反向模式—強陽離子交換—反向模式二維色譜法測定人血漿中甲氨蝶呤濃度

盛陽昊+劉丹琦+王萍+周伯庭

摘 要 建立了反向模式-強陽離子交換-反向模式（Reversed phase-strong cation exchange-reversed phase）二維色譜平臺測定人血漿中甲氨蝶呤濃度的方法。樣品經(jīng)三氯醋酸沉淀蛋白后，在ASTON C8一級柱（100 mm × 4.6 mm， 5 μm）上完成初分離，通過六通閥切換，經(jīng)ASTON SCX中間級（20 mm×4.6 mm， 5 μm）二次分離和儲存，在SAC C8二級柱（100 mm × 4.6 mm， 5 μm）上完成最后分離， 并測定。一級柱流動相為10 mmol/L醋酸銨-乙腈（90∶10， V/V， 以醋酸調(diào)至pH 3.8），流速為1.0 mL/min;中間級流動相為10 mmol/L H3PO4溶液（pH 3.0）;二級柱流動相為50 mmol/L醋酸銨-乙腈（87∶13， V/V， 以醋酸調(diào)至pH 5.2），流速為1.2 mL/min，檢測波長 306 nm。單次分析時間4 min，線性范圍0.09～5.1 μmol/L，檢出限為0.005 ?μmol/L，日內(nèi)RSD小于1.8%，日間RSD小于3.5%，相對回收率99.1%～101.25%，絕對回收率85.7%～86.4%。本方法簡便、準確，適合日常血藥濃度監(jiān)測和藥代動力學研究。

關鍵詞 二維色譜; 甲氨蝶呤; 高效液相色譜法

1 引 言

甲氨蝶呤（MTX）為二氫葉酸還原酶抑制劑，通過競爭性抑制二氫葉酸還原酶，阻止二氫葉酸還原為四氫葉酸，推遲和阻礙DNA 和RNA 的合成，發(fā)揮抗腫瘤作用，被廣泛用于治療急性淋巴細胞白血病等惡性腫瘤疾病。臨床上采用大劑量甲氨蝶呤聯(lián)合甲酰四氫葉酸鈣（ Calcium folinate，CF） 解救療法治療兒童急性淋巴細胞性白血病，由于該療法都是超常規(guī)大劑量靜脈滴注， 易產(chǎn)生嚴重的甚至致命的毒性反應， 例如腎衰竭﹑骨髓抑制、肝損害、胃腸道反應、皮膚黏膜反應等， 且劑量與血藥濃度個體差異大，必須開展MTX血藥濃度檢測^[1]。測定甲氨蝶呤的方法現(xiàn)主要有熒光偏振免疫法（FPIA）^[2]和高效液相法[3～8]。熒光偏振免疫法需要進口免疫試劑盒，因價格高而限制了在臨床使用;高效液相具有專一性強、準確度高的特點，大多數(shù)文獻都是基于一維色譜與不同的檢測器聯(lián)用，如紫外[3～5]、熒光^[6]、質(zhì)譜^[7，8]等，其中，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法靈敏度高，分析速度快，但預處理過程復雜，且購置儀器成本較高。本研究采用二維色譜平臺，加上壓縮控制流路抑制大體積進樣和二維色譜死體積大而造成的峰展寬，運用SCX中間級對色譜網(wǎng)絡進行串聯(lián)修改，實現(xiàn)了樣品的大通量快速檢測，顯著減少了人為干預度和單次分析時間，適用于大樣本臨床藥物濃度測定和藥代動力學研究。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

RP-SCX-RP二維色譜平臺：3個LC-20A泵、CBM-20A色譜控制器、SIL-20A自動進樣器（改裝500μL進樣環(huán)）、DGU-20A自動脫氣機、SPD-20A紫外檢測器、2個FCV-12AH六通閥，以上各組成單元均購自日本島津公司;FLC2420柱溫箱、ASTON C8一級色譜柱 （100 mm×4.6 mm， 5 μm）、ASTON SCX中間級 （20 mm×4.6 mm， 5 μm）、SAC C8二級柱為 （100 mm×4.6 mm， 5 μm），均購自長沙ANAX分析儀器有限公司;電子天平;PHS-3S PH計（上海精科），XW-80A渦旋混合器（上海青浦西儀器廠）;高速離心機（杭州奧盛儀器有限公司）。

MTX對照品（中國藥品生物制品檢定所）;甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）;乙酸銨（美國TEDIA公司）;乙二醇、三氯乙酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）;去離子水由美國Millipore 純水機制備;患者血清取自中南大學湘雅醫(yī)院小兒科。

2.2 對照品溶液和質(zhì)控血清樣品的制備

取MTX對照品適量，準確稱定，用甲醇溶解和少量DMF助溶，并定容至25 mL， 制成51.54 μmol/L貯備液。取上述標準品儲備溶液適量，分別加乙二醇稀釋，制成各標準工作溶液。用空白血清和MTX貯備液分別配制濃度為0.0879， 0.2474， 0.6185， 1.546， 3.092和5.154 μmol/L的MTX系列標準血清樣品。同法配制濃度為0.2474和3.092 μmol/L的質(zhì)控血清樣品，分裝于1.5 mL塑料離心管中，置 Symbolm@@ 20 ℃保存，備用。

2.3 血清樣品預處理

取200 μL血清樣品，加入10%三氯乙酸溶液600 μL，渦旋混合30 s，14500 r/min高速離心10 min，取上清液200 μL進樣分析。

2.4 RP-SCX-RP二維色譜平臺測定流程及條件

本二維色譜平臺一級柱與二級柱之間通過中心切割作為傳輸模式，具體采用間接傳遞技術，并用中間級作為二次分離和儲存、轉(zhuǎn)運的場所。

圖1為具體運行原理圖，PUMP1所對應的一級柱流動相為10 mmol/L醋酸銨-乙腈（90∶10， V/V， 以乙酸調(diào)至pH 3.8），流速為1.0 mL/min;PUMP2輔助流路流動相為10 mmol/L H3PO4溶液（pH 3.0）; PUMP3所對應的二級柱流動相為流動相為50 mmol/L乙酸銨-乙腈（87∶13， V/V， 以乙酸調(diào)至pH 5.2），〖TP<07091.tif>，+59mm＼.100mm，Y#〗[TS（][HT5”SS] 〖ZK（〗圖1 反向模式-強陽離子交換-反向模式二維色譜平臺工作原理圖endprint

Fig.1 Schematic diagram of reversed phase-strong cation exchange-reversed phase （RP-SCX-RP） two-Dimensional liquid chromatography platform 〖ZK）〗[HT5][TS）]流速為為1.2 mL/min，檢測波長為306 nm。

如圖1所示，六通閥1和2在圖中狀態(tài)均為On（閥中實線表示相連通），其切換另一狀態(tài)為Off。在被測組分進樣時，六通閥1和2均為On，同時Pump 2啟動，運用模擬梯度壓縮技術來解決二維色譜平臺死體積大和大體積進樣時峰展寬問題;然后被測組分在一級柱中分離，同時停止Pump 2，六通閥1和2分別為Off和On;接著通過切換閥切換流路，六通閥1和2均為Off，此時一級柱與中間級相連，轉(zhuǎn)移被測組分，并再一次用啟動Pump 2，進一步減少峰展寬，改善峰型。最后通過再一次的閥切換流路，六通閥1和2均為On，將中間級中的被測組分轉(zhuǎn)移到二級柱，完成最后的分離與檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 二維色譜網(wǎng)絡構建和時間復雜度分析

醫(yī)院藥學部門的大通量藥物分析二維色譜平臺構建，需重點考察耐久度、經(jīng)濟性、時間復雜度3個重要評估要素。

在復雜生物基質(zhì)中小分子藥物的測定中，二級色譜柱之間常用的傳遞技術為反沖和中心切割^[9]，反沖模式去雜質(zhì)能力較中心切割模式差，使一級柱頭上的強保留物質(zhì)反沖入二級柱，造成二級柱壓力升高，降低耐久度，同時也會增加二級柱的分離難度以及增加二級柱的負載，造成二級柱壽命降低，于是本實驗選擇中心切割作為平臺的傳遞技術。

運用RAM（Restricted access media）柱和貫流色譜柱直接進樣已成為發(fā)展趨勢，但商品RAM柱成本較高，耐久性不好，不適合醫(yī)院藥學部門的大通量樣本檢測。而貫流色譜柱粒徑較大，柱效低，中心切割范圍增大一倍以上，因此本研究采用C8柱與沉淀蛋白取上清進樣，樣品相對干凈，對不同藥物的平均柱壽命比RAM相比有較大提高，經(jīng)濟性良好，相比于離線固相萃取和液液萃取，人為干預程度明顯減少，能得到更好的準確度與精確度。

醫(yī)院藥學部門因日常TDM監(jiān)測樣品種類多，通量大，必須減少單次分析的時間?；谧詣舆M樣器增加通量的方法是對色譜網(wǎng)絡進行并聯(lián)修改^[10，11]，但此種方式并不適合中心切割，因為兩根并聯(lián)柱不同，多次進樣后損壞程度也不同，切割時間窗口不易制定，且當樣品通量較大時，自動進樣器的批處理表容易出錯。據(jù)此，本研究對色譜網(wǎng)絡進行串聯(lián)修改，引入了SCX中間級，將被測組分儲存在中間級，使一級柱進下次樣品時，中間級的組分被轉(zhuǎn)移到二級柱并同時進行分析，縮短單次循環(huán)的時間，使大通量的樣品檢測時間復雜度大大降低。中間級除擔負減少時間復雜度的任務外，還可以進一步分離雜質(zhì)，凈化了到達二級柱的組分，減小二級柱負載。具體原理為通過調(diào)整輔助壓縮流路的pH值，使MTX保留在SCX柱上。通過觀察不同pH值對色譜峰面積的影響。發(fā)現(xiàn)在pH 3.0～5.5之間，隨著pH值增加，保留量減少，故調(diào)整輔助壓縮流路pH=3。

3.2 大體積進樣和峰展寬控制

大體積進樣可以根據(jù)分析物質(zhì)的靈敏度要求提高進樣量（常規(guī)進樣量0～500 μL，最大可改裝1000 μL的進樣環(huán)），獲得更低的定量限，擴大了紫外檢測器的應用范圍，滿足日常TDM和藥代動力學中代謝物的檢測要求.

考慮到大體積進樣的應用與二維色譜的柱外效應，本研究運用梯度模擬壓縮技術，在柱頭部控制峰展寬。梯度模擬壓縮具體運行為：在進樣和被測組分從第一級色譜轉(zhuǎn)移到中間級時，同時開啟Pump 2，使Pump 2所控制的流動相（10 mmol/L H3PO4）進入色譜流路，并根據(jù)流速和管路長度計算出關泵時間。

如圖2所示，當t=0時，被測組分在柱端進口處，由于輔助壓縮流路的開啟，被測組分后部的一段流動相有機相濃度由φ1減小為φ2，設濃度φ1的流動相洗脫速度為：

u1=u0/1 + k1

濃度φ2流動相洗脫速度為：

u2 =u0/1 + k2

其中， u0為流動相線速度，k1和k2分別為被測組分在不同濃度流動相中的保留因子。由于u1> u2，峰展寬在柱頭被壓縮，當t=tf 時，有機相濃度較高的流動相頭部“追上”了被測組分頭部，整個柱頭壓縮過程結(jié)束。

本實驗中MTX進樣200 μL，峰展寬約為0.6 min，比一般小體積進樣（小于50 μL）的文獻峰寬明顯變窄[3～5]，可看出運用此技術后效果良好。因大體積進樣帶來的靈敏度提高效果顯著，檢出限為0.005 μmol/L， 低于普通配備紫外檢測器的高效液相，略高于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法^[7，8]，效費比最高。若要得到液-質(zhì)聯(lián)用的檢出限水平，還可以繼續(xù)加大進樣量（進樣環(huán)最大可改裝到1000 μL）。

3.5 專屬性與樣品分析

空白血漿色譜圖空白血漿加MTX分別見圖3a，圖3b，空白血漿圖譜在MTX出峰處背景干凈，無雜峰干擾，治療常用合并藥物（如阿糖胞苷、柔紅霉素、地塞米松）不出峰。取本院小兒科病人血漿按照2.3節(jié)進樣色譜圖見圖4c?？梢娊?jīng)過二維色譜分離后，MTX峰形尖銳且為基線分離，減少了低濃度時的積分誤差。

應用本方法對使用大劑量MTX治療小兒科患者進行血藥濃度監(jiān)測，兩名患者均為女性，年齡分別為6歲和10歲，檢測時間點為給藥后44和68 h，所有的血漿樣品采集后立刻測定。44 h檢測結(jié)果分別為1.525和0.658 μmol/L，其中第一位患者血藥濃度超過44 h血藥濃度標準（>1 μmol/L），提示需要用四氫葉酸鈣解救;68 h繼續(xù)測定第一位患者，血藥濃度為0.058 μmol/L，達到小于0.1 μmol/L的安全濃度?？赏Ｖ菇饩?。endprint

4 結(jié) 論

本方法采用反向模式-強陽離子交換-反向模式（RP-SCX-RP）二維色譜平臺測定人血漿中甲氨蝶呤濃度，運用大體積進樣提高靈敏度，模擬梯度壓縮技術控制峰展寬，并采用串聯(lián)修改色譜網(wǎng)絡，大大減少了單次分析時間復雜度，人為干預度小、簡便、準確，適合臨床甲氨蝶呤藥物濃度檢測和藥動學研究。

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Platform of Reversed Phase-Strong Cation Exchange-Reversed

Phase Two-Dimensional High Performance Liquid Chromatography

for Determination of Methotrexat in Plasma

SHENG Yang-Hao1，2， LIU Dan-Qi1，2， WANG Ping1，2， ZHOU Bo-Ting*1，2

1（The Pharmacy Department of Central South University Xiangyang Hospital， Changsha 410008， China）

2（The Pharmacy of Central South University， Changsha 410008， China）

Abstract A two-dimensional HPLC method was developed for the determination of methotrexat （MTX） in human plasma. The samples were treated with trichloroacetate for sedimentation and high speed centrifugation， and the obtained supernatant was taken for analysis. The analytes in sample were separated on the first dimension column （ASTON C8 100 mm × 4.6 mm， 5 μm）， and trapped on the middle column （ASTON SCX 20 mm × 4.6 mm， 5 μm） using valve-switching technique for purification and storage. Finally， the trapped analytes were transferred to the second-dimension column （SAC C8 100 mm × 4.6 mm， 5 μm） for the second separation. The mobile phase used for the first dimension was 10 mmol/L ammonium acetate-acetonitrile（9∶1， V/V， pH=3.8） with a flow rate of 1 mL/min and the mobile phase used for middle column was 10 mmol/L phosphoric acid （pH=3.0）. The mobile phase used in second-dimension was a mixed solution of 50 mmol/L ammonium acetate and acetonitrile （87∶10， V/V， pH=5.2）. UV detection was carried out at ?306 nm and completed in 4 min. The calibration curve showed a linearity range from 0.0879 to 5.154 μmol/L （r=0.99998）. The LOQ was 0.005 μmol/L. The intra-and inter-day precisions were lower than 1.5% and 1.8%， respectively. The relative recovery and the absolute recovery were 99.1%-101.2% and 85.67%-86.35%， respectively. The assay is simple， accurate， reproducible， and suitable for the therapeutic drug monitoring of MTX in the hospital and the study on the pharmacokinetics of MTX.

Keywords Two-dimension liquid chromatography; Methotrexat; High performance liquid chromatography

（Received 19 August 2014; accepted 25 September 2014）endprint