骨膜來(lái)源細(xì)胞在骨組織工程應(yīng)用中的研究進(jìn)展

李 婧

綜 述

骨膜來(lái)源細(xì)胞在骨組織工程應(yīng)用中的研究進(jìn)展

李 婧

骨膜來(lái)源細(xì)胞； 骨組織工程； 成骨作用； 血管形成； 擬生態(tài)骨膜

創(chuàng)傷、骨變性疾病、腫瘤等導(dǎo)致骨組織的損傷是矯形外科面臨的主要難題。自體骨、異體骨和基于可降解生物材料的人工骨，是近幾十年來(lái)治療骨缺損的主要方法。但存在各自的缺點(diǎn)和局限性，包括自體骨來(lái)源有限和供體區(qū)存在壞死風(fēng)險(xiǎn)，異體骨存在潛在感染性和免疫原性及人工骨替代物缺乏成骨潛力等。目前，自體骨移植仍是治療不愈合骨缺損的金標(biāo)準(zhǔn)，而骨組織工程(bone tissue engineering)作為替代方法正成為研究熱點(diǎn)。該方法所需自體組織量少，侵襲性小，比傳統(tǒng)方法更安全。骨組織工程主要目的是將種子細(xì)胞接種在可降解生物載體上，修復(fù)受損或不健全的骨組織，并尋找克服自體組織移植缺陷的方法，種子細(xì)胞的選擇和功能改進(jìn)是其中重要方面[1-3]。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是組織工程應(yīng)用最多的種子細(xì)胞，具有高度自我更新和分化成不同細(xì)胞系的能力，來(lái)源廣泛。但不同來(lái)源的MSCs存在表型異質(zhì)性，尤其是移植后在移植區(qū)域產(chǎn)生不同體內(nèi)結(jié)果和/或特異功能，因此，正確選擇MSCs來(lái)源對(duì)受損組織再生得到更有效治療十分重要[4]。骨髓來(lái)源MSCs是研究骨組織工程常用細(xì)胞，但從骨髓中分離MSCs存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)和難度。近年來(lái)，從骨膜組織中分離培養(yǎng)骨膜來(lái)源細(xì)胞(periosteum derived cells, PDCs)用于骨組織工程正逐漸興起[5-7]。臨床實(shí)踐表明，骨膜損傷將延遲骨愈合或?qū)е虏挥?，原因在于骨膜中存在大量具有MSCs表型特征的細(xì)胞群，其增殖分化潛力與骨髓來(lái)源MSCs相當(dāng)或更佳，在骨損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用[8]。許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也已證明了PDCs具有修復(fù)骨缺損的能力[2,9-12]。從解剖學(xué)角度，骨膜與骨形成和修復(fù)更近，可能是更相關(guān)的細(xì)胞來(lái)源；從臨床應(yīng)用角度，小塊骨膜組織中獲取PDCs侵襲性更小，更安全。因此，以PDCs作為種子細(xì)胞修復(fù)骨缺損將是更佳策略。筆者現(xiàn)就近年來(lái)PDCs在骨組織工程中的應(yīng)用研究進(jìn)行綜述。

1 骨膜及骨膜來(lái)源細(xì)胞分離培養(yǎng)

骨膜是被覆在除關(guān)節(jié)以外的骨表面上堅(jiān)固的含有微血管的結(jié)締組織包膜，由外部的纖維層(fibrous layer)和內(nèi)部的形成層(cambium layer)組成。纖維層主要由具有高度組織性和方向性的膠原纖維組成，富含血管、神經(jīng)，有營(yíng)養(yǎng)和感覺(jué)作用，沿縱向隨著骨生長(zhǎng)擴(kuò)展；形成層較薄，是MSCs、成骨細(xì)胞(osteoblasts)、成纖維細(xì)胞(fibroblasts)和周皮細(xì)胞(pericytes)等的聚集地，在骨生長(zhǎng)過(guò)程中沿著逐漸增加骨周長(zhǎng)和長(zhǎng)度的方向擴(kuò)展。骨膜通過(guò)Sharpey氏纖維牢固地錨定在位于其下部的骨上。應(yīng)用專業(yè)手術(shù)器械可以較容易地從手術(shù)部位獲得骨膜組織，例如在關(guān)節(jié)置換術(shù)中從股骨頭中獲得骨膜組織[13]。但應(yīng)注意的是，不同部位來(lái)源的骨膜成骨能力存在差異[14]，例如脛骨骨膜比顱蓋骨骨膜成骨能力更強(qiáng)[15]。新鮮的骨膜組織經(jīng)液氮凍存2年后仍可用于分離PDCs，方便儲(chǔ)存?zhèn)溆肹16]。

目前，從骨膜中分離培養(yǎng)PDCs，主要有組織塊培養(yǎng)法和酶消化法。組織塊培養(yǎng)法是一種簡(jiǎn)便易行且成功率較高的原代培養(yǎng)方法，優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞從天然環(huán)境中遷出，能保證細(xì)胞的生理狀態(tài)，避免PDCs受到外界因素的影響。缺點(diǎn)是耗時(shí)較長(zhǎng)，且反復(fù)剪切和接種過(guò)程可能會(huì)對(duì)組織造成損傷，不能保證每個(gè)組織塊都能長(zhǎng)出細(xì)胞。酶消化法使用膠原酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶等，將妨礙細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞間質(zhì)去除，使細(xì)胞分散，形成懸液，易于從外界吸收養(yǎng)分和排出代謝產(chǎn)物，可以短時(shí)間內(nèi)得到大量活細(xì)胞并生長(zhǎng)成片。但步驟繁瑣，易污染，同時(shí)消化酶對(duì)細(xì)胞有一定損傷作用，需要摸索消化條件，且消化酶價(jià)格昂貴，實(shí)驗(yàn)成本高。盡管兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但是方法學(xué)的差異不會(huì)影響所分離的PDCs的增殖能力和多能性，除了在細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)上有些許差異[17]。

成功的器官組織工程，不能缺少支持細(xì)胞增殖和分化的適宜培養(yǎng)條件。培養(yǎng)基成分會(huì)影響細(xì)胞增殖和存活，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。文獻(xiàn)報(bào)道，高糖或低糖DMEM、RPMI1640、DMEM/F12、α-MEM都可以用于PDCs的體外培養(yǎng)，但使用最多的當(dāng)屬α-MEM培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基特點(diǎn)是容易使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，若適當(dāng)添加某些營(yíng)養(yǎng)成分，如加入谷氨酰胺或用D-纈氨酸代替L-纈氨酸，可以改善不同物種PDCs的生長(zhǎng)狀況[16,18-19]。胎牛血清是細(xì)胞體外培養(yǎng)的必要成分，但將PDCs應(yīng)用于轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)時(shí)，還要考慮動(dòng)物血清替代物問(wèn)題，既要保留PDCs表型特征，又要減少免疫原性[15,20]。

常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)多為二維培養(yǎng)系統(tǒng)，對(duì)于具有自我更新和分化能力的MSCs來(lái)說(shuō)細(xì)胞增殖可獲得的表面積有限，且在長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中存在失去分化能力的可能性。利用三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可以改善這種狀況。有研究顯示，PDCs在旋轉(zhuǎn)式三維培養(yǎng)平臺(tái)中的擴(kuò)增成球形，并保持存活性和增殖能力，標(biāo)志性基因和蛋白的表達(dá)水平要高于二維培養(yǎng)，這對(duì)于提高PDCs的臨床應(yīng)用潛力大有裨益[21]。

2 骨膜來(lái)源細(xì)胞體外培養(yǎng)特點(diǎn)

骨膜中含有多種細(xì)胞類型，具有自我更新能力。在機(jī)械和生化等各種局部因素作用下分化產(chǎn)生成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，參與軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨[22-23]。體外培養(yǎng)的PDCs在不同誘導(dǎo)介質(zhì)存在下，能向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和成脂肪細(xì)胞分化，并且具備體內(nèi)成骨潛力。這歸因于PDCs中包含功能不同的祖細(xì)胞或多能性的原始干細(xì)胞，當(dāng)受到周圍組織或結(jié)構(gòu)信號(hào)刺激后可以被活化。多能性可能是儲(chǔ)存在成人骨膜中通常處于靜息狀態(tài)的細(xì)胞固有特性。正如胚胎期軟骨膜(骨化后稱為骨膜)為發(fā)育中骨骼的生長(zhǎng)提供多能性細(xì)胞一樣，成人骨膜中也存在未分化的多能MSCs，參與骨生理性生長(zhǎng)和重塑。這為基于細(xì)胞的組織工程技術(shù)提供了豐富的細(xì)胞來(lái)源[19,24-25]。

體外培養(yǎng)的PDCs光鏡下多數(shù)呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣形態(tài)特點(diǎn)，與MSCs類似，但不同物種來(lái)源的PDCs形態(tài)有所差異。PDCs具備MSCs的特征，應(yīng)用MSCs表面標(biāo)志物可以鑒定和分選PDCs[24]。在骨組織工程中，可以從骨膜中分選出較純的MSCs，也可以直接用從骨膜組織分離培養(yǎng)的混合細(xì)胞群進(jìn)行修復(fù)骨缺損。Arnsdorf等[25]證明，PDCs的異質(zhì)性群體與NIH3T3成纖維細(xì)胞以相似的潛力表達(dá)成骨細(xì)胞樣和脂肪細(xì)胞樣標(biāo)志物，從而認(rèn)為骨膜內(nèi)成纖維細(xì)胞可能也具有祖細(xì)胞樣潛力，在組織多系分化中發(fā)揮作用；體外培養(yǎng)擴(kuò)增的原代PDCs可以作為組織工程應(yīng)用來(lái)源，不需要廣泛的富集或分子標(biāo)志分選。筆者認(rèn)同此觀點(diǎn)，因?yàn)镻DCs存在異質(zhì)性，目前尚不清楚骨形成、血管生成、招募成骨細(xì)胞、支持血管這些功能是由單一細(xì)胞類型完成，還是由特定亞群協(xié)同完成。PDCs應(yīng)是一個(gè)有機(jī)整體，其中的各種組分可能相互協(xié)調(diào)，相互促進(jìn)，細(xì)胞分選可能會(huì)遠(yuǎn)離骨膜組織本身在骨再生和修復(fù)中的天然作用。

種子細(xì)胞體外擴(kuò)增能力是臨床應(yīng)用時(shí)必須考慮的一個(gè)重要問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)證明，PDCs在體外培養(yǎng)條件下保持快速增殖能力，沒(méi)有接觸抑制現(xiàn)象，能連續(xù)傳數(shù)代仍保留分化潛能。PDCs增殖速度顯著快于骨髓MSCs，在未來(lái)應(yīng)用中可以縮短培養(yǎng)周期，降低消耗和污染的可能性。PDCs具有長(zhǎng)的端粒，傳代30代后也不會(huì)出現(xiàn)衰老現(xiàn)象。從老年患者分離的PDCs，仍具有高增殖潛力和分化能力。相反，骨髓MSCs隨供體年齡增加，壽命縮短，呈現(xiàn)端?？s短和衰老現(xiàn)象，且骨髓MSCs數(shù)量和分化潛力也隨年齡降低。由于相當(dāng)多老年患者需要矯形外科手術(shù)，因此，PDCs的增殖特點(diǎn)，使其在再生治療的潛力更大。

3 生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)骨膜來(lái)源細(xì)胞分化能力

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMPs)是一組多功能生長(zhǎng)因子，在骨骼發(fā)育、修復(fù)和再生的早期階段，招募局部祖細(xì)胞進(jìn)入骨膜和內(nèi)膜并決定其分化方向，參與所有物種的骨和軟骨發(fā)育。獨(dú)特的骨再生能力使其成為用于骨組織修復(fù)和再生的誘導(dǎo)因子。Wang等[26]證明，在愈合初期刪除BMP-2基因?qū)?dǎo)致骨膜介導(dǎo)的骨痂形成消失，說(shuō)明內(nèi)源性表達(dá)的BMP-2對(duì)修復(fù)過(guò)程中PDCs的成骨和成軟骨分化相當(dāng)重要；而外源導(dǎo)入的BMP-2能以劑量依賴方式增強(qiáng)PDCs的成骨分化能力。

利用基因工程技術(shù)遺傳修飾PDCs，外源性導(dǎo)入生長(zhǎng)因子是改進(jìn)其功能的重要方法。Sun等[2]利用復(fù)制缺陷型腺病毒轉(zhuǎn)運(yùn)BMP-2對(duì)來(lái)自兔的PDCs進(jìn)行遺傳修飾，并用于修復(fù)兔下頜骨缺損。結(jié)果表明，PDCs是基因轉(zhuǎn)運(yùn)的優(yōu)秀靶細(xì)胞，易被腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)?；蛐揎椇蟮腜DCs不僅保持較高的增殖能力，而且處于更強(qiáng)的分化狀態(tài)。此外，基因修飾的PDCs能通過(guò)分泌生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)其他未分化干細(xì)胞或受體部位細(xì)胞分化和骨形成。Samee等[27]聯(lián)合轉(zhuǎn)染BMP-2和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelium growth factor, VEGF)，增強(qiáng)了PDCs成骨分化和骨形成能力。其原因之一是骨形成需要內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞的協(xié)同作用，這一過(guò)程被多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子介導(dǎo)。BMPs與血管生成相關(guān)生長(zhǎng)因子協(xié)同作用能進(jìn)一步刺激骨形成[28-29]。研究表明，PDCs能表達(dá)VEGF及其受體，VEGF可以作為一種自分泌生長(zhǎng)因子，用于PDCs的成骨分化。PDCs上的VEGF受體與血管形成無(wú)關(guān)，只促進(jìn)成骨作用[4,30-31]。

此外，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor, PDGF)能在骨再生的早期階段，增強(qiáng)PDCs的分裂增殖活性，從而增加分裂期PDCs的數(shù)量[32]。激活PDCs中Hedgehog (Hh) 信號(hào)通路，可以通過(guò)增強(qiáng)供體細(xì)胞的存活、分化和新生血管化改進(jìn)骨缺損的重建[33]。

4 骨膜來(lái)源細(xì)胞具有致血管生成潛力

血管生成(vascularization)在骨發(fā)育和骨折修復(fù)中有重要作用。臨床實(shí)踐表明，缺乏活細(xì)胞的異體移植物與宿主骨的整合(osseointegration)緩慢而有限。移植部位血管系統(tǒng)的血液供應(yīng)對(duì)維持成骨細(xì)胞的存活并促進(jìn)移植物愈合和融入是必要的。有研究顯示，在皮下骨移植模型中新鮮異體移植物比凍存異體移植物對(duì)來(lái)自宿主的血管形成應(yīng)答大5～10倍，證明了血管生成和成骨之間的相互作用在骨再生和修復(fù)中的重要性。骨膜是高度血管化組織，能為骨和骨骼肌提供血液供應(yīng)，其中的PDCs必定在血管生成中扮演重要角色。van Gastel等[34]首次描述了小鼠PDCs的致血管生成性質(zhì)。當(dāng)接種有PDCs的磷酸鈣支架植入小鼠皮下后，PDCs能顯著吸引新生血管進(jìn)入支架材料。而且，PDCs與內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合接種時(shí)，在體內(nèi)形成的新生血管數(shù)要高于每種細(xì)胞單獨(dú)接種形成的血管數(shù)量。表明PDCs的存在增強(qiáng)了宿主的血管形成應(yīng)答：一方面，PDCs能表達(dá)并分泌血管生長(zhǎng)因子VEGF，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和存活[30]；另一方面，PDCs可以通過(guò)與內(nèi)皮細(xì)胞形成血管網(wǎng)絡(luò)，獲得周皮細(xì)胞樣表型，從而在結(jié)構(gòu)上促進(jìn)新生血管化。這也為組織工程構(gòu)建血管化人工骨提供一種新思路。骨組織工程選擇的細(xì)胞來(lái)源不僅要考慮成骨性質(zhì)，而且也要關(guān)注致血管生成潛力，因此，PDCs的優(yōu)勢(shì)特征使其成為骨再生治療的理想細(xì)胞來(lái)源。

5 基于骨膜來(lái)源細(xì)胞構(gòu)建擬生態(tài)骨膜

臨床實(shí)踐已證明，保留骨膜的完整性能顯著提高骨移植物的融合和重塑。基于當(dāng)前干細(xì)胞生物學(xué)、基因治療和生物材料裝配方面的研究進(jìn)展，有學(xué)者提出應(yīng)用組織工程原理，制備模擬天然骨膜結(jié)構(gòu)和功能的骨膜替代物，覆蓋并活化任何大小或形狀的異體骨或骨替代物，增強(qiáng)其骨修復(fù)和再生能力。人們已開(kāi)始嘗試構(gòu)建這種基于細(xì)胞的擬生態(tài)骨膜(biomimetic periosteum)，來(lái)彌補(bǔ)骨組織工程修復(fù)骨缺損中骨膜缺失的不足。

了解細(xì)胞自我組裝和表型調(diào)節(jié)的機(jī)制是模擬天然組織從頭合成的基礎(chǔ)。Evans等[35]利用固體支持脂雙層(solid supported lipid bilayer, SLB)膜系統(tǒng)，從細(xì)胞之間的連接作用角度闡述了人PDCs引導(dǎo)組織形成(de novo tissue generation)的機(jī)制他們用重組的細(xì)胞黏附蛋白N-cadherin使SLB功能化后，高密度接種PDCs后，與接種在玻璃片上的PDCs進(jìn)行瞬時(shí)表型和基因型差異比較。結(jié)果顯示，N-cadherin功能化的SLB促進(jìn)PDCs聚集，但不伴隨PDCs中N-cadherin轉(zhuǎn)錄水平顯著改變。相反，接種在非功能化SLB上的細(xì)胞不貼壁，但PDCs中N-cadherin轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)。MSCs聚集是骨形成關(guān)鍵步驟。N-cadherin是MSCs聚集的標(biāo)志，敲除N-cadherin將擾亂MSCs聚集和軟骨形成。本研究表明，PDCs表達(dá)N-cadherin，為軟骨內(nèi)和膜內(nèi)成骨提供分子基礎(chǔ)，因此,在構(gòu)建擬生態(tài)骨膜時(shí)首先要考慮細(xì)胞外基質(zhì)在PDCs成骨分化中的作用。

失活的異體移植物是目前修復(fù)大段骨缺損廣泛使用的材料，但存在較高的移植后10年骨折發(fā)生率。異體移植物愈合比自體移植物差，部分歸因于缺乏骨膜調(diào)控的重塑。Hoffman和Benoit[36]提出,用含有可調(diào)節(jié)且可降解的聚乙二醇水凝膠制備組織工程化“擬生態(tài)骨膜”覆蓋異體移植物，從而使其更適于細(xì)胞接種，更好地模擬自體移植物愈合期間細(xì)胞密度和持久性。通過(guò)顯微CT、力學(xué)實(shí)驗(yàn)和組織學(xué)分析，證明了這種組織工程化骨膜替代物能使小鼠股骨缺損的愈合效果更佳。此外，還可從細(xì)胞密度、水凝膠組成和遺傳修飾等方面改進(jìn)組織工程化骨膜的特性，啟動(dòng)種子細(xì)胞和/或宿主-材料之間的相互作用，進(jìn)一步改進(jìn)異體移植物修復(fù)效果，減少或消除與異體移植物失敗相關(guān)的修復(fù)手術(shù)。

總之，骨膜組織相對(duì)容易獲得，PDCs能進(jìn)行體外分離培養(yǎng)，并保持比骨髓MSCs更快的增殖能力，具備MSCs表型特征，在適當(dāng)?shù)捏w外誘導(dǎo)條件下能向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和成脂肪細(xì)胞分化，其增殖和分化能力不受年齡因素影響。這些特點(diǎn)使PDCs必然會(huì)成為骨組織工程研究中種子細(xì)胞的選擇熱點(diǎn)。動(dòng)物試驗(yàn)也已證明，PDCs在組織工程修復(fù)臨界大小骨缺損中的潛力。在未來(lái)，應(yīng)從遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、材料學(xué)等方面充分開(kāi)發(fā)PDCs在骨修復(fù)重塑中的功能，使其在基于細(xì)胞治療的骨組織工程中發(fā)揮更大作用。

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261021 山東 濰坊，中國(guó)人民解放軍第八十九醫(yī)院 骨科實(shí)驗(yàn)室

李 婧(1974-)，女，遼寧興城人，副主任技師，博士.

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.08.016

2015-04-12)