超高效液相色譜/串聯(lián)質譜法同時測定水、土壤及糞便中25種抗生素

郭欣妍+王娜+郝利君+智勇+許靜+王昝暢+單正軍

摘 要 本研究通過超聲提取-固相萃取，建立了利用超高效液相色譜/串聯(lián)質譜同時分析糞便、土壤和水體中25種獸藥抗生素的方法，考察了串聯(lián)SAX小柱對土壤樣品和糞便樣品的凈化效果，以及正己烷提取對糞便樣品提取液脫脂的凈化效果。實驗結果表明：本方法對25種獸藥抗生素加標回收率為50.0%～121.9%，相對標準偏差為 1.1%～14.7%（n=9）;土壤和糞便的方法檢出限為0.0002～0.0560 μg/kg，水體的方法檢出限為0.002～0.28 ng/L;串聯(lián)SAX強陰離子交換柱后，土壤樣品的基質效應降低為75%～160%之間，糞便樣品降低為55%～120%之間;糞便樣品經正己烷脫脂后，基質效降為55%～120%之間。已將本方法應用于養(yǎng)殖場周邊環(huán)境介質的檢測。

關鍵詞 抗生素; 喹諾酮類; 磺胺類; 四環(huán)素類; 大環(huán)內酯類; 液相色譜-串聯(lián)質譜

1 引 言

獸藥抗生素除了被廣泛用于預防和治療動物疾病^[1]，還有一大部分在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中以亞治療劑量添加于動物飼料中^[2，3]，起到刺激動物生長和促進增產的作用。獸藥抗生素在動物體內不能完全代謝降解，隨畜禽糞便和尿液排出的比例很高^[4]，這些含獸藥抗生素的畜禽糞便可通過有機肥料的施用進入農田土壤，并有可能通過滲透、徑流、淋溶等方式遷移到地表水和地下水中，而水體中的獸藥抗生素也有可能被沉積物吸附^[5，6]。已有不少文獻報道了糞便、土壤、水體和沉積物等環(huán)境介質中檢測到高濃度的獸藥抗生素^[7，8]。

近年來，國內外對抗生素的研究日趨重視，關于環(huán)境中抗生素殘留檢測的研究很多^[7，8]。但由于環(huán)境介質成分的復雜性會對抗生素的分析帶來不可預知的干擾，嚴重影響分析方法的準確性，開發(fā)一種能有效降低復雜環(huán)境介質的基質效應干擾，并且同時檢測不同環(huán)境介質中多類抗生素殘留的分析方法尤為重要。馬麗麗等^[9]報道了一種土壤中同時檢測磺胺類、四環(huán)素類、氟喹諾酮類18 種抗生素的方法，葛峰等^[10]報道了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定有機肥中四大類18種抗生素殘留的方法，但上述方法均忽略了復雜基質對檢測的影響，缺少對復雜基質的凈化研究。本研究通過超聲提取-固相萃取，建立了25種目標抗生素的高靈敏檢測方法，實現(xiàn)了對25種抗生素在土壤、糞便和水體介質中殘留的同時分析，并且驗證了SAX小柱對糞便（土壤）樣品提取液的凈化效果和正己烷對糞便樣品提取液脫脂的凈化效果，提供了能降低糞便（土壤）樣品基質效應行之有效的方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

ACQUITYTM超高效液相色譜儀-Quattro Premier XE 質譜儀， 配 MassLynx V.4.1 軟件Waters Acquity;UPLC BEH C18 色譜柱（100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm）。以上儀器購自美國Waters公司。真空冷凍干燥機（美國Virtis公司）;高速冷凍離心機（德國Sigma公司）;Milli-Q超純水器（美國Millipore公司）;AG-285電子天平（瑞士Mettler公司）;MG-2200氮吹儀（日本EYELA公司）;12通道固相萃取裝置（美國Waters公司）;Waters Oasis HLB固相萃取柱（200 mg， 6 mL， 美國Waters公司）;強陰離子SAX交換柱（200 mg， 6 mL，安譜公司）。

乙腈、甲醇，甲酸（色譜純，德國Merck公司）;實驗用水為經Milli-Q凈化系統(tǒng) （0.22 μm孔徑過濾膜） 過濾的去離子水;磷酸鹽緩沖液（pH= 3）：將27.2 g KH2PO4與1.35 mL H3PO4用去離子水定容至1 L。

標準品：諾氟沙星（Norfloxacin，99.5%），環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin，95.0%），恩諾沙星（Enrofloxacin，98.0%），氧氟沙星（Ofloxacin，99.0%），氟羅沙星（Fleroxacin，99.0%），沙拉沙星（Sarafloxacin，99.0%），磺胺嘧啶（Sulfadiazine，98.0%），磺胺甲嘧啶（Sulfamerazine， 99.0%），磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine，99.0%），磺胺間二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine， 98.0%），磺胺甲惡唑（Sulfamethoxazole，99.5%），磺胺噻唑（Sulfathiazole，99.5%），磺胺氯噠嗪（Sulfachloropyridazine，100.0%），四環(huán)素（Tetracycline，98.0%），土霉素（Oxytetracycline，95.6%），金霉素（Chlortetracycline，92.0%），強力霉素（doxycycline， 98.5%），紅霉素（Erythromycin， 95.30%），羅紅霉素（Roxithromycin， 98.20%），泰樂菌素（Tylosin， 91.70%），交沙霉素（Josamycin，99.0%），克林霉素（Clindamycin， 93.4%），林可霉素（Lincomycin，99.0%），萬古霉素（Vancomycin，91.20%）頭孢唑林鈉（Cefazolin Sodium，96.5%），均購于德國Dr. Ehrenstorfer 公司。

內標：環(huán)丙沙星-d8（Ciprofloxacin-d8，98.0%），磺胺二甲嘧啶-d6 （Sulfamethazine-d6， 98.0%），四環(huán)素-d6（Tetracycline-d6，95.0%），紅霉素-d4（Erythromycin-d4，99.0%）， 均購自美國多倫多研究化學品公司。endprint

上述標準品均用甲醇配制成1000 mg/L標準儲備液，其中磺胺嘧啶及喹諾酮類的6種藥物因在甲醇中溶解度較小，使用1% 氨水-甲醇配制， Symbolm@@ 40 ℃儲存。配制上述25種抗生素的10 mg/L混合標準液。

2.2 提取和凈化方法

水樣：準確量取經0.45 μm玻璃纖維濾膜過濾的水樣500 mL，加入10 μL 內標（10 mg/L的磺胺二甲嘧啶-d6、四環(huán)素-d6、環(huán)丙沙星-d8和1.0 mg/L去水紅霉素-d4）以及0.4 g EDTA，并立即在4 ℃儲存。在提取之前，用甲酸調節(jié)至pH 2.0～3.0。預先依次用6 mL甲醇、6 mL超純水、6 mL磷酸鹽緩沖液（pH=3）對HLB固相萃取柱淋洗活化?？刂屏魉偌s為3～5 mL/min，將提取液上柱。過柱完成后，用6 mL超純水沖洗HLB柱。抽真空30 min，以去除柱中殘留水分，然后將HLB柱在N2保護下干燥10 min。最后以2 mL甲醇洗脫3次，收集洗脫液，并在室溫下用N2吹至近干，用乙腈-0.2%甲酸 （1∶9，V/V）混合液定容至1mL，渦旋振蕩2～3 min，18000 r/min離心10 min，取上清液待分析。

土壤樣品： 土壤采自農田表層（0～20 cm）新鮮水稻土土樣，剔除其中的小石塊以及植物殘體，將土壤樣品置于 Symbolm@@ 40 ℃冷凍一周后，使用冷凍干燥儀進行干燥。研磨干燥土樣，過250 μm孔徑尼龍篩，置于 Symbolm@@ 40 ℃存放。準確稱取10 g±0.01 g經研磨的土壤樣品于50 mL離心管中，加入10 μL 內標物質，并加入0.4 g EDTA以及混合提取液30 mL（磷酸鹽緩沖液（pH=3）-乙腈，1∶1，V/V），渦旋2 min，超聲提取20 min，4 ℃下8000 r/min離心8min，收集上層提取液。反復提取2次后，合并提取液并混勻。用旋轉蒸發(fā)儀旋蒸（220 Pa，50 ℃）提取液，直至剩余30 mL以下，用蒸餾水稀釋到200 mL，用甲酸調至pH 2.8～3.0，將稀釋液過0.45 μm孔徑玻璃纖維微孔濾膜，以去除大顆粒雜質。土壤提取液用SAX-HLB串聯(lián)固相萃取柱凈化與富集，過柱完成后，去除SAX柱，其余處理過程與水樣方法相同

糞便樣品： 糞便樣品置于 Symbolm@@ 40 ℃冷凍一周，使用冷凍干燥儀進行干燥。研磨干燥糞便樣，過250 μm孔徑尼龍篩，置于 Symbolm@@ 40 ℃ 存放。準確稱取5 g±0.01 g經研磨的糞便樣品于50 mL離心管中，加入10 μL 內標物質。提取、濃縮、稀釋過程與土壤樣品相同。稀釋液用100 mL 正己烷萃取2次，脫去糞便中的脂肪。余下處理過程與土壤樣品相同。

2.3 LC-MS/MS測定

MS檢測條件：電噴霧離子源（ESI），離子源溫度為120 ℃，脫溶劑溫度為380 ℃，脫溶劑氣和錐孔氣為氮氣，脫溶劑氣流速為500 L/h，錐孔氣流速為50 L/h，碰撞氣為高純氬氣，采用多反應監(jiān)測模式（MRM）檢測。ESI-MS/MS選擇性反應正離子檢測，進樣5 μL，檢測離子和各子離子碰撞能量見表1。

HPLC測定條件：柱溫：35 ℃，流動相：乙腈（A）和0.2%（V/V）甲酸（B），流速0.3 mL/min;測定時采用的流動相梯度為：0～7 min，10%～40% A;7～9 min，40%～60% A;9～9.01 min，60%～10% A;

2.4 分析方法的質量控制

本實驗采用全程空白、平行樣和內標對分析過程進行質量控制，確保結果的可靠性。處理數(shù)據時，采用了標準添加法對各待測化合物在土壤（糞便、天然水體）基質中存在的不可忽略的基質效應進行了校正。在環(huán)境分析中，標準添加法是校正LC-ESI-MS/MS法基質效應影響的可行措施。本實驗中將2.3項下處理的土壤（糞便、水樣）提取液平均分成兩份。其中一份直接進樣分析，記錄待測樣品和內標的峰面積;另一份根據第一份的檢出情況，精密加入各化合物標準混合工作液適量，然后進樣分析，記錄待測樣品和內標的峰面積。依據標準添加法校正公式計算樣品濃度C=SRx/（Rs-Rx），其中C為校正后的濃度;S為標準添加量;Rx為標準液添加前測得待測樣品與內標峰面積比值; Rs為標準液添加后測得待測樣品與內標峰面積比值。

3 結果與討論

3.1 紅霉素的降解與去水紅霉素標準品的制備

空白加標和基質加標實驗均發(fā)現(xiàn)紅霉素的回收率低于10%，說明本方法不適合紅霉素的檢測，這與文獻[11，12]報道的結果接近。同時監(jiān)測紅霉素和去水紅霉素，可得到紅霉素溶解于乙腈-0.2%甲酸溶液（1∶9，V/V）中時，會有明顯的降解現(xiàn)象。張秀藍等^[11]在全掃描條件下分析了酸性溶液中紅霉素的降解產物，進一步證實了紅霉素在酸性條件下發(fā)生分子內脫水環(huán)合生成脫水紅霉素。

由于本研究測定體系中（提取-固相萃取-濃縮-定容），pH值基本維持在2～3之間，紅霉素在此pH值區(qū)間以脫水紅霉素的形式穩(wěn)定存在。因此在測定實際環(huán)境樣品過程中，需通過檢測脫水紅霉素來實現(xiàn)對紅霉素的監(jiān)測。去水紅霉素標準品在市場中難以獲取，本研究用下述方法制備去水紅霉素標準品：以30%甲醇 配制100 mg/L紅霉素，用3 mol/L H2SO4調節(jié)至pH 3，在室溫下連續(xù)攪動3 h，以使紅霉素能完全轉變?yōu)槿ニt霉素^[13]，并用質譜監(jiān)測紅霉素的剩余量，以確證該反應進行完全。同理，以此法制備去水紅霉素內標標準品。

3.2 樣品的凈化

由于在ESI模式下UPLC-MS/MS色譜系統(tǒng)共洗脫化合物之間存在電離競爭，基體效應（離子抑制和離子增強）是不可避免的。基質效應（ME）可表示為同一添加濃度的被分析物在基質中的信號與分析物在溶液中的信號比值，公式如下^[14]：endprint

其中， Cm和Cs表示被分析物在基質中和在溶液中的溶度。當基質效應在80%～120%之間表明基質效應可忽略，當基質效應在50%～80%和120%～150%之間則表明有輕微的不可忽略基質效應^[17]。

3.2.1 SAX強陰離子交換柱對糞便樣品和土壤樣品的凈化

土壤腐殖質多由分解的植物和動物遺體和肥料組成，約占土壤成分1～10%，典型的菜園土的含量通常在5%以上，腐殖質一般帶負電，極容易從土壤轉移到提取液中，干擾目標抗生素的測定。豬糞的質地較細，成分較復雜，含蛋白質、脂肪類、有機酸、纖維素、半纖維素以及無機鹽等。按照2.3節(jié)的提取方法提取樣品，必然會不可避免地提取出一些影響目標抗生素離子化的成分。SAX強陰離子交換柱被放置在HLB固相萃取柱頂部，能有效地吸附土壤提取液中帶負電的腐殖質分子以及去除糞便提取液中的帶負電的雜質分子，降低其基質效應。圖2 為串聯(lián)SAX小柱對土壤樣品與糞便樣品的基質效應降低效果圖，串聯(lián)SAX強陰離子交換柱后，土壤基質和糞便基質對目標抗生素離子增強或抑制的效應明顯減弱，土壤樣品的基質效應由55%～180%轉化為75%～160%，糞便樣品的基質效應由20%～165%轉化為55%～120%。

3.3.2 正己烷萃取脫脂 正己烷脫脂步驟一般用于肉類等脂肪含量高的樣品的的前處理過程^[15]，干燥糞便約含有10%～15%脂肪。糞便中的脂肪溶于提取液的有機相，并在隨后濃縮去除有機相的步驟中，以半固體大分子的形態(tài)轉移到水相中。脂肪大分子會增加稀釋液的粘稠度，在低溫下還會析出，堵塞固相萃取小柱，嚴重影響分析過程的流暢性，脂肪大分子的存在也會增加基質對目標抗生素離子增強或抑制的效應。因此，在處理糞便樣品時需要在稀釋液上樣前，增加正己烷萃取脫脂步驟，以降低糞便樣品的基質效應。

由圖3對比可知，糞便樣品的基質效應25%～190%轉變?yōu)?5%～120%。為保證增加正己烷萃取脫脂步驟不會降低實驗的回收率，以江蘇農科院豬糞空白為基底，進行加標回收實驗，結果如圖3，正己烷萃取脫脂對喹諾酮類、四環(huán)素類、萬古霉素和頭孢唑林鈉的回收率基本沒有影響，并且能提高磺胺類和大環(huán)內酯類的回收率。

3.3 方法學確證

3.3.1 標準工作曲線與檢出限 采用無檢出抗生素的土壤空白、糞便空白和水體空白，按2.3節(jié)所述方法處理后，加入混合標準溶液，配制成目標抗生素濃度為0.0002～5.000 mg/L的系列基質加標標準溶液，進行UPLC-MS/MS測定。以抗生素標樣的3倍信噪比（S/N=3）所對應的標樣濃度計算方法檢測限（表2），目標抗生素的相關系數(shù)在0.990～0.998之間。

3.3.2 方法的回收率

吸取適量混合標準工作液到土壤空白、糞便空白和水體空白，配成含25種目標抗生素濃度范圍在0.1～300 μg/kg（0.002～6.0 μg/L）之間的高中低3個濃度的待測樣品，每個濃度水平5份，按2.3節(jié)處理方法處理后，進行UPLC-MS/MS測定，記錄各化合物及內標色譜峰面積。計算各待測化合物在空白水樣的方法回收率（表2），RSD在1.1%～14.7%之間。

3.4 實際樣品檢測

2014年3月在南京市六合區(qū)養(yǎng)豬場采集的樣品主要有水樣、土壤、豬糞。糞便樣品分別為養(yǎng)殖場飼養(yǎng)的母豬、育肥豬、仔豬排放。采集的3份水樣為從豬場排出的廢水，水樣釆集方法是使用采水器取深度0.5 m處的水。土樣采自該養(yǎng)殖場周邊菜地0～20 cm的表層土壤，在直徑50 cm左右的范圍內取樣約1 kg。采用本方法對糞便、土壤和水樣進行分析，結果見表3。由表3可知：（1）該養(yǎng)豬場糞便樣品中檢出的抗生素主要為四環(huán)素類抗生素和大環(huán)內酯類抗生素，檢出的抗生素種類較為豐富，并且育肥豬、仔豬和母豬的糞便中檢出的抗生素品種不盡相同，這可能與喂養(yǎng)的商品化精飼料不同有關;（2）在豬場排出的廢水中檢出了喹諾酮類、磺胺類、大環(huán)內酯類等多類抗生素。豬場排出的廢水存放在室外，長期暴露在陽光中，廢水中的抗生素在微生物、光照等條件作用下發(fā)生水解，因此廢水中抗生素的暴露濃度均低于糞便;（3）豬場菜地檢出喹諾酮類和大環(huán)內酯類抗生素。喹諾酮類和大環(huán)內酯類抗生素在土壤中降解較慢，吸附性強^[16，17]，這兩類抗生素能較長時間穩(wěn)定地殘留在土壤基質。

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Simultaneous Detection of 25 Kinds of Veterinary Antibiotics in Soil，

Manure and Water Samples Using Liquid Chromatography-

Tandem Mass Spectrometry

GUO Xin-Yan1， WANG Na*1， HAO Li-Jun2， ZHI Yong3， XU Jing1， WANG Zan-Chang1， SHAN Zheng-Jun1

1（Nanjing Institute of Environmental Science， Ministry of Environmental Protection， Nanjing 210042， China）

2（Faculty of Science Analytical Chemistry Department， China Pharmaceutical University Nanjing 211198， China）

3（Nanjing University of Information Science and Technology， Nanjing 210044， China）endprint

Abstract A liquid chromatography-tandem mass spectrometric method was established for the determination of 25 kinds of veterinary antibiotics in manure， soil and water by ultrasonic-solid phase extraction. Purification efficiency of SAX cartridges for soil and manure samples extract and the procedure that manure samples defatted with hexane was also verified. The results showed that the average recoveries of the 25 target antibiotics were 50.0%-121.9%， the relative standard deviations （RSD） were 1.1%-14.71% （n=9）， and the limits of detection （LOD） ranged from 0.0002-0.0560 μg/kg for soil and manure and ranged from 0.002-0.28 ng/L for water; After adding SAX cartridges， the matrix effects of manure samples reduced to 55%-120%， and soil samples to 75%-160%; after defatting by hexane extraction， the matrix effects of manure sample reduced to 55%-120%. This method has been employed to detect the veterinary antibiotics in environmental samples of livestock farm.

Keywords Antibiotics; Quinolones; Sulfonamides; Tetracyclines; Macrolides; Liquid chromatography-tandem mass spectrometry

（Received 27 June 2014; accepted 16 September 2014）

This work was supported by the Commonweal and Environmental Protection Project for the MEP Grant （Nos.201109038， 201309031）endprint