胞角蛋白17。細(xì)胞色素b5在細(xì)支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)。肺損傷開(kāi)始時(shí)，造模組細(xì)胞色素b5明顯下降。細(xì)胞角蛋白17廣泛存在于肺組織中，并在吸入金黃色葡萄球菌腸毒素A的肺泡灌洗液中表達(dá)增強(qiáng)，這些新的生物學(xué)標(biāo)志物能夠預(yù)測(cè)ALI的發(fā)生，并為肺損傷機(jī)制提供新思路。

Bhargava等[15]制造大鼠ARDS模型，應(yīng)用iTRAQ和質(zhì)譜分析在損傷肺中研究肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的改變對(duì)恢復(fù)機(jī)制的作用，183種蛋白在損傷恢復(fù)過(guò)程中明顯變化，基因富集分析鑒定這些蛋白的作用主要在細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞代謝、離子平衡、程序性細(xì)胞死亡、泛素化等方面發(fā)揮作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)兩條活躍的信號(hào)通路：JNK、miR374。AT2細(xì)胞蛋白在高氧應(yīng)激時(shí)發(fā)生了一系列變化。

針對(duì)假單胞菌誘導(dǎo)的ALI大鼠與正常大鼠的肺組織進(jìn)行差異蛋白比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)18種差異蛋白，其中PRDX1是炎癥啟動(dòng)因子，并通過(guò)RT-PCR、western blot、免疫組化法進(jìn)行驗(yàn)證，可能成為ALI新的潛在治療靶點(diǎn)[16]。

內(nèi)毒素引起的ALI大鼠上皮襯液研究，對(duì)支氣管微量采樣進(jìn)行蛋白組學(xué)研究，在已治療的內(nèi)毒素大鼠組與腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白的分子量一致，在應(yīng)用腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)化酶抑制劑治療的大鼠中，這些蛋白的濃度下降或消失，在輸注內(nèi)毒素后6和24 h對(duì)未進(jìn)行氣管切開(kāi)術(shù)的大鼠進(jìn)行支氣管微量采樣，可檢測(cè)出多種細(xì)胞因子如IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α和IFN-γ，這種新的大鼠支氣管微量采樣技術(shù)可以測(cè)定內(nèi)毒素導(dǎo)致的急性肺損傷TNF-γ濃度，也可以做蛋白組學(xué)分析，并且這個(gè)過(guò)程能夠連續(xù)的收集上皮層襯液，以檢測(cè)大鼠急性肺損傷模型時(shí)間依賴(lài)性細(xì)胞因子的變化[17]。

綜上所述，針對(duì)ARDS蛋白組學(xué)的臨床及基礎(chǔ)研究有利于揭示ARDS發(fā)病機(jī)制，同時(shí)生物學(xué)標(biāo)志物有利于我們?cè)缙谧R(shí)別ARDS，并用于危險(xiǎn)分層、評(píng)價(jià)療效和預(yù)后[18]。

三、研究前景與展望

如果能對(duì)ARDS發(fā)病過(guò)程進(jìn)行有效干預(yù)，或?qū)ζ浒l(fā)病能夠進(jìn)行早期準(zhǔn)確的診斷，對(duì)于降低ARDS發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)以及改善患者生存狀況必將產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。通過(guò)蛋白組學(xué)技術(shù)有助于我們探明ARDS的發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，并對(duì)ARDS的預(yù)防、診斷及靶向治療提供依據(jù)。人們對(duì)ARDS發(fā)病機(jī)理，尤其是分子水平的了解非常有限；對(duì)于ARDS的診斷缺乏客觀準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)。如果能在這兩個(gè)方面開(kāi)展相應(yīng)的工作，必將對(duì)ARDS的臨床治療產(chǎn)生積極的影響。

蛋白組學(xué)技術(shù)能夠在一定程度上反映出疾病的發(fā)病機(jī)制及蛋白的相互作用，但僅針對(duì)低分子量、低豐度蛋白等有限范圍的蛋白質(zhì)，因此，ARDS肺泡灌洗液的蛋白組學(xué)技術(shù)仍存在一定的局限性，有待于進(jìn)一步改進(jìn)和完善[19]。

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(本文編輯：黃紅稷)

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·綜述·

收稿日期：(2015-04-23)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：中圖法分類(lèi)號(hào)： R563 A

通訊作者：席修明，Email：xxm2937@sina.com

基金項(xiàng)目：高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金聯(lián)合資助課題(2013BSXKD0009)

DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.03.027