星形膠質細胞對天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶介導β淀粉樣蛋白早期突觸毒性作用的影響

呂昂初，宋一志，張亞麗，李彥，方圓，陸濤，劉津平，常麗榮，武艷

血管性癡呆(vascular dementia，VaD)是由于缺血或出血性腦血管疾病以及腦缺血、缺氧引起的認知功能障礙。血腦屏障的損傷在VaD的發(fā)生及發(fā)展中有著重要的作用。血腦屏障是存在于腦組織和血液之間的一個復雜的系統(tǒng)，控制血腦兩側的物質運輸，從而保證中樞神經系統(tǒng)內環(huán)境的相對穩(wěn)定[1]。星形膠質細胞(astrocyte，AS)是中樞神經系統(tǒng)的管家細胞，AS不但參與代謝物質的轉移，釋放神經營養(yǎng)因子，信號轉導等，它還參與血腦屏障的形成[2]。已有研究結果表明VaD的病理機制中涉及AS的改變和炎性因子的分泌，并且毒性物質β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)參與了VaD的發(fā)生發(fā)展[3-5]。本課題組前期研究已證實caspase參與介導了Aβ所誘導的神經元早期突觸毒性作用[6]。但AS是否對caspase介導的Aβ毒性作用有影響尚不明確。本研究沿用以往研究選取Aβ作用1 h為早期突觸毒性的時間點[6]，應用免疫熒光方法，通過檢測不同培養(yǎng)體系中［純神經元體系（NE-S）及混合培養(yǎng)體系（MIX-S）］，以特異性caspase-8/9抑制劑分別干預死亡受體/線粒體通路后對Aβ所誘導的突觸后密度蛋白（postsynaptic density-95，PSD95）表達變化的影響，從而探討AS對caspase介導Aβ早期突觸毒性作用的影響，為深入研究VaD的發(fā)病機制提供理論基礎。

1 對象和方法

1.1 研究對象 選用出生后4 d的Wistar清潔級大鼠（由北京華阜康生物科技公司提供），不分雌雄。

1.2 研究方法

1.2.1 建立海馬細胞原代混合培養(yǎng)體系（MIX-S），將研究對象低溫麻醉，于4℃解剖液中，在尸體解剖鏡下分離海馬，并機械切碎，加0.05%胰蛋白酶于37℃水浴搖床中震蕩消化10 min，加入培養(yǎng)液，即含胰蛋白酶抑制劑和2%神經細胞生長添加劑（B27）的神經基礎無血清培養(yǎng)基（Neurobasal-A）終止消化。電動移液器反復吹打使組織分散為單細胞，1000轉/分離心使未打散的組織沉淀，0.22 μm細胞篩網(wǎng)過濾收集上清，重復上述步驟。所得上清離心，離心后棄上清，加37℃培養(yǎng)液吹打成單細胞懸液，配制不同濃度的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）培養(yǎng)液進行梯度密度離心后，去除含細胞碎片的上清液，加2 ml培養(yǎng)液重新吹打成細胞懸液。細胞計數(shù)，75 cm2培養(yǎng)瓶內差速貼壁30 min，調整細胞密度至400×106/L，種于多聚右旋賴氨酸（Poly-DLysine，PDL）包被的小玻片上，30 min后加入含0.1 mg/ml卡那霉素、1 mg/ml谷氨酰胺替代物（glutamax）、10 ng/ml纖維原細胞基礎生長因子（fibroblast growth factor-basic，bFGF）的Neurobasal-A培養(yǎng)液，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔2 d半量換培養(yǎng)液1次，于第7天細胞狀態(tài)良好時用于實驗。

1.2.2 建立海馬原代神經元純化培養(yǎng)體系（NE-S） 前期種植細胞步驟同1.2.1，根據(jù)AS的生長曲線特點，于細胞開始種植18～24 h在培養(yǎng)液內加入5 μmol/L終濃度的阿糖胞苷，抑制AS的增殖，以后每隔2 d半量換培養(yǎng)液1次，于第7天細胞狀態(tài)良好時用于實驗。

1.2.3 分組處理 第7天用40 μmol/L的caspase-8抑制劑（Z-IETD-FMK）和caspase-9抑制劑（Z-LEHD-FMK）分別處理NE-S和MIX-S的caspase-8抑制劑組、caspase-9抑制劑組、caspase-8抑制劑預處理加Aβ組及caspase-9抑制劑預處理加Aβ組，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育1 h；接著用10 μmol/L的Aβ25-35分別處理NE-S和MIX-S的Aβ處理組、caspase-8抑制劑預處理加Aβ組及caspase-9抑制劑預處理加Aβ組，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育1 h。

1.2.4 免疫細胞化學染色 加藥處理后的細胞用4%多聚甲醛固定10 min，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌后，加入含0.3%聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）的PBS穿透20 min，馬血清封閉液（含5%正常馬血清的PBST）封閉20 min，加入一抗PSD95（1∶200）常溫孵育2 h后入4℃冰箱過夜。PBS洗滌后加入熒光二抗，避光常溫孵育2 h，PBS洗滌，細胞核熒光染料（Hoechst 33342）復染細胞核，封片觀察。

1.2.5 圖像采集及統(tǒng)計學分析 隨機挑選形態(tài)完整的陽性神經元，熒光顯微鏡100倍油鏡下攝取細胞圖片，以Photoshop圖像分析軟件定量分析，每個神經元選取1～2個樹突，計數(shù)近胞體10 μm段樹突上PSD95陽性表達量，共計數(shù)30個以上神經元。計數(shù)樣本至少來自5次獨立實驗（n=5）。實驗數(shù)據(jù)經SPSS 13.0軟件統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布，以（表示，采用方差分析做整體差異比較，如有統(tǒng)計學意義，各組之間采用LSD-t檢驗進行多重比較，檢驗標準α=0.05，P＜0.05差異有顯著性。

2 結果

2.1 NE-S各組PSD95表達情況 在NE-S各組，整體差異比較有顯著性（F=9.53，P＜0.001）。進一步兩兩比較顯示：caspase-8抑制劑組（P=0.95）、caspase-9抑制劑組（P=0.98）與對照組相比，PSD95的表達量無明顯變化；Aβ處理組與對照組相比PSD95的表達量降低，有顯著差異（P＜0.001）；caspase-8抑制劑預處理加Aβ組與Aβ處理組相比PSD95的表達量無明顯變化（P=1.00），與對照組相比則降低，有顯著差異（P＜0.001）；caspase-9抑制劑預處理加Aβ組與Aβ處理組相比PSD95表達量回升，有顯著差異（P＜0.001），與對照組相比則無明顯變化（P=0.97）（圖1）。

圖1 NE-S各組PSD95表達的免疫熒光圖及統(tǒng)計結果

2.2 MIX-S各組PSD95表達情況 在MIX-S組，整體差異比較有顯著性（F=8.58，P＜0.001）。進一步兩兩比較顯示caspase-8抑制劑組（P=0.92）、caspase-9抑制劑組（P=0.84）與對照組相比，PSD95的表達量無明顯變化；Aβ處理組與對照組相比PSD95的表達量降低，有顯著差異（P＜0.001）；caspase-8 抑制劑預處理加Aβ組與Aβ處理組相比PSD95的表達量升高，有顯著差異（P＜0.001），與對照組相比則無明顯變化（P=0.99）；caspase-9抑制劑預處理加Aβ組與Aβ處理組相比PSD95表達量無明顯變化（P=0.90），與對照組相比則降低，有顯著差異（P＜0.001）（圖2）。

2.3 MIX-S與NE-S相比，各組PSD95表達情況 與NE-S相比，MIX-S對照組（P=0.98）、caspase-8抑制劑組（P=0.96）、caspase-9抑制劑組（P=0.84）和Aβ處理組（P=0.37）PSD95的表達量無顯著變化；MIX-S caspase-8抑制劑預處理加Aβ組，PSD95的表達顯著高于NE-S組（P＜0.001），MIX-S caspase-9抑制劑預處理加Aβ組PSD95的表達量顯著低于NE-S組（P＜0.001）（圖3）。

3 討論

隨著人口老齡化，老年癡呆的發(fā)病率與患病率逐年上升，給社會帶來了極大的負擔。VaD是老年癡呆的重要類型，發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，而VaD可與AD并存并加重AD病情，故對于VaD的研究迫在眉睫[3，7]。有研究者發(fā)現(xiàn)，AD患者多數(shù)伴有腦血管病變，腦血管疾病可以影響Aβ的積聚[8]，Aβ亦可導致血管收縮、增加腦組織缺血易損性[9-10]。另有研究報道，伴隨著Aβ濃度的變化，海馬區(qū)神經元丟失可成為VaD發(fā)生的病理基礎[5，11]。眾所周知，caspase通路主要有內源性的caspase-9所介導的線粒體通路和外源性的caspase-8所介導的死亡受體通路[12-14]。近年來研究結果表明，在神經突觸明顯丟失之前即可觀察到認知功能障礙，且突觸功能的改變發(fā)生于VaD疾病進程早期，即神經元未發(fā)生大量凋亡時[15-18]。突觸蛋白的表達變化可反映突觸功能的改變，本課題組以往研究已證實，Aβ在尚未誘導顯著神經元凋亡的早期毒性作用中可誘導神經元的PSD95表達減少，且caspase參與介導了Aβ所誘導的神經元早期突觸毒性作用[6]。因此本實驗沿用突觸標志蛋白PSD95作為觀察指標。

圖2 MIX-S各組PSD95表達的免疫熒光圖及統(tǒng)計結果

圖3 NE-S與MIX-S各組PSD95表達量組間比較結果

本實驗中，caspase-8/9的特異性抑制劑，可以分別有效地阻斷死亡受體通路和線粒體通路。對細胞進行單純的caspase-8/9抑制劑處理，與對照組相比PSD95的表達量并未發(fā)生變化，證實caspase-8/9抑制劑自身對突觸沒有毒性作用。在NE-S中，caspase-9抑制劑可顯著緩解Aβ引起的PSD95減少，而caspase-8抑制劑并無顯著影響。該結果提示在NE-S，Aβ所誘導的早期突觸毒性中，caspase-9所介導的線粒體通路被激活，而caspase-8介導的死亡受體通路未參與其中，從而提示NE-S的海馬神經元在Aβ早期突觸毒性中發(fā)生了線粒體功能損傷；而在MIX-S則相反，提示AS的存在使得Aβ突觸毒性作用機制發(fā)生改變，并證實AS對caspase介導Aβ早期突觸毒性作用確有影響。但AS影響Aβ早期突觸毒性作用的直接方式尚不明確。在中樞神經系統(tǒng)中，AS始終伴隨神經元的整個發(fā)育過程，具有復雜而多樣的功能。AS參與神經元物質代謝、突觸可塑性調控和信號轉導等功能，且與神經元損傷過程密切相關[19-20]。本課題組前期研究結果提示，Aβ作用24 h，AS參與保護Aβ誘導的海馬神經元凋亡[21]。并且AS具有對Aβ酶切降解的能力，在Aβ清除中發(fā)揮重要作用[22-23]。近幾年研究者發(fā)現(xiàn)，AS還可分泌可溶性的炎癥因子，加速Aβ神經毒性作用[24-25]；且在單純AS系統(tǒng)中，Aβ刺激下的AS不僅失去保護功能，還可釋放促凋亡物質[21]。在VaD患者腦中，TNF的表達量明顯增加[3]。針對AS在Aβ誘導的神經毒性中作用不同的觀點，結合兩種不同的培養(yǎng)體系，本次研究結果揭示，由caspase-9所介導的線粒體通路在AS缺失的NE-S被激活，而在MIX-S無顯著影響，提示AS可能是通過保護線粒體來干預Aβ早期突觸毒性作用；有趣的是，由caspase-8所介導的死亡受體通路在AS缺失的NE-S未被激活，在AS存在的MIX-S被激活，提示AS的存在可能促使某種死亡受體配體分泌（如TNF），進而激活caspase-8所介導的死亡受體通路來參與Aβ早期突觸毒性作用。

VaD進程中，Aβ濃度在腦內表達增加，而在血液中反而降低[5]。并且在AD中，Aβ毒性作用下，神經元未發(fā)生顯著凋亡時，除突觸功能發(fā)生改變外，線粒體功能也發(fā)生了變化，Aβ可通過與線粒體相結合導致神經元損傷[26-27]。結合本研究NE-S中線粒體通路被激活，這一機制也可能是VaD中神經元顯著損傷的原因之一。本實驗中AS作為一把雙刃劍，扮演著不同角色。在VaD進程中，AS均有增生并發(fā)生形態(tài)改變以及TNF的表達量增加，且TNF的表達和AS的反應有相關性[3，24-25]，提示VaD的發(fā)病機制非常復雜。AS在Aβ早期突觸毒性作用的影響是否具有動態(tài)變化有待進一步研究，同時我們推測可能是AS釋放了TNF進而激活死亡受體通路，亦待深入探索。AS在VaD病理進程中扮演著重要的角色，一系列的研究將為發(fā)現(xiàn)VaD的早期診斷、治療的新靶點提供重要的理論依據(jù)。

1 溫澤鋒, 姜平, 童鑫康. 血腦屏障與血管性癡呆的研究進展[J]. 國外醫(yī)學(老年醫(yī)學分冊), 2007, 28:211-216.

2 胡瀟, 余涓. 星形膠質細胞在血腦屏障與神經元損傷中的作用[J]. 神經解剖學雜志, 2012, 28:330-334.

3 景玉紅, 宋焱峰, 王子仁. 血管性癡呆大鼠星形膠質細胞增生與TNF-α的表達[J]. 中華神經醫(yī)學雜志, 2004,3:418-421.

4 梁國聰, 石勝良, 畢桂南, 等. β淀粉樣蛋白和tau蛋白在血管性癡呆發(fā)病機制中的作用[J]. 廣西醫(yī)科大學學報,2011, 28:661-664.

5 承歐梅, 鐘世江, 宴勇, 等. 腦卒中和血管性癡呆β淀粉樣蛋白測定及臨床意義[J]. 重慶醫(yī)學, 2004, 33:555-556.

6 Liu JP, Chang LR, Francesco R, et al. Amyloid-β induces caspase-dependent loss of PSD-95 and synaptophysin through NMDA receptors[J]. J Alzheimers Dis, 2010, 22:541-556.

7 邵福源, 黃流清, 薛紅, 等. 血管性癡呆研究[J]. 中國臨床神經科學, 2001, 9:92-95.

8 Sudduth TL, Weekman EM, Brothers HM, et al.β-amyloid deposition is shifted to the vasculature and memory impairment is exacerbated when hyperhomocysteinemia is induced in APP/PS1 transgenic mice[J]. Alzheimers Res Ther, 2014, 6:32-32.

9 周愛紅, 王蔭華. 阿爾茨海默病與血管性危險因素[J].中華老年心血管病雜志, 2005, 7:65-67.

10 趙萬紅, 羅超. 阿爾茨海默病與腦缺血的相互作用[J].中國老年學雜志, 2013, 33:5206-5209.

11 藺心敬, 李呂力, 楊德剛, 等. 血管性癡呆大鼠海馬神經元凋亡和蛋白表達實驗研究[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2007, 17:2326-2329.

12 Li P, Nijihawan D, Budihardjo I, et al. Cytochrome C dATP-dependent formation of Apaf-1/easpase-9 complex initiates an apoptoic protease cascade[J].Cell, 1997, 91:479-489.

13 Budihardjo I, Oliver H, Lutter M, et al. Biochemical of Bid by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis[J]. Annu Rev Cell Del Bio, 1999, 15:269-290.

14 Ashkenazi A, Dixit VM. Death receptors:signaling and modulation[J]. Science, 1998, 281:1305-1308.

15 Tiraboschi P, Hansen LA, Alford M, et al. The decline in synapses and cholinergic activity is asynchronous in Alzheimer's disease[J]. Neurology, 2000, 55:1278-1283.

16 Scheff SW, Price DA, Schmitt FA, et al. Hippocampal synaptic loss in early Alzheimer's disease and mild cognitive impairment[J]. Neurobiol Aging, 2006,27:1372-1384.

17 G?tz J, Ittner LM, Schonrock N, et al. An update on the toxicity of Abeta in Alzheimer's Disease[J].Neuropsychiatr Dis Treat, 2008, 4:1033-1042.

18 王菲. 血管性癡呆的分子機制及治療學研究進展[J].中國神經精神疾病雜志, 2014, 40:317-320.

19 Allaman I, Bélanger M, Magistretti PJ. Astrocyteneuron metabolic relationships:for better and for worse[J]. Trends Neurosci, 2011, 34:76-87.

20 Takuma K, Baba A, Matsuda T. Astrocyte apoptosis:implications for neuroprotection[J]. Prog Neurobiol, 2004, 72:111-127.

21 宋一志, 高香紅, 常麗榮, 等. 星形膠質細胞對β-淀粉樣蛋白誘導神經元凋亡的影響[J]. 神經解剖學雜志,2013, 29:108-114.

22 Nielsen HM, Mulder SD, Beli?n JA, et al. Astrocytic A beta 1-42 uptake is determined by A beta-aggregation state and the presence of amyloid-associated proteins[J]. Glia, 2010, 58:1235-1246.

23 Dorfman VB, Pasquini L, Riudavets M, et al.Differential cerebral deposition of IDE and NEP in sporadic and familial Alzheimer's disease[J].Neurobiol Aging, 2010, 31:1743-1757.

24 Garwood CJ, Pooler AM, Atherton J, et al. Astrocytes are important mediators of Aβ-induced neurotoxicity and tau phosphorylation in primary culture[J]. Cell Death Dis, 2011, 167:1-9.

25 Qin H, Benveniste EN. ELISA methodology to quantify astrocyte production of cytokines/chemokines in vitro[J]. Methods Mol Biol, 2012,814:235-249.

26 Reddy PH, Manczak M, Mao P, et al. Amyloidbeta and mitochondria in aging and Alzheimer's disease:implications for synaptic damage and cognitive decline[J]. J Alzheimers Dis, 2010, 20:499-512.

27 Lustbader JW, Cirilli M, Lin C, et al. ABAD directly links Abeta to mitochondrial toxicity in Alzheimer's disease[J]. Science, 2004, 304:448-452.