豬偽狂犬病毒野毒感染的PCR檢測方法建立及應(yīng)用

范克偉，戴愛玲，吳德峰，楊小燕＊，江丹丹

（1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建龍巖364012；2.福建省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，福建龍巖364012；3.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，福建福州350002）

豬偽狂犬病是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一種急性傳染病，以新生仔豬的腹瀉及神經(jīng)癥狀，妊娠母豬繁殖障礙、流產(chǎn)、死胎及呼吸道癥狀，成年豬隱形感染，長期帶毒排毒為特征［1］。在我國豬偽狂犬病的流行范圍很廣，迄今為止已有20 多個省份出現(xiàn)該病的流行［2－3］。尤其自2012年以來，由豬偽狂犬病毒變異株引起的豬偽狂犬病出現(xiàn)了新的發(fā)病特征，發(fā)病率和死亡率明顯上升，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失［4－8］。該病目前尚無有效治療藥物，豬偽狂犬病的防制主要依靠基因缺失疫苗的廣泛應(yīng)用，雖然疫苗接種可使豬免于發(fā)病，但不能阻止野毒的潛伏感染［9］。由于該病的流行形勢發(fā)生了新變化，近年來疫苗的保護率不是很高，這給該病的防控工作大大增加了難度。此外，PRV 的檢測方法主要是針對抗體或gE 抗體缺失的血清學(xué)檢測方法，無法區(qū)分疫苗免疫豬和野毒感染豬［10］。

糖蛋白gB 是PRV 的一個重要包膜組分和中和抗原，對于PRV 感染必不可少。而gB 基因?qū)RV 的復(fù)制也是不可缺少的［11－12］。gE 基因是PRV 的主要毒力基因之一，但不是病毒復(fù)制所需的［13］。PRV Bartha－K61株疫苗（缺失gE／gI）目前在世界上應(yīng)用最為廣泛，市場占有率超過90%。因此，本研究根據(jù)豬偽狂犬病毒gB 和gE 基因序列，建立了快速鑒別豬偽狂犬病毒gE 基因缺失疫苗毒與野毒的雙重PCR 檢測方法，對于豬偽狂犬病的快速確診具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病毒株、細(xì)胞和病料

PRV 容A（RA）株購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，PRV、PPV、PCV2、HP－PRRSV 及CSFV野毒株均由本實驗室分離鑒定；PRV 疫苗HB－98株和Bartha－K61株均購自武漢科前生物制品有限責(zé)任公司；豬腎細(xì)胞PK－15由本實驗室保存；疑似PRV病料樣品由龍巖學(xué)院動物醫(yī)學(xué)研究所保存。

1.2 主要試劑

LA Taq DNA 聚合酶、2×GC Buffer I、dNTP、DL 2，000DNA Marker、Universal Genomic DNA Extraction Kit及pMD18－T Vector均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中登錄的PRV gE和gB基因序列設(shè)計2 對特異性引物，P1：5＇－GCGCTGGGCTCCTTCGTGAT－3＇，P2：5＇－CGCCATAGTTGGGTCCATTCGT－3＇； P3：5＇－ATCCAGGCGCACGT－GAACGAC－3＇，P4：5＇－CTGGTTGCGGCGCTGGAT－3＇。引物P1／P2擴增gE（400bp），引物P3／P4擴增gB（582bp）。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 病毒培養(yǎng)

分別用PRV、PCV2和PPV，接種PK－15細(xì)胞，PCV2在接毒后72h收毒，PRV 和PPV 在PK－15細(xì)胞出現(xiàn)80%細(xì)胞病變時收毒。

1.5 病毒DNA 提取

根據(jù)TaKaRa 公司Universal Genomic DNA Extraction Kit試劑盒說明書，分別提取PRV 容A株、PRV 疫苗株、PPV 及PCV2病毒基因組DNA，直接用于PCR 反應(yīng)。

1.6 單重PCR 方法的建立

以PRV容A 株DNA 為模板，分別用gE、gB特異性引物進行PCR 擴增。PCR 程序：94℃5 min；94℃1min，62℃50s，72℃1min，33個循環(huán)；72 ℃10min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產(chǎn)物片段大小正確的目的基因連接至pMD18－T載體中，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.7 雙重PCR 方法的建立

在單重PCR 擴增反應(yīng)的基礎(chǔ)上，將PRV gE和gB特異性引物對加入同一PCR 反應(yīng)體系中，分別對雙重PCR 反應(yīng)體系中的引物濃度、退火溫度、模板量、dNTP濃度等條件進行優(yōu)化，篩選出用于雙重PCR 擴增的最佳反應(yīng)體系和程序。

1.8 特異性試驗

分別以PRV 細(xì)胞毒株、PRV 疫苗毒株、PCV2及PPV 的DNA 和HP－PRRSV、CSFV 的cDNA 為模板進行PCR 反應(yīng)，同時以PK－15 正常細(xì)胞為陰性對照，以驗證該方法的特異性。

圖1 雙重PCR 擴增結(jié)果Fig.1 Amplification result of the duplex PCR

1.9 敏感性試驗

用Thermo 多功能酶標(biāo)儀對PRV 細(xì)胞毒的DNA 濃度進行測定，然后將其10倍倍比稀釋后作為模板，采用優(yōu)化后的擴增條件進行雙重PCR 擴增，檢測其敏感性。

1.10 臨床樣品的檢測

利用建立的雙重PCR 方法，對2014年龍巖學(xué)院動物醫(yī)學(xué)研究所送檢的20份疑似PRV 感染豬組織樣品（腦、淋巴結(jié)、脾臟、肺等）進行應(yīng)用檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴增結(jié)果和產(chǎn)物特異性分析

用gE和gB相應(yīng)的引物對進行單一擴增和雙重擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示（圖1），PRV 容A株可觀察到400bp（gE）和582bp（gB）條帶，HB－98及Bartha－K61疫苗株僅有一條582bp（gB）的條帶，大小與預(yù)期相符，陰性對照沒有擴增出條帶。說明建立的該PCR 方法能夠區(qū)分PRV 野毒株和疫苗弱毒。同時，將目的基因PCR產(chǎn)物連接至pMD18－T 載體中進行測序鑒定，結(jié)果表明序列結(jié)果與GenBank中登錄的PRV gE和gB基因序列一致。

2.2 雙重PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化

對PRV gE 和gB 基因的引物濃度、PCR 擴增溫度及dNTP 濃度等進行了優(yōu)化。最終確定的雙重PCR 反應(yīng)25μL體系為：DNA 模板1μL、2×GC Buffer I 12.5μL、dNTP（2.5mmol／L）4μL、上下游引物各（20pmol／L）1μL、LA Taq酶（5 U／μL）0.25μL，用ddH2O 補至25μL。最佳退火溫度為62 ℃（圖2），最終確定雙重PCR 反應(yīng)程序：94 ℃5 min；94 ℃1min，62 ℃50s，72 ℃1min，35個循環(huán)；72 ℃10min。

圖2 雙重PCR 不同退火溫度的擴增結(jié)果Fig.2 Amplification result of the duplex PCR at different annealing temperature

2.3 雙重PCR 反應(yīng)的特異性

用gE和gB特異性引物分別對PRV 細(xì)胞毒、疫苗毒、PCV2、PPV 的DNA 和HP－PRRSV、CSFV 的cDNA 進行PCR 反應(yīng)，以PK－15正常細(xì)胞為陰性對照。結(jié)果顯示，僅PRV 容A 株和分離株可擴增出gE和gB基因的兩條特異性條帶，HB－98和Bartha－K61疫苗株僅擴增出一條gB基因的特異性條帶，而其他均未擴增出明顯條帶（圖3）。

2.4 雙重PCR 反應(yīng)的敏感性

采用優(yōu)化后的雙重PCR 擴增條件來擴增10倍倍比稀釋的PRV 容A 株DNA，進行雙重PCR 反應(yīng)。結(jié)果顯示，當(dāng)模板量為1pg 時，PCR 擴增的目的條帶不清晰，模板量為10pg時，雙重PCR 擴增能夠獲得清晰的目的條帶（圖4）。因此，該PCR 方法檢測PRV DNA 的下限為10pg／μL。

圖3 雙重PCR 特異性試驗Fig.3 Specificity test of the duplex PCR

圖4 雙重PCR 敏感性試驗Fig.4 Sensitivity test of the duplex PCR

2.5 臨床樣品檢測結(jié)果

應(yīng)用建立的雙重PCR 方法，對2014年龍巖學(xué)院動物醫(yī)學(xué)研究所送檢的20份疑似PRV 感染豬組織樣品（腦、淋巴結(jié)、脾臟、肺等）進行應(yīng)用檢測，結(jié)果顯示，PRV 疑似感染病料中8份為PRV 野毒感染，僅3份為疫苗接種感染。用單重和雙重PCR 方法分別檢測來證明其準(zhǔn)確性，雙重PCR 檢測的結(jié)果與單一PCR 檢測結(jié)果總體符合率為100%，該方法可用于臨床病料檢測。

3 討論

目前，豬偽狂犬病疫情形勢嚴(yán)峻，我國許多使用PRV 基因缺失活疫苗免疫的規(guī)?；i場出現(xiàn)了豬狂犬病流行，且發(fā)病特點和流行形勢也發(fā)生了變化［14］。研究表明，與以前的流行株相比，PRV 新流行株的抗原性已發(fā)生變異，進而導(dǎo)致現(xiàn)有疫苗不能提供完全保護，從而增加了該病的防控難度［4－5，7］。因此，建立一種快速、高效、靈敏的PRV 野毒感染病原學(xué)檢測方法，對于豬偽狂犬病的分子流行病學(xué)調(diào)查及早期的預(yù)防和治療等都具有重要意義。

我國主要通過接種基因缺失疫苗來預(yù)防和控制偽狂犬病。由于gE基因缺失疫苗在病毒侵入神經(jīng)系統(tǒng)方面被認(rèn)為比其它單個非必需糖蛋白缺失苗更安全，同時gE 基因缺失不會影響病毒的復(fù)制和中和抗體的產(chǎn)生，gE 又是所有野毒株均表達的一類糖蛋白［15］。因此，gE 可作為標(biāo)志基因，區(qū)別感染動物和疫苗接種動物［16］。目前，我國大部分區(qū)域均使用gE基因缺失疫苗防控豬偽狂犬病，本研究依據(jù)針對PRV 基因缺失疫苗不含毒力基因gE 只含有表面抗原基因gB，而PRV 野毒既含有毒力基因gE又含有表面抗原基因gB 的特性建立了一種快速鑒別豬偽狂犬病毒野毒和gE 基因缺失疫苗毒感染的雙重PCR 方法。通過對gE和gB 引物濃度和雙重PCR 退火溫度等進行優(yōu)化，最終確定的雙重PCR反應(yīng)條件，能夠?qū)δ康钠蝕E 和gB進行有效地擴增。敏感性試驗結(jié)果表明，所建立的方法可檢測的目的基因最低核酸拷貝數(shù)均為10pg／μL。重復(fù)性試驗結(jié)果顯示雙重PCR 方法3次重復(fù)檢測試驗結(jié)果均完全一致，可以滿足臨床樣品檢測的需要。對2014年龍巖學(xué)院動物醫(yī)學(xué)研究所送檢的20 份疑似PRV 感染豬組織樣品進行檢測結(jié)果表明，陽性檢出率與發(fā)病豬的臨床癥狀、剖檢病化和病毒分離與鑒定結(jié)果均具有較高的符合率，說明本試驗所建立的雙重PCR 檢測方法具有靈敏度高、重復(fù)性好、特異性強的特點，可以用于豬偽狂犬病的流行病學(xué)調(diào)查和進行PRV 野毒感染的快速確診。

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