抗菌材料生物學性能的檢測方法

徐啟明 周晟博 綜述 冒海蕾 王斌 審校

抗菌材料生物學性能的檢測方法

徐啟明 周晟博 綜述 冒海蕾 王斌 審校

抗菌材料可分無機、有機天然和有機合成三種類型，需通過抗菌性能、生物相容性及材料性能等的一系列生物學性能檢測。本文就抗菌材料的生物學性能檢測方法進行綜述。

抗菌材料 抗菌性 生物相容性 材料性能

1 抗菌材料的分類

抗菌材料是具有殺菌、抑菌作用的功能材料，可分為無機、有機天然和有機合成三種類型。

1.1 無機抗菌材料

無機抗菌材料具有安全性高、耐熱性好、無揮發(fā)、不產生耐藥性的特點[1]，分為金屬離子型和光催化型。

金屬離子型抗菌材料是將具有抗菌性能的銀、銅、鋅等金屬離子，通過物理吸附、離子交換等方法固定到沸石等載體上，其中以銀離子的抗菌性最強[2]，10-6即可殺滅細菌。商品化的無機抗菌材料多為銀系，但價格昂貴，加工和使用時易著色、變色。

光催化型無機抗菌材料是指N型半導體金屬氧化物，如TiO2、ZnO、SiO2等。其中，TiO2的氧化活性較高，穩(wěn)定性強，對人體無害，具有優(yōu)良的廣譜抗菌效能[3]，但加工困難，再現性差，必須在光照條件下才有效，抗菌效果的評價也較困難[3]。

1.2 有機天然抗菌材料

有機天然抗菌材料以殼聚糖為典型代表，殼聚糖是一種價廉的天然高分子，具有廣譜抗菌性，對人體無毒、無刺激[4]。通過羧甲基化改性殼聚糖形成的羧甲基殼聚糖生物相容性更好[5]，其抗菌性能受pH值、相對分子質量和脫乙酰度的影響，一般在pH值5.5～6.5、相對分子質量10 000～100 000時抗菌性能強，超出此范圍或脫乙酰程度增加，其抗菌效果就不穩(wěn)定，耐熱性也變差[4，6]。

1.3 有機合成抗菌材料

有機合成抗菌材料分為低分子與高分子兩類，后者是在前者的基礎上高分子化形成。有機高分子抗菌材料的抗菌效果優(yōu)于有機低分子抗菌材料，且毒性較低。

有機高分子抗菌材料具有兩親性及陽離子型的特征[7-9]，溶于水、發(fā)生電離可產生帶正電荷的親水基團，發(fā)揮抗菌性能，故又稱陽離子型抗菌材料。該類材料主要通過靜電吸引發(fā)揮抗菌效果，而人體細胞表面所帶負電荷很低，與陽離子型抗菌材料的靜電吸引作用很小，故此類材料對細菌的殺傷作用具有選擇性，生物相容性好。根據親水抗菌基團的不同，目前研究主要集中于季銨鹽類、季磷鹽類、吡啶鹽類以及咪唑鹽類等。

2 抗菌材料生物學性能檢測

理想的抗菌材料應具有高效、廣譜、持久的抗菌性能，良好的生物相容性，且易于合成。研發(fā)抗菌材料需通過抗菌性能、生物相容性、材料性能等的一系列生物學性能檢測。

2.1 抗菌性能檢測

通常根據材料的性質、用途，選擇細菌種類及接觸方法，并使材料與細菌接觸一定時間后測定抗菌性能。通常選用國際公認的標準菌株，如大腸桿菌[10]、金黃色葡萄球菌[10]、白色念珠菌[11-12]等。接觸方式有薄膜密封法、滴下法、晃動法/燒瓶振蕩法、紙片擴散法等。

2.1.1 平板菌落計數及OD值測試

將一定量與材料作用后的菌液接種到含培養(yǎng)基的平板上，一定溫度下進行培養(yǎng)，形成肉眼可見的菌落，一個菌落代表一個細菌，統計實驗樣品（B）和陰性對照樣品（A）的平均菌落數，計算抑菌率(%)=(A-B)/A×100%。該法能直觀地統計細菌數量，即使細菌很少也可測出；但是，當細菌的菌落排列過密、融合時，會影響計數準確性，產生較大的誤差。

由于菌體的散射及吸收作用，不同濃度的細菌懸液，光密度不同，一定范圍內，細菌懸液濃度與光密度呈正比，通過酶標儀測定細菌懸液OD600值，計算抑菌率(%)=(陽性對照值-實驗值)/(陽性對照值-陰性對照值)×100%。抑菌率≥50% ～90%，材料有抑菌作用；≥90%，則抑菌作用較強[2]。

2.1.2 細菌染色計數法

LIVE/DEAD細菌染色計數法可了解抗菌材料是否有殺菌作用，該法運用SYTO9與PI（碘化丙啶）兩種熒光染料。SYTO9可穿過完整細菌的細胞壁，與DNA結合，在510 nm處顯示綠色熒光的活菌；而PI只沉積在不完整的細菌細胞壁中，在630 nm處顯示紅色熒光的死菌，從而區(qū)分LIVE/ DEAD細菌，統計相應細菌數量[13]。

2.1.3 抑菌圈法

抗菌材料通過擴散，在紙片周圍形成濃度梯度，使細菌生長受到抑制，形成透明的抑菌圈；抑菌圈越大，抑菌效果越顯著[14-15]。但該法只適用于測試可溶性材料且生長快速的細菌，同時受接種細菌的含量與分布、紙片的質量和紙片含抗菌材料的均勻性等因素的影響。

2.1.4 最低抑菌濃度檢測

最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）指可抑制某種微生物出現明顯增長的有效濃度。MIC法主要用于檢測可溶性的抗菌材料，常用方法包括：常量/微量肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法等[14，16]?？咕牧辖浱荻认♂屌c定量細菌混合培養(yǎng)后，通過測定OD600nm、平板菌落計數及抑菌圈法，尋找低于對照組50%以上的材料濃度，即為MIC。

2.1.5 細菌表面Zeta電位

細菌細胞壁磷壁酸、革蘭染色陰性菌外膜中的脂多糖均帶有負電荷，這層負離子與溶劑之間的界面形成流體剪切面，Zeta電位即為該界面的電位[17]。Zeta電位是一個表征分散體系穩(wěn)定性的重要指標，其絕對值的大小與細菌細胞結構的穩(wěn)定性呈正比[18]。測定細菌表面Zeta電位的變化，可證實材料是否降低細菌細胞結構的穩(wěn)定性，發(fā)揮抗菌作用。

Zhu等[19]將合成的陽離子型抗菌材料與細菌作用后，發(fā)現大腸桿菌表面Zeta電位由正常的 （-21.0±0.9）mV降為-（4.8±0.2）mV?？梢?，該材料溶于水發(fā)生電離，帶正電荷的親水基團與細菌帶負電荷的磷壁酸或脂多糖之間產生靜電吸引作用；抗菌材料中正電荷轉移，使細菌表面所帶負電荷減少，Zeta電位絕對值變小。

2.1.6 過氧化作用檢測

DCFH-DA（2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽）法是傳統組織活性氧熒光定量測定方法，也可測定細菌細胞內ROS水平。無熒光的DCFH-DA可自由穿過細菌細胞壁及細胞膜進入細菌內，脫去乙?；蔁o熒光的DCFH；DCFH與細菌細胞內ROS反應，產生有熒光的DCF，檢測DCF熒光強度可以評測細菌細胞內ROS水平。

另外，ADPA[9,10-蒽基-雙(亞甲基)二丙二酸]法可特異性地檢測ROS中的1O2。ADPA可選擇性與1O2結合，并迅速生成相應的內氧化物，通過測定ADPA在355 nm處吸光度的減少量，即可反映細菌細胞內1O2的含量。這些方法也有助于闡明材料的抗菌機制。

2.2 生物相容性測試

生物相容性是指生物材料與生物體之間相互作用產生的結果，以及機體對此結果的忍受程度?？咕牧媳仨毻ㄟ^一系列生物相容性檢測，才可能應用于人體。醫(yī)用材料要求材料的化學性質為惰性，不與人體組織、血液、免疫等系統產生不良反應[20-21]。生物相容性測試分兩步：先通過體外測試，如細胞毒性、溶血實驗等；再根據其性質、用途，進行實驗動物的體內測試，包括植入后局部反應、刺激性、致敏性、全身毒性、遺傳毒性和致癌性檢測等[21]。

2.2.1 細胞毒檢測

細胞毒性實驗是通過體外細胞培養(yǎng)，檢測接觸材料后的細胞是否發(fā)生生長抑制、功能改變、溶解、死亡等生物學反應，以評價材料潛在的細胞毒性，預測體內組織細胞反應。細胞毒性是最重要的生物學性能評價指標之一，直接接觸或植入人體的材料都需進行細胞毒性測試。

國家衛(wèi)生部/國際標準化組織標準 （GB/T 16886.5-2003/ ISO 10993-5∶1999）推薦三類細胞毒性實驗：浸提液法、直接接觸法及間接接觸法（包括瓊脂覆蓋法、分子濾過法），推薦使用ATCC CCL1（NCTC clone 929、小鼠成纖維細胞）或ATCC CCL2（Hela細胞、人上皮細胞）標準細胞株進行毒性測試。目前，除了經典MTT法，還出現了簡便、快速的改良方法，如CCK-8法、MTS法等。

MTT法：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為不溶性的藍紫色甲瓚結晶，并沉積在細胞中，DMSO（二甲基亞砜）能溶解甲瓚，通過測試溶解產物OD490nm，反映活細胞的數量[22]。

CCK-8法：WST-8[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽]被線粒體內脫氫酶直接還原生成高度水溶的橙黃色甲瓚產物，省去了溶解步驟，通過測試OD450nm，反映活細胞的數量[23]。該法線性范圍更寬，靈敏度更高，毒性更小，重復性優(yōu)于MTT法，已廣泛用于細胞毒性的檢測。

運用MTT法或CCK-8法測得OD值后，可計算細胞生長增殖率，RGR(%)=(實驗值/對照值)×100%。根據RGR分五級：99%以上為0級；75%～99%為1級；50%～74%為2級；25%～49%為3級；1%～24%為4級；1%以下為5級。0級或1級表示材料毒性低；2級則應結合細胞形態(tài)做綜合分析；3～5級表示材料毒性大[24]。抗菌材料對細胞的毒性作用最先表現為細胞膜的變化，因此細胞膜完整性測定也是細胞毒性檢測的方法之一[21]。將與抗菌材料接觸后的生物細胞與FDA（乙酰乙酸熒光素）及PI（碘化丙啶）進行共培養(yǎng)，FDA可穿過完整生物細胞膜，并被細胞內酯酶轉化為熒光素，在520 nm處顯示胞內綠色熒光；而PI不能穿過完整的生物細胞膜，但在生物細胞膜破壞的情況下，PI可進入生物細胞內，并嵌入雙鏈DNA與之緊密結合，在630 nm處顯示胞內紅色熒光。

2.2.2 溶血實驗

溶血實驗用來檢測紅細胞是否破裂[25]。肉眼觀察結果判斷分為4種：完全溶血（溶液澄明紅色，管底無紅細胞殘留）、部分溶血（溶液呈明紅或棕色，管底少量紅細胞殘留）、無溶血（溶液無色透明，紅細胞全部下沉）、不溶血（管底紅細胞凝集，且振搖后不能分散）。對于醫(yī)用注射制劑，要求3 h內不出現溶血和凝集反應；如0.5 h出現完全/部分溶血或凝集反應，則不能靜脈內使用。

定量檢測可通過測定溶液的吸光度值，計算溶血率。溶血實驗的陽性對照可選用紅細胞懸液加等體積蒸餾水，以造成低滲性溶血；也可選擇破壞紅細胞膜的溶液，如2%的Triton X-100，能去除紅細胞膜上的蛋白質，在較短時間內破壞紅細胞。陰性對照則將紅細胞放入生理鹽水中，維持紅細胞所需的等滲環(huán)境。實驗組則在紅細胞懸液中加入抗菌材料，接觸一定時間后，離心取上清，測定 OD 545 nm[26]或者OD 576 nm[27]，計算溶血率(%)=(實驗值-陰性對照值)/(陽性對照值-陰性對照值)×100%。非直接接觸的生物醫(yī)藥材料要求溶血率≤5%[25]。

2.2.3 植入實驗

植入實驗將材料置于動物體內一定部位，如皮下[28]、骨[29]、腹腔[30]和結膜囊[31]等，一段時期后觀察局部以及全身的變化，評價材料生物相容性和安全性。通過組織切片可觀察局部組織有無增生、炎癥反應[31]；通過比較體重、進食、排泄、活動、呼吸、肝腎功能、存活等變化，觀察有無全身毒性反應[30]；通過流式細胞熒光分選技術分析淋巴細胞亞群的比例變化，觀察抗菌材料對機體免疫系統的毒性[32]。

對長期植入體內的抗菌材料，還需進行遺傳毒性、致癌性及生殖毒性檢測。從對DNA的影響、基因突變和染色體畸變三方面可反映材料遺傳毒性；通過腫瘤的數量、大小、類型、發(fā)生部位和時間，判斷材料致癌性。對于直接接觸生殖系統的材料，則需進行生殖毒性檢測。可通過DNA、RNA、蛋白質檢測反映基因復制、轉錄及翻譯的情況，尤其是針對一些抑癌基因及促癌基因[21]。

2.3 材料物理性能測試

抗菌材料的研制要以提高抗菌效果和生物相容性為主要目標，同時改善材料物理性能。材料性能包括抗污能力、吸濕性、穩(wěn)定性等，且直接決定抗菌效果、抗菌持續(xù)時間及對機體的影響，這需要在材料結構的設計、載體的選擇等研制階段進行優(yōu)化。

2.3.1 抗污能力（抗蛋白質黏附）

生物體內富含蛋白，材料表面非特異性吸附蛋白會造成體內細胞進一步吸附、鋪展、增殖甚至死亡；與血液接觸則可引起凝血、血栓等。理想的抗菌材料應具備良好的抗污能力。將材料置于牛血清白蛋白溶液中，取出后清洗，加入十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液，SDS的磺酸根可與蛋白質的氨基結合形成強勁的離子鍵，從而將吸附于材料表面的蛋白質溶出，便可對材料吸附的蛋白質進行定量觀察[27]。

2.3.2 材料吸濕性能

創(chuàng)面愈合需要一定的濕度，但濕度過高又易引起細菌的滋生，故抗菌敷料應具備合適的吸濕性?？筛鶕挝毁|量/面積，計算材料的吸濕率，評價材料的吸濕性[30]。

2.3.3 材料的穩(wěn)定性

重金屬離子的存在、固定載體的差別以及抗菌離子電荷的分布，均可影響陽離子型抗菌材料的穩(wěn)定性[31，33]。

新型抗菌材料的開發(fā)將有助于解決臨床愈加嚴重的細菌耐藥問題，具有廣闊的應用前景。通過抗菌性能、生物相容性及材料物理性能的綜合測試，將為其產業(yè)化推廣及臨床應用奠定堅實基礎。

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Testing Methods for the Biological Performance of Antibacterial Materials

XU Qiming1,ZHOU Shengbo2,MAO Hailei2,WANG Bin1.1 Departments of Anesthesiology and Critical Care Medicine,Zhongshan Hospital,Fudan University, Shanghai 200032,China;2 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:MAO Hailei (E-mail:mao. hailei@zs-hospital.sh.cn);WANG Bin(E-mail:wangbin1766@163.com).

【Summary】 Antibacterial materials can be divided into three categories,inorganic,natural organic and synthetic organic. A series of biological performance testing are required for the new antibacterial materials,including antibacterial activity, biocompatibility and material properties.In this paper,the testing methods for their biological performance were reviewed.

Antibacterial materials; Antibacterial activity; Biocompatibility; Material properties

R318.08

B

1673－0364（2015）06－0386－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.06.011

2015年6月23日；

2015年8月27日）

國家自然科學基金（81101404，81271725）。

200032 上海市 復旦大學附屬中山醫(yī)院麻醉重癥醫(yī)學科（徐啟明，冒海蕾）；200011 上海市 上海交通大學附屬第九人民醫(yī)院整復外科（周晟博，王斌）。

冒海蕾（E-mail：mao.hailei@zs-hospital.sh.cn）；王斌（E-mail：wangbin1766@163.com）。