慢性腎功能衰竭與線粒體

金　劼　張曉輝

慢性腎功能衰竭與線粒體

金劼張曉輝

慢性腎功能衰竭（chronic renal failure，CRF）是不同病因慢性腎臟病發(fā)展的最終結(jié)局。在中國，CRF的常見病因主要有慢性腎小球腎炎、間質(zhì)性腎炎、高血壓及糖尿病腎病等。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會1999年統(tǒng)計資料顯示［1］，我國CRF的發(fā)病率為33.16/百萬。CRF雖是臨床常見病，但迄今為止，其發(fā)病機制尚待完善。近年來，有關(guān)CRF發(fā)病機制的研究中，自由基與CRF的關(guān)系頗受關(guān)注，然而，自由基的主要產(chǎn)地和承受者-線粒體卻較少提及，雖然線粒體損傷在腎臟疾病發(fā)展中的作用開始受到關(guān)注［2］，但線粒體DNA（mtDNA）在腎臟疾病中的研究少見。線粒體是細胞凋亡的主開關(guān)，而mtDNA易氧化損傷，導(dǎo)致基因產(chǎn)物發(fā)生功能障礙，在一定程度上，線粒體的功能狀態(tài)決定著細胞的生存。對于CRF，線粒體是疾病進展的一個中心環(huán)節(jié)，本文就線粒體功能障礙與CRF的研究進展作一綜述，以期引起重視。

1　線粒體的生物學(xué)功能

1.1氧化磷酸化和活性氧（ROS）的產(chǎn)生 線粒體是細胞呼吸作用的細胞器，是細胞能量代謝的中心，線粒體具有通過氧化磷酸化（OXpHOS）合成ATP產(chǎn)生能量的重要作用［3］。氧化磷酸化過程提供了細胞生理活動所需要的能量，在線粒體呼吸鏈電子傳遞過程中生成了系列活性氧（ROS），包括超氧陰離子、過氧化物、羥自由基等［4］?；钚匝跎蛇^量時，不僅直接破壞細胞的結(jié)構(gòu)和功能，還通過不同的信號通路調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和凋亡，參與多器官組織疾病進程，如組織纖維化和細胞增殖硬化［5］。

1.2線粒體DNA的結(jié)構(gòu)及功能 mtDNA是細胞核外唯一存在的DNA，能獨立進行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。人類的mtDNA是一條共有16569個堿基對的雙鏈閉環(huán)分子，編碼13種蛋白質(zhì)、22種tRNA和2種rRNA。mtDNA非編碼控制區(qū)包括HV區(qū)、D-loop區(qū)及復(fù)制轉(zhuǎn)錄區(qū)［6］。mtDNA編碼的蛋白質(zhì)與氧化磷酸化功能密切相關(guān)。雖然相對于核DNA而言，mtDNA僅編碼較少的基因產(chǎn)物，但這些產(chǎn)物卻對細胞功能起著決定性的作用。mtDNA易于氧化損傷，因其缺乏組蛋白的覆蓋物保護，且靠近內(nèi)膜，是細胞內(nèi)活性氧簇（ROS）的主要產(chǎn)生部位，與核基因組相比，mtDNA無有效的損傷修復(fù)系統(tǒng)，因此，mtDNA的突變率超過核DNA的10倍［7］，而mtDNA的自發(fā)性突變或因自由基損傷所致的突變可導(dǎo)致基因產(chǎn)物發(fā)生功能障礙。

2　線粒體損傷與活性氧以及細胞凋亡的關(guān)系

2.1反應(yīng)性氧簇 反應(yīng)性氧簇又稱活性氧（ROS），包括超氧陰離子（O-2），羥自由基（-OH），過氧化氫（H2O2）及單態(tài)氧（IO2）等。在動物細胞內(nèi)，線粒體是主要的ATP生產(chǎn)中心，在產(chǎn)能同時持續(xù)產(chǎn)生需氧代謝的副產(chǎn)品-ROS，所以，線粒體亦是細胞內(nèi)ROS的主要來源以及靶位。由于線粒體呼吸鏈的電子漏，大約2%的氧分子不是用來生成ATP，而是生成了超氧陰離子［8］。正常生理條件下，線粒體中的超氧化物歧化酶（SOD）可將80%的超氧陰離子轉(zhuǎn)化為H2O，其余則通過線粒體膜進入細胞漿，然后被CuZn-SOD或細胞漿中其它的酶清除。

2.2線粒體損傷與活性氧 當(dāng)各種損害因素（如缺氧、酸堿度的異常、細菌內(nèi)毒素、各種毒物、射線、高代謝等）導(dǎo)致O-2產(chǎn)生增多或SOD活性降低時，不能被清除的超氧陰離子即可形成活性更強的-OH和其它氧自由基，并引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使線粒體膜中的不飽和脂肪酸被氧化，線粒體的脂膜流動性降低；而正常的線粒體氧化磷酸化功能依賴于線粒體膜蛋白質(zhì)分子的運動狀態(tài)［9］。而蛋白質(zhì)分子的運動又依賴于膜脂的流動性，所以線粒體膜中的不飽和脂肪酸被氧化，導(dǎo)致脂膜流動性下降，將使呼吸鏈各復(fù)合物在膜脂質(zhì)雙層中的側(cè)面擴散運動減弱，碰撞幾率減少，從而出現(xiàn)電子傳遞受阻，氧化磷酸化功能障礙。此外，-OH還可氧化線粒體脂膜上功能蛋白，氧化線粒體DNA，進一步出現(xiàn)線粒體功能缺陷。

2.3線粒體與細胞凋亡 線粒體受損狀態(tài)下可出現(xiàn)鈣平衡失調(diào)，引起線粒體內(nèi)鈣清除障礙，即“鈣超載”，Di Lisa等［10］報道，線粒體鈣超載導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔持續(xù)性開放，可破壞線粒體膜電位，使線粒體的大小和形狀迅速改變，ATP合成下降，最終導(dǎo)致細胞壞死。近來有學(xué)者認為，通透性轉(zhuǎn)換孔持續(xù)性開放可引起線粒體釋放促凋亡因子，如細胞色素c等，最終導(dǎo)致細胞凋亡［11］。細胞色素c從線粒體釋放到胞漿，這一過程在線粒體途徑凋亡中發(fā)揮著重要作用，釋放到胞漿的細胞色素c在ATP的參與下與Apaf-1及Caspase-9共同組成apoptosome；激活的Caspase-9進一步活化Caspase-3，最終導(dǎo)致細胞凋亡［12］。線粒體的融合與分裂過程依賴于介導(dǎo)線粒體膜重建的系列多肽，狀態(tài)正常時，其融合、分裂頻率相當(dāng)，當(dāng)線粒體被損傷時，其內(nèi)外膜重建動力學(xué)也可發(fā)生改變，并可通過激活caspase引起細胞凋亡［13］。

3　線粒體損傷與CRF

3.1腎臟細胞凋亡與CRF CRF的病理特點為持續(xù)進展性的腎小球硬化、腎小管萎縮，其過程中均有腎小球、小管實質(zhì)細胞的明顯減少，其機制中有細胞凋亡參與，腎間質(zhì)纖維化是各種腎臟疾病發(fā)展至CRF的病理變化和共同途徑之一，腎小管細胞凋亡過度可導(dǎo)致局部生理環(huán)境被破壞，進而出現(xiàn)腎小管細胞減少、萎縮和間質(zhì)纖維化，細胞凋亡數(shù)量與腎間質(zhì)纖維化正相關(guān)，而線粒體在細胞凋亡中起關(guān)鍵的“開關(guān)”作用。在凋亡信號的刺激下，細胞的“生死開關(guān)”-線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔持續(xù)性開放，外膜電位下降，線粒體發(fā)生腫脹、破裂，細胞色素C等凋亡因子從膜間隙釋放到細胞質(zhì)中，通過級聯(lián)凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1） 激活胱冬肽酶，使細胞進入凋亡程序。研究表明，線粒體經(jīng)典通路參與了高草酸尿大鼠腎小管上皮細胞凋亡［14］。彭黎明在研究抗GBM腎炎模型中腎小球硬化與內(nèi)皮細胞的凋亡關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，在4～8周后活動性壞死消失，但內(nèi)皮凋亡卻明顯增加，且與腎小球硬化程度相一致［15］。

3.2氧自由基與CRF 以往認為腎小球硬化決定了CRF的進程，而近年研究表明，腎小管-間質(zhì)損害和CRF進展的正相關(guān)比腎小球硬化與CRF之間的正相關(guān)更為顯著。當(dāng)CRF時殘余腎單位腎小管出現(xiàn)代謝亢進，進而出現(xiàn)組織耗氧量增加，導(dǎo)致氧自由基的產(chǎn)生增多；Na-H反向轉(zhuǎn)運亢進和細胞內(nèi)Ca2+流量增多，由此引起小管-間質(zhì)損害進行性加重和腎單位進一步喪失［10］。國內(nèi)學(xué)者采用電子自旋共振 （ESR）方法檢測，發(fā)現(xiàn)大鼠5/6腎切除30d后，殘余腎組織自由基含量顯著增高，而給予抗自由基藥物（大劑量vitE）組的大鼠的殘腎組織自由基顯著降低，小球小管的纖維化顯著減輕［16］。另一項動物實驗顯示，2型糖尿病鼠腎組織谷胱甘肽（GSH）、超氧化物酶 （SOD）含量下降，尿蛋白排泄率與SOD、GSH呈顯著負相關(guān)，提示糖尿病鼠腎臟局部的抗氧化能力降低，氧自由基生成顯著增多，該研究提示糖尿病大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)變化與局部氧自由基水平相關(guān)，氧自由基參與腎臟組織增生、腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化過程，在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中起重要作用［17］。

3.3mtDNA與慢性腎臟疾病 mtDNA缺失或突變可使編碼線粒體氧化代謝過程必需的酶或載體發(fā)生障礙，導(dǎo)致呼吸鏈蛋白出現(xiàn)質(zhì)和量的變化，線粒體不能利用糖原及脂肪酸等底物合成足夠的ATP供細胞使用，影響細胞能量代謝，從而導(dǎo)致細胞的功能異常，最終累及心、腦、腎等器官，出現(xiàn)臟器功能障礙［18］。腎臟是能量需求較大的器官之一，線粒體出現(xiàn)功能障礙會導(dǎo)致腎固有細胞損傷，并可誘導(dǎo)細胞凋亡；線粒體在功能缺陷時產(chǎn)生的活性氧顯著增加，從而加重腎臟的氧化應(yīng)激損傷，而氧化應(yīng)激又可直接損傷mtDNA，使其易發(fā)生突變，mtDNA多態(tài)性熱點區(qū)域主要位于包括D-1oop在內(nèi)的非編碼區(qū)域。研究顯示，mtDNA4696bp缺失突變的小鼠模型早期即發(fā)生局灶節(jié)段硬化性腎小球腎炎（FSGS），并在6個月齡時死于終末期腎衰，且在受損器官中腎組織mtDNA突變蓄積最為顯著［19］。Doleris等報道了局灶節(jié)段硬化性腎小球腎炎與線粒體功能障礙具有相關(guān)性［20］；隨后Yamagata等發(fā)現(xiàn)腎活檢組織中突變的mtDNA在FSGS的腎臟中蓄積＞80%［21］；后有研究者在嘌呤霉素氨基核苷腎炎（PAN）大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，在PAN的早期增生性腎炎階段，腎小球線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）的mRNA水平顯著升高，mtDNA數(shù)量增加至241%；而到了FSGS階段，TFAM的mRNA水平則顯著下降，mtDNA數(shù)量減少至34%［22］。這些研究尚不能完全揭示mtDNA突變及線粒體功能障礙在慢性腎臟病發(fā)病機制中的作用，但進一步探索研究線粒體功能變化與腎臟疾病變化的關(guān)系，對改善腎臟疾病的發(fā)展過程或許有重要意義。

4　總結(jié)

伴隨CRF的發(fā)生發(fā)展過程，存在線粒體形態(tài)和功能的特殊改變。諸多體外實驗或動物實驗發(fā)現(xiàn)并闡明，在氧自由基作用下腎臟細胞凋亡與腎小球硬化程度相一致。線粒體功能障礙可造成細胞供能減少、氧化損傷增加等，從而引起相應(yīng)的細胞損傷凋亡和腎小球疾病的發(fā)生發(fā)展。線粒體DNA的突變及線粒體損傷是如何誘發(fā)CRF的機制目前還未闡明，但較多實驗結(jié)果中均證實了mtDNA突變可削弱正常呼吸功能，釋放高水平的ROS，從而激活細胞凋亡及對核基因組的損傷［23］。

綜上所述，假設(shè)細胞在疾病狀態(tài)或超負荷及高代謝等狀態(tài)下，電子漏明顯增加，ROS劇增，出現(xiàn)線粒體呼吸功能障礙并氧化mtDNA，隨著mtDNA不斷受氧化損傷以及隨著年齡增長，mtDNA突變亦明顯增加，最終出現(xiàn)線粒體功能缺陷，導(dǎo)致ATP生成減少和ROS產(chǎn)生進一步增加，根據(jù)活性氧與細胞的生存狀態(tài)理論，隨著ROS的增多，殘余的健全腎單位經(jīng)歷了一個從增生肥大到實質(zhì)細胞逐漸死亡，腎小球硬化、小管萎縮，腎功能進行性惡化的過程。隨著尿毒癥毒素的持續(xù)升高，反過來進一步加重線粒體的損害，二者形成一個惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致CRF發(fā)生和發(fā)展。由于CRF的發(fā)生機制還不完善，線粒體是否參與了其中更多過程有待深入的研究，以期對CRF的預(yù)判和早期干預(yù)等方面更有裨益。

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浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生計劃（2012KYA181）；衢州市科技項目（20121083）

324004浙江衢化醫(yī)院腎內(nèi)科（金劼）310003浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎臟病中心（張曉輝）