枯草芽胞桿菌發(fā)酵對(duì)玉米干酒糟氨基酸組成的影響及發(fā)酵條件研究

■董文豪 史慧玲 郝曉鳴 喬家運(yùn) 范 寰， 王文杰，

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300386；2.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300112）

玉米DDGS又稱玉米干酒槽（Distillers Dried Grains with Soluble,DDGS），是一種廉價(jià)的高蛋白飼料，含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪、纖維素、鈣和磷等，在家禽飼料中均有廣泛應(yīng)用。Ham等對(duì)生長(zhǎng)肥育牛的飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明，飼喂酒糟副產(chǎn)品（DDGS）的生長(zhǎng)肥育牛增重速度和效率均高于壓扁玉米（DRC）（P＜0.05），McClelland等報(bào)道，在豬日糧中添加不同量的玉米DDGS后，隨DDGS喂食水平的增加，豬的腹部柔軟度上升，背膘和腹部的不飽和脂肪酸呈線性增加，肉質(zhì)中含碘量也隨之增加。與玉米谷物相比玉米DDGS中的粗蛋白含量顯著提高，并高達(dá)28%～30%，但是，據(jù)報(bào)道不同來(lái)源DDGS的粗蛋白含量有很大差異，而且DDGS中粗蛋白在不同畜種不同生長(zhǎng)階段動(dòng)物腸道中的可消化利用率也不相同。此外，豬日糧中第一、第二限制性氨基酸（Lys和Met）在DDGS的加工過程中也較易受到高溫的損壞。Hughes等報(bào)道，DDGS氨基酸組成不平衡，Lys含量較低。上述因素均影響了DDGS在動(dòng)物飼料中的應(yīng)用推廣，因此，DDGS在動(dòng)物飼料應(yīng)用過程中，如何減少Lys和Met在加工過程中的損失以及提高消化率都成為人們關(guān)注的主要內(nèi)容。

動(dòng)物飼料發(fā)酵技術(shù)是指利用微生物代謝功能，通過微生物自身細(xì)胞或者酶，將飼料中的有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)有利的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。枯草芽胞桿菌是我國(guó)農(nóng)業(yè)部允許作為飼料添加劑的兩種芽胞桿菌之一，越來(lái)越多的被用于飼料微生態(tài)制劑的研制。從現(xiàn)有文獻(xiàn)來(lái)看，枯草芽胞桿菌發(fā)酵對(duì)玉米干酒糟氨基酸組成的影響尚未有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用枯草芽胞桿菌發(fā)酵玉米DDGS，通過設(shè)計(jì)4因素3水平發(fā)酵正交試驗(yàn)，利用日本日立公司L-8900氨基酸分析儀，測(cè)定發(fā)酵前、不同條件發(fā)酵后各組DDGS中氨基酸組成，通過對(duì)比分析，篩選出枯草芽胞桿菌發(fā)酵玉米DDGS的最佳發(fā)酵條件，為今后進(jìn)一步研究發(fā)酵玉米DDGS的試驗(yàn)提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 玉米DDGS飼料樣品為市售，營(yíng)養(yǎng)成分見表1。

表1 玉米DDGS營(yíng)養(yǎng)成分

1.1.2 枯草芽胞桿菌：天津市畜牧獸醫(yī)研究所飼料微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.3 枯草芽孢桿菌液體培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基。

1.1.4 試劑：氯化鈉、酵母浸粉、胰蛋白胨、氫氧化鈉、鹽酸，實(shí)驗(yàn)用水：均為實(shí)驗(yàn)室一級(jí)用水。

1.1.5 儀器：恒溫培養(yǎng)箱，L-8900氨基酸分析儀，電子分析天平（精確度±0.1 mg），恒溫干燥箱，真空干燥器。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵方法

1.2.1.1 菌種活化

將保存于斜面的菌種接一菌環(huán)到了LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min，培養(yǎng)18～22 h，置于4 ℃冰箱保存，備用。

1.2.1.2 枯草芽胞桿菌最佳培養(yǎng)條件

依據(jù)枯草芽胞桿菌在不同pH值、溫度、轉(zhuǎn)速、時(shí)間下生長(zhǎng)量的不同，設(shè)計(jì)5因素4水平正交試驗(yàn)。配制不同pH值的LB液體培養(yǎng)基，將枯草芽胞桿菌活化菌種接入滅菌后的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，按表2條件培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)平行，測(cè)600 nm處的吸光度值。確定枯草芽胞桿菌最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)時(shí)間18 h，轉(zhuǎn)速220 r/min，接種量1.6%，溫度36 ℃（見表2）。

表2 枯草芽胞桿菌培養(yǎng)正交試驗(yàn)

1.2.1.3 DDGS發(fā)酵條件

用1.2.1.1節(jié)確定的最佳培養(yǎng)條件培養(yǎng)枯草芽胞桿菌，菌液4℃保存?zhèn)溆?。影響枯草芽胞桿菌發(fā)酵玉米DDGS的主要因素有發(fā)酵pH值、接種量、時(shí)間、溫度以及含水量，本試驗(yàn)選取發(fā)酵pH值、接種量、時(shí)間和溫度4個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱量15 g玉米DDGS細(xì)粉置250 ml三角瓶中，滅菌備用。按照正交表2每瓶加入25 ml不同pH值蒸餾水，依據(jù)表3不同條件進(jìn)行發(fā)酵，設(shè)置未經(jīng)發(fā)酵組號(hào)為1，作為空白對(duì)照組，每組共設(shè)置6個(gè)平行。

1.2.2 氨基酸分析儀測(cè)定

1.2.2.1 樣品處理

將發(fā)酵后飼料樣品凍干，制成粉狀，準(zhǔn)確秤量100～130 mg飼料樣品置于試管中，加入10.0 ml 6 mol/l HCl，向試管內(nèi)通入氮?dú)?，抽真空? Pa后封口。將試管放在（110±1）℃恒溫干燥箱中，酸解22～24 h，冷卻，振蕩混勻后將管中液體轉(zhuǎn)移至容量瓶，加水定溶至25 ml。取少量定溶液體過濾，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，60℃抽真空，直至蒸干。加入3 ml 0.02 mol/l HCl，渦旋混合 1 min，待濃縮物溶解后，過0.22 μm濾膜，供氨基酸分析儀測(cè)定。

1.2.2.2 色譜條件

按照日立L-8900氨基酸分析儀說(shuō)明書的要求配制標(biāo)準(zhǔn)分析用洗脫溶液、茚三銅試劑R1和茚三銅緩沖液R2。泵1流速：0.40 ml/min（壓力2.0～15 MPa）；泵2流速：0.35 ml/min（壓力0.2～2.0 Mpa）；分析柱溫度為57℃；反應(yīng)器溫度為135℃；進(jìn)樣體積：20 μl。通道 1 檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm，通道2檢測(cè)波長(zhǎng)為440 nm，脯氨酸為通道2檢測(cè)，其余氨基酸均為通道1檢測(cè)。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0和CANOCO4.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用SPSS軟件中One-way ANOVA進(jìn)行方差分析，LSD法結(jié)合Duncan’s法進(jìn)行組間多重比較，并結(jié)合CANOCO4.5作圖分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCA分析結(jié)果及討論

將提取出來(lái)的發(fā)酵前、后玉米DDGS各組的17種氨基酸占總氨酸比例的數(shù)據(jù)，進(jìn)行主成分分析法（principal component analysis，PCA）分析，如圖1所示。圖1可以反映樣品在坐標(biāo)圖中的關(guān)聯(lián)性，相似的樣品可以聚集在一起，存在差異的樣品就會(huì)分布在坐標(biāo)圖的不同區(qū)域，由圖1可以看出，發(fā)酵前和不同條件發(fā)酵后的玉米DDGS組間均存在差異，且組間聚集較好，差異小、重復(fù)性好。通過觀察，還可以看出第2、第3和第4組分布在一條直線上的不同點(diǎn)，分析是由于他們具有一樣的發(fā)酵參數(shù)pH值，說(shuō)明是受到接種量、溫度和時(shí)間的影響導(dǎo)致的。而第5和第6組、第9和第10組均有重疊的部分，觀察其發(fā)酵參數(shù)，是由于他們具有相同的pH值條件。又依據(jù)SPSS多因素分析，看出各組氨基酸含量受pH值影響較大，差異顯著（P＜0.05）。

2.2 CCA分析結(jié)果及討論

典范對(duì)應(yīng)分析法（canonical correspondence analusis,CCA），常用于從總體上把握兩組指標(biāo)的相關(guān)性，利用兩組中提取出的代表性指標(biāo)，來(lái)反映兩組指標(biāo)之間的整體相關(guān)性。圖2是以4個(gè)發(fā)酵參數(shù)和17種氨基酸占各總氨酸比例為原始數(shù)據(jù)作的CCA排序圖。由圖2可知，發(fā)酵參數(shù)中pH值在發(fā)酵參數(shù)中起主要作用，還可得知，Gly、Val、Lys、Arg、Ser、Leu、Ile、His、Tyr與 pH值、接種量、溫度和時(shí)間等發(fā)酵參數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系，而Thr、Met、Phe、Pro、Cys、Ala、Asp、Glu與發(fā)酵參數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。其中，Gly、Val和Lys受接種量影響較大；Arg受pH值和時(shí)間影響較大，Ser和Leu受溫度影響較大。

表3 玉米DDGS發(fā)酵正交試驗(yàn)

圖1 氨基酸PCA分析

圖2 氨基酸CCA分析

限制性氨基酸是指飼料中所含必需氨基酸的量與動(dòng)物需要量相比相差較大的氨基酸，Lys是豬日糧中的第一限制性氨基酸，也是一些反芻動(dòng)物的第二限制性氨基酸，在飼料中添加適量的Lys可以提高飼料中粗蛋白的利用，而幾乎全部的Lys都可以用于合成機(jī)體蛋白質(zhì)，不會(huì)產(chǎn)生具有生物學(xué)意義的次級(jí)代謝產(chǎn)物。但也有研究表明，添加超過4%含量的Lys，會(huì)影響豬的采食、抑制Arg的吸收和合成，不利于豬的生長(zhǎng)與生產(chǎn)，因此應(yīng)添加適量Lys。依據(jù)CCA分析可知，通過調(diào)節(jié)接種量和pH值的大小，可以改變Lys的含量。條件性必需氨基酸是指在動(dòng)物生長(zhǎng)的某一階段或生理狀態(tài)下，動(dòng)物自身合成不能滿足需要，必須由飼料提供的氨基酸，有文獻(xiàn)報(bào)道Arg是高產(chǎn)母豬和斷奶仔豬的條件性必須氨基酸，而Gly則是家禽的條件性必需氨基酸。綜上所述，可根據(jù)動(dòng)物對(duì)氨基酸的不同需求，調(diào)節(jié)發(fā)酵參數(shù)，選取最佳發(fā)酵條件。

由于本實(shí)驗(yàn)旨在研究玉米DDGS發(fā)酵前、后氨基酸含量變化，故依據(jù)圖2篩選出受發(fā)酵參數(shù)影響較大的代表性氨基酸，如Gly、Val、Lys、Arg、Ser作為篩選發(fā)酵參數(shù)的依據(jù)，通過對(duì)比發(fā)酵前后氨基酸含量變化，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，選出相對(duì)發(fā)酵前氨基酸含量差異較大的一組，即第9組，作為本試驗(yàn)的最佳發(fā)酵條件。發(fā)酵前后各氨基酸占總氨酸含量對(duì)比見表4，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前、后Lys、Ser、Gly和Val的含量均有顯著差異（P＜0.05），說(shuō)明經(jīng)過發(fā)酵后，玉米DDGS中Lys、Ser、Gly和Val的含量均有顯著提高（見表4）。

表4 發(fā)酵前、后玉米DDGS17種氨基酸占各組總氨酸比例

Lys和Met是豬生長(zhǎng)的第一、第二限制性氨基酸，而通過表4可以看出，發(fā)酵后Lys占總氨酸的比例增高0.48%，而Met占總氨酸的比例降低了0.28%，對(duì)比發(fā)酵前后Met絕對(duì)含量減少了0.03%（見表5），說(shuō)明發(fā)酵后，在Lys明顯升高的基礎(chǔ)上，Met含量減少量較小，同時(shí)也說(shuō)明本發(fā)酵改善了玉米DDGS的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，本試驗(yàn)會(huì)對(duì)玉米DDGS的發(fā)酵做進(jìn)一步的研究。

表5 發(fā)酵前、后玉米DDGS中限制性氨基酸含量絕對(duì)值

3 結(jié)語(yǔ)

本研究采用枯草芽胞桿菌發(fā)酵玉米DDGS，利用日立公司L-8900氨基酸分析儀分析發(fā)酵前、不同發(fā)酵條件后玉米DDGS中氨基酸含量的變化，確定本試驗(yàn)最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)：pH=9，接種量3 ml，溫度為25 ℃，發(fā)酵時(shí)間48 h；分析發(fā)現(xiàn)氨基酸含量受pH值、接種量影響較大，各別氨基酸如Lys、Ser與接種量呈正相關(guān)關(guān)系，且發(fā)酵后一些動(dòng)物限制性氨基酸，如Lys、Ser等占總氨酸的比例顯著增高（P＜0.05）。本試驗(yàn)同時(shí)也為今后進(jìn)一步研究發(fā)酵前與發(fā)酵后玉米DDGS中氨基酸、脂肪酸等小分子物質(zhì)的變化提供理論依據(jù)。