牦牛10個(gè)STR基因座遺傳多態(tài)性研究

楊啟林，張 君，徐尚榮，彭 巍，王志強(qiáng)

（1.青海大學(xué)，青海西寧810016；2.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海西寧810016）

我國(guó)牦牛的數(shù)量約占世界牦?？倲?shù)的95%以上［1］，多年以來牦牛的育種工作由于各種原因開展不順利，缺乏可靠穩(wěn)定的分子遺傳標(biāo)記是重要的原因之一。微衛(wèi)星標(biāo)記（microsatellite），又稱為短串聯(lián)重復(fù)序列，是以2～6個(gè)核苷酸為基本重復(fù)單位的串聯(lián)重復(fù)序列［2－3］。微衛(wèi)星作為第二代分子標(biāo)記，以其較高的多態(tài)性及簡(jiǎn)便的操作，能夠滿足一般實(shí)驗(yàn)室對(duì)遺傳研究的要求，而得到較為廣泛的應(yīng)用［4－5］，現(xiàn)已被用于種群遺傳結(jié)構(gòu)分析、系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系分析及保種效果檢測(cè)等方面［6－8］。目前將牦牛自身基因組微衛(wèi)星標(biāo)記應(yīng)用于牦牛群體遺傳的報(bào)道較少［9］，研究人員只能利用普通牛的微衛(wèi)星序列分析牦牛的群體遺傳結(jié)構(gòu)特征和系統(tǒng)分類［10－13］。

本研究選用聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）和國(guó)際動(dòng)物遺傳學(xué)會(huì)（ISAG）聯(lián)合推薦的用于牛遺傳分析的9個(gè)Holstein奶牛微衛(wèi)星基因座和自選的一個(gè)微衛(wèi)星基因座對(duì)68個(gè)牦牛樣本的遺傳多樣性指征進(jìn)行分析，旨在初步揭示牦牛核基因組的遺傳多樣性水平。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

抽取68 份牦牛血液樣本，用EDTA 抗凝后－20 ℃冷凍保存。

1.2 主要試劑與儀器

10×PCR buffer、dNTP、Marker、核酸染料、均購(gòu)于上海生工生物工程有限公司；高速離心機(jī)購(gòu)自上海HEAL FORCE 公司；PCR 儀（My－Cycle TM Thermal Cycler）購(gòu)自美國(guó)BTO－RAD公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA 抽提 采用TIANamp Blood DNA Kit試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司），按照說明書操作進(jìn)行，－20 ℃冷凍保存。

1.2.2 PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系：PCR 體系總體積為25μL，2×PCR Master緩沖液12.5μL，上下引物各0.6μL，DNA 模板1 μL，超純水10.5μL，采用PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增。各STR 基因座的擴(kuò)增條件為：94 ℃變性10min，退火30s，72 ℃延伸45s，共擴(kuò)增35～40 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)后，送往北京優(yōu)博蘭基因技術(shù)公司進(jìn)行基因分型，得到微衛(wèi)星位點(diǎn)基因型并建立數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2.3 微衛(wèi)星標(biāo)記與引物 采用了10個(gè)微衛(wèi)星基因座用于牦牛微衛(wèi)星的基因座篩選，其中9個(gè)基因座（ETH10、ETH225、BM1818、BM1824、IL－STS006、CSSM66、HEL9、TGLA53、TGLA126）是根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）和國(guó)際動(dòng)物遺傳學(xué)會(huì)（ISAG）聯(lián)合推薦的用于牛遺傳分析的Holstein奶牛微衛(wèi)星基因座，另外一個(gè)基因座（ILST0013）是根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)提供的微衛(wèi)星，由上海生工生物公司合成10對(duì)引物，加入FAM 熒光標(biāo)記，引物序列見表1。

表1 所用STR 基因座及引物序列Table 1 Objective STR and their primer sequences

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 用Cervus2.0利用基因型數(shù)據(jù)庫(kù)，通過模擬親子關(guān)系及對(duì)父母本相似性的分析得到每個(gè)位點(diǎn)的等位基因頻率、雜合度、多態(tài)信息含量（PIC）等遺傳學(xué)指標(biāo)［14］，同時(shí)進(jìn)行Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)。多態(tài)性能夠反映物種的進(jìn)化歷史，群體中頻率最高的等位基因是該物種中最原始、最保守的基因座。期望雜合度是理論計(jì)算得出的雜合度，觀望雜合度是隨機(jī)抽取的兩個(gè)樣本的等位基因不相同的頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因分型

采用熒光標(biāo)記技術(shù)對(duì)微衛(wèi)星PCR 產(chǎn)物進(jìn)行分析，圖1～3顯示了部分位點(diǎn)的熒光信號(hào)檢測(cè)等位基因片段大小的自動(dòng)判別結(jié)果。INRA037位點(diǎn)的等位基因大小分別為124.06和132.42bp（圖1）；ILST0013位點(diǎn)的等位基因大小分別為121.53 和127.29bp（圖2）；TGLA53位點(diǎn)的等位基因大小分別為153.80和155.86bp（圖3）。

2.2 等位基因個(gè)數(shù)及頻率

圖1 INRA037位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳信號(hào)Fig.1 Electrophoreses signal about amplification products of INRA037site

分析68頭牦牛10個(gè)STR 基因座等位基因個(gè)數(shù)及頻率分布規(guī)律。由表2可知，TGLA53位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)有16個(gè)等位基因，基因片段大小在151～273bp之間，該等位基因的基因頻率范圍在0.0074～0.2426。INRA037位點(diǎn)有14 個(gè)等位基因，基因片段大小在119～134bp之間，該等位基因的基因頻率范圍在0.0074～0.3971。ILST0013 位點(diǎn)有11個(gè)等位基因，基因片段為117～138bp。其等位基因的基因頻率范圍為0.0109～0.4485。ETH225、ETH10、BM1824、CSSM66 四個(gè)位點(diǎn)有10 個(gè)等位基因，基因片段大小分別為133～150bp、209～236 bp、178～263bp、173～190bp。各等位基因的基因頻率范圍為0.0075～0.2612、0.0074～0.2941、0.0161～0.5597、0.0100～0.3235。BM1818 位點(diǎn)等位基因片段大小為252～260bp，基因頻率為0.0278～0.4722；TGLA126 位點(diǎn)等位基因片段大小為119～134 bp，等位基因頻率為0.0100～0.3300；LSTS006位點(diǎn)等位基因片段大小為27～291bp，等位基因頻率為0.0217～0.4348。

2.3 Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)

利用Cervus 2.0對(duì)10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的Hardy－Weinberg 進(jìn)行平衡檢驗(yàn)［15］，檢測(cè)結(jié)果顯示：BM1824、ILSTS006呈極顯著偏離平衡狀態(tài)（P＜0.01），TGLA53、BM1818檢測(cè)未完成。

圖2 ILST0013位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳信號(hào)Fig.2 Electrophoreses signal about amplification products of ILST0013site

圖3 TGLA53位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳信號(hào)Fig.3 Electrophoreses signal about amplification products of TGLA53site

2.4 雜合度和多態(tài)信息含量

由表3 可見，10 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的PIC 值在0.367～0.849之間變動(dòng)，平均值為0.685。平均多態(tài)信息含量在0.5以上，均為高度多態(tài)性標(biāo)記，表明基因變異較大，遺傳多樣性豐富；同時(shí)也表明本研究所選用的微衛(wèi)星標(biāo)記均能提供較好的遺傳信息，可以反映牦牛的遺傳多樣性。牦牛的不同微衛(wèi)星位點(diǎn)的觀察雜合度平均為0.7995；期望雜合度的變動(dòng)范圍為0.333～0.868，平均期望雜合度為0.6154，屬于高度雜合標(biāo)記和高度雜合種群，較高的微衛(wèi)星標(biāo)記雜合度表明該標(biāo)記所能提供的遺傳信息量大，較高的種群雜合度表明種群的遺傳多樣性豐富［16］。

3 討論

3.1 牦牛種群遺傳多樣性

微衛(wèi)星標(biāo)記是反映DNA 結(jié)構(gòu)多樣性的分子遺傳標(biāo)記之一。一個(gè)群體或物種的遺傳多樣性越高或遺傳變異越豐富，其對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強(qiáng)，越容易擴(kuò)展其分布范圍和適應(yīng)新的環(huán)境。遺傳雜合度反映了一個(gè)群體中某個(gè)等位基因被抽取的前提下，其他等位基因被抽取組成雜合子的條件概率［17］。平均雜合度的大小可反映遺傳結(jié)構(gòu)變異程度的高低，雜合度越高說明該群體內(nèi)遺傳變異越大，遺傳多樣性也豐富；反之則群體內(nèi)的遺傳變異就小，遺傳多樣性匱乏。Jurg［18］將多態(tài)位點(diǎn)定義為遺傳雜合度至少為0.10 的位點(diǎn)。耿巖等［19］對(duì)中國(guó)蒙系6個(gè)綿羊品種分析表明平均遺傳雜合度在0.8208～0.9336之間。此次分析的10 個(gè)位點(diǎn)中，平均期望雜合度（Mean He）為0.6154，低于麥洼牦牛的平均期望雜合度（0.800）［20］，牦牛種群遺傳多樣性較低，影響牦牛后期的發(fā)展和壯大，加大牦牛種群的保護(hù)力度是今后工作的一大重點(diǎn)。

3.2 遺傳標(biāo)記多態(tài)性分析

目前微量遺傳樣性的3個(gè)重要指標(biāo)是平均多態(tài)

信息含量、平均雜合度和平均有效等位基因數(shù)，各參數(shù)在一定范圍內(nèi)數(shù)值越高，說明該群體的遺傳樣性也越高。楊章平等［21］利用7個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記揭示湖羊的平均PIC 為0.9024；柴文瓊等［22］對(duì)甘肅地區(qū)的小尾寒羊群體進(jìn)行分析，其PIC 為0.8293。李利等［23］利用5 個(gè)微衛(wèi)星基因座對(duì)四川地方品種進(jìn)行遺傳多樣性研究，結(jié)果表明所選微衛(wèi)星在地方山羊群體中遺傳多樣性豐富。本研究中，10個(gè)基因座的平均PIC為0.685，ILSTS006和BM1824為中度多態(tài)基因座，其余均為高度多態(tài)基因座；平均光合度為0.6154，平均等位基因數(shù)為10.2，這10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均能反映本研究牦牛群體內(nèi)豐富的遺傳多態(tài)性，選育提高的潛力較大。

表2 牦牛10個(gè)STR 基因座基因頻率分布Table 2 Allele frequency of 10STR Loci in yak

本試驗(yàn)進(jìn)行Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示ILSTS006和BM1824處于不平衡狀態(tài)，其原因可能是由于長(zhǎng)期的人工繁殖過程中，人為選擇作用所造成的基因型和基因頻率的改變。

表3 10個(gè)位點(diǎn)的雜合度、多態(tài)信息含量和Hardy－Weinberg平衡Table 3 Heterozygosity，polymorphism information content and Hardy－Weinberg of 10STR Loci

3.3 銀染法和DNA 自動(dòng)測(cè)序儀檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比

在微衛(wèi)星位點(diǎn)等位基因分型過程中利用銀染法和DNA 自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。DNA自動(dòng)測(cè)序儀比銀染法得到的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，客觀，速度快，操作方便，但是比較貴。DNA 自動(dòng)測(cè)序儀是用專用軟件進(jìn)行基因型的識(shí)別，加上專用的Mark使得收集數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。而銀染需要人工進(jìn)行染色處理，條帶清晰度遠(yuǎn)沒有DNA 測(cè)序儀所采集的圖像清晰，同時(shí)在讀取條帶時(shí)受人為主觀影響很大，同樣的數(shù)據(jù)不同人處理會(huì)得到不同的結(jié)果。在同樣的檢測(cè)中DNA 測(cè)序儀進(jìn)行分析所使用模板是銀染法的三分之一，前期可以利用銀染法進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)篩選，后期利用DNA 測(cè)序儀進(jìn)行群體數(shù)據(jù)分析。

4 結(jié)論

本研究所分析的10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，平均期望雜合度為0.6154，多態(tài)信息含量較高，顯示出豐富的遺傳多樣性和較高的選擇潛力。其中兩個(gè)位點(diǎn)處于不平衡狀態(tài)，可能的原因：母子關(guān)系記錄不準(zhǔn)確，父本局限在6頭公牦牛，導(dǎo)致群體內(nèi)公母牛比例較大而使整體的近交程度較高，造成了某些基因的頻繁出現(xiàn)。目前微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記在牦牛上的研究較少，用于牦牛的檢測(cè)位點(diǎn)較少，因此試驗(yàn)存在一定的誤差，有待進(jìn)一步改進(jìn)。

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