氧化應(yīng)激對(duì)動(dòng)物腸道損傷及硫辛酸干預(yù)作用的研究進(jìn)展

■ 鮑偉光 王占彬 顧憲紅 郝 月 崔艷軍

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽 471003）

生物體在代謝過程中，會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，這些自由基通常不會(huì)導(dǎo)致組織細(xì)胞的損傷，機(jī)體自身依靠體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)，主要包括抗氧化酶類和非酶類的抗氧化劑，可以保護(hù)機(jī)體組織和細(xì)胞，防止自由基造成的損傷[1-4]。當(dāng)機(jī)體細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的自由基的水平高于細(xì)胞的抗氧化防御能力時(shí)，氧化還原狀態(tài)失衡，過量的自由基存在于組織或細(xì)胞內(nèi)，即誘發(fā)氧化應(yīng)激，并導(dǎo)致氧化損傷[5]。器官和組織對(duì)氧化應(yīng)激的易感性依賴于它的抗氧化系統(tǒng)的狀態(tài)和氧化與抗氧化在細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡。

腸道作為一個(gè)機(jī)體與外界相通的器官。不僅是體內(nèi)重要的營養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收、免疫和內(nèi)分泌器官，還可以阻止腸腔內(nèi)的毒素、細(xì)菌、抗?fàn)I養(yǎng)因子等有害物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)對(duì)機(jī)體造成損傷，起到一個(gè)重要的屏障功能[6]。腸道時(shí)刻與外界相通，接觸外界微生物的次數(shù)也最多，因此也更容易產(chǎn)生氧化應(yīng)激，造成氧化損傷。

硫辛酸（lipoic acid，LA）作為一種高效的抗氧化劑可以減少活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，減弱DNA的氧化損傷，抑制脂質(zhì)過氧化，并能很大程度地改善體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)，對(duì)氧化應(yīng)激引起的疾病有顯著的緩解作用[7]，在生物體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為還原型的二氫硫辛酸，并能夠再生為內(nèi)源性抗氧化劑，LA具有雙硫五元環(huán)結(jié)構(gòu)，具有顯著的親電性和與自由基反應(yīng)的能力。近幾年，國內(nèi)外學(xué)者深入研究腸道氧化損傷的機(jī)制，根據(jù)氧化損傷理論開發(fā)有針對(duì)性的飼料添加劑已成為研究熱點(diǎn)之一。

1 自由基與氧化應(yīng)激

20世紀(jì)30年代，氧自由基（oxygen derived free radicals，OFR）首先被Pauling發(fā)現(xiàn)并將其命名為超氧化物[8]。隨后，Mann等[9]從牛血液和肝臟純化出超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），命名為“erythrocuprein”，“hepatocuprein”或“cytocuprein”，并證明是未知功能的銅結(jié)合蛋白，純化物完全基于銅的含量。當(dāng)時(shí)并不知道OFR能在動(dòng)物機(jī)體中產(chǎn)生，并可能導(dǎo)致各種疾病。直到20世紀(jì)60年代末，OFR才逐漸被大家所認(rèn)識(shí)，1968年McCord等[10-11]發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞SOD能夠清除“Pauling自由基”，并提出SOD存在于幾乎所有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，還發(fā)現(xiàn)超氧陰離子（O2·-）是動(dòng)物機(jī)體正常的代謝產(chǎn)物。1973年Babior等[12]發(fā)現(xiàn)，一些與炎性反應(yīng)過程相關(guān)的組織損傷可以歸因于嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的O2·-，并且證明SOD具有保護(hù)細(xì)胞損傷的作用。1981年Granger等[13]研究表明，缺血/再灌注貓的腸組織損傷是由過多的ROS產(chǎn)生引起的。隨著人們對(duì)自由基的不斷探索，氧化應(yīng)激也逐漸被大家所重視。

1.1 OFR及ROS產(chǎn)生途徑

自由基是指單獨(dú)存在的，具有不配對(duì)價(jià)電子的離子、原子、分子基團(tuán)。ROS是指氧的一些代謝產(chǎn)物和某些反應(yīng)的含氧產(chǎn)物，其特點(diǎn)是含有氧元素，化學(xué)性質(zhì)較氧分子活潑。ROS中的一些是自由基，其不配對(duì)的電子位于氧，稱為OFR；另一些則是非自由基的含氧物，非自由基ROS的特點(diǎn)是可以在自由基反應(yīng)中產(chǎn)生，同時(shí)還可以直接或間接地觸發(fā)自由基反應(yīng)。在生命活動(dòng)的氧化代謝過程中會(huì)不斷地產(chǎn)生各種OFR，其中O2·-、羥自由基（·OH）和羧自由基（ROO·）是三種具有代表性的自由基。O2·-形成最早，而·OH作用最強(qiáng)。自由基的產(chǎn)生途徑如圖1所示。

圖1 ROS產(chǎn)生途徑

1.2 氧化應(yīng)激的概念及危害

氧化應(yīng)激是指機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)OFR的產(chǎn)生和消除的平衡被打破，或外源性氧化物質(zhì)過量攝入，導(dǎo)致ROS在體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)過量蓄積，引起細(xì)胞毒性的病理過程，是心肌缺血/再灌注損傷的重要原因之一[14]。氧化應(yīng)激通過其氧化過程調(diào)節(jié)生理過程和生化反應(yīng)，同時(shí)也造成細(xì)胞、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生物大分子的氧化損傷，因此同時(shí)涉及到廣泛的生理和病理過程。袁施彬[15]通過給仔豬飼喂氧化魚油和腹腔注射diquat都可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，建立氧化應(yīng)激的動(dòng)物模型，其氧化應(yīng)激效應(yīng)表現(xiàn)為生產(chǎn)性能和養(yǎng)分利用率降低，組織抗氧化酶活力和總的抗氧化能力下降，血相也有相同的改變，組織細(xì)胞脂質(zhì)、DNA過氧化損傷加劇，機(jī)體免疫能力下降。李麗娟[16]研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激引起腸黏膜損傷，使腸黏膜標(biāo)志酶堿性磷酸酶、鈉鉀ATP酶、蔗糖酶活性極顯著下降，引起腸系膜BBMV和BLMV葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力極顯著下降。Deng等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激能夠顯著影響仔豬的免疫能力。氧化應(yīng)激能夠破壞腸道屏障功能，引起仔豬腹瀉，同時(shí)造成仔豬消化吸收功能的下降。Tanida等[18]研究表明，自由基能夠攻擊腸黏膜蛋白，造成養(yǎng)分轉(zhuǎn)運(yùn)載體、消化酶等一些重要的功能性蛋白活性降低甚至喪失。Kawauchiya等[19]發(fā)現(xiàn)氧化損傷導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞緊密連接相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)量下降。Circu等[20]利用脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)腸道細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡，造成腸道屏障功能降低，損傷腸道的消化吸收功能。

1.3 機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)

機(jī)體處于正常狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)的氧化-抗氧化系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)，體內(nèi)自由基的產(chǎn)生能夠得到及時(shí)的清除，所以其含量就會(huì)比較穩(wěn)定，反之則會(huì)異常。機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)包括：抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT等）和非酶類抗氧化物質(zhì)（維生素E、維生素C、有機(jī)硫化物等）。Ansaldo等[21]研究魚的消化腺體在不同劑量機(jī)油污染造成的氧化應(yīng)激試驗(yàn)中，測(cè)定抗氧化酶、氧化損傷和它們的適應(yīng)能力，結(jié)果表明SOD、CAT和GST的活性隨機(jī)油劑量的增加而增加，GSH-Px活性增加極顯著。

2 氧化應(yīng)激與腸道損傷

腸道黏膜完整性的維持主要由谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫化物（GSH/GSSG）和半胱氨酸/胱氨酸（Cys/CySS）偶聯(lián)的氧化還原狀態(tài)調(diào)控，當(dāng)它們處于正常狀態(tài)時(shí)，腸道才能保證營養(yǎng)物質(zhì)的正常吸收、黏液層的正常流動(dòng)和腸道微生物的多樣化。OFR導(dǎo)致消化道疾病的主要原因是：①OFR直接作用細(xì)胞的大分子；②OFR作為細(xì)胞內(nèi)信息轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)誘發(fā)細(xì)胞漿內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子（如NF-κB）激活，引起核內(nèi)有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄增加，是很多急性、慢性炎癥、細(xì)胞凋亡及免疫失調(diào)等疾病發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

2.1 氧化應(yīng)激對(duì)腸道氧化還原狀態(tài)的影響

在機(jī)體內(nèi)環(huán)境中，脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸是OFR攻擊的主要目標(biāo)。過氧化反應(yīng)可以使脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸的功能喪失，從而影響細(xì)胞膜的完整性、酶的活性、受體、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等蛋白質(zhì)和核酸的正常功能[22]，并可引起衰老、腸炎等一系列疾病。氧化還原信號(hào)的傳遞是具有特異性的，單個(gè)氧還原體系分別獨(dú)立存在于線粒體、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中。任何一個(gè)氧化還原體系被破壞就會(huì)導(dǎo)致腸道黏膜的氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致腸道病變。陳群等[23]研究表明，小腸上皮細(xì)胞添加GSH后使得SOD和CAT的酶活性一定程度地提高，主要是GSH清除了部分自由基，使得自由基鈍化抗氧化酶能力減弱。Srigiridhar等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，鐵可以導(dǎo)致腸道MDA和蛋白質(zhì)羰基含量顯著升高。Troost[25]、張志浩[26]也有類似研究。宋小珍等[27]在斷奶仔豬上的研究表明，氧化應(yīng)激使豬腸道SOD、GSH-Px的含量顯著降低，而MDA的含量顯著上升。Zhang等[28]的研究結(jié)果表明，LPS引起的氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致肉雞GSH-Px、T-SOD活性降低和MDA含量增加。從這些文獻(xiàn)可以看出，氧化應(yīng)激破壞了動(dòng)物腸道氧化-抗氧化平衡狀態(tài)，使腸道氧化酶活性改變，因此檢測(cè)腸道中SOD、GSH-Px、T-SOD、MDA等的含量可以間接的評(píng)價(jià)動(dòng)物腸道損傷的程度。

2.2 氧化應(yīng)激對(duì)腸道完整性的影響

腸道屏障的完整性通常用腸道通透性和細(xì)菌移位來表示。腸道通透性是指某些分子物質(zhì)通過簡單擴(kuò)散方式穿過腸道黏膜上皮的難易程度。當(dāng)腸道屏障受到損傷尤其是緊密連接受到損傷時(shí)，腸道的通透性就會(huì)立刻升高。細(xì)菌移位是指腸道內(nèi)的細(xì)菌從腸道黏膜轉(zhuǎn)移到血液和免疫淋巴結(jié)的過程，一般用單位腸系膜和脾臟勻漿后培養(yǎng)細(xì)菌的菌落數(shù)來表示。常用以下方法來評(píng)價(jià)腸道的完整性：①觀察腸道組織切片，檢測(cè)腸道絨毛高度、隱窩深度；②檢測(cè)血漿中LPS和D-乳酸水平；③檢測(cè)緊密連接蛋白（occludin）和胞質(zhì)蛋白（ZO-1）表達(dá)量。

動(dòng)物腸道絨毛是機(jī)體消化吸收養(yǎng)分的主要部位，絨毛結(jié)構(gòu)的改變將直接影響營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。趙立柯等[29]研究表明，氧化應(yīng)激引起腸道絨毛高度降低，隱窩深度加深，從而導(dǎo)致腸道消化吸收能力的下降。Bollengier等[30]的研究指出，氧化應(yīng)激使幼齡母雞的空腸絨毛高度、絨毛表面積和絨毛體積顯著降低，從而影響腸道的功能；寧章永等[31]也有類似發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明氧化應(yīng)激導(dǎo)致肉雞的腸道發(fā)生了病理學(xué)變化，腸道的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)受到了嚴(yán)重破壞，絨毛出現(xiàn)斷裂、充血、缺失等現(xiàn)象。因此，通過觀測(cè)腸道切片可以直接評(píng)價(jià)腸道的完整性。除此之外，檢測(cè)血漿中LPS和D-乳酸水平也能間接的評(píng)價(jià)腸道的完整性[32]。

緊密連接是腸上皮細(xì)胞間的主要連接方式，在維持腸上皮細(xì)胞極性和調(diào)節(jié)腸黏膜屏障的通透性中發(fā)揮著重要的作用。Furuse等[33]認(rèn)為occludin是集中在腸道緊密連接上的跨膜蛋白，并在細(xì)胞膜的外側(cè)與ZO相連，形成occludin-ZO蛋白結(jié)合體，從而發(fā)揮其生理功能。段云等[34]研究表明，高原缺氧對(duì)腸黏膜屏障有損害作用，降低了occludin的蛋白表達(dá)量；于瑋等[35]研究指出氧化應(yīng)激狀態(tài)下雞腸道occludin蛋白表達(dá)量顯著下降；Han等[36]研究指出低氧狀態(tài)下激活TLR4/NF-κB信號(hào)通路，構(gòu)成緊密連接復(fù)合體主要成分occludin蛋白表達(dá)量下調(diào)。咼于明等[32]也有類似的研究結(jié)果。通常情況下，occludin的蛋白表達(dá)量作為評(píng)價(jià)腸道通透性的重要指標(biāo)。

2.3 氧化應(yīng)激激活TLR4/NF-κB信號(hào)通路引起腸道細(xì)胞凋亡的研究

Toll受體4（toll-like receptor 4，TLR4）作為腸道固有免疫的重要組成部分，連同腸絨毛構(gòu)成了腸道對(duì)細(xì)菌識(shí)別的第一道屏障，它既是細(xì)胞表面免疫識(shí)別受體，又是胞內(nèi)跨膜信號(hào)傳導(dǎo)分子。在氧化應(yīng)激引起的腸源性敗血癥發(fā)展過程中，LPS是腸道上皮細(xì)胞TLR4的強(qiáng)效激動(dòng)劑，當(dāng)TLR4與特異性配體LPS結(jié)合后，可通過MyD88依賴和TRIF依賴的兩條途徑，激活I(lǐng)RAKs、TRAFs、TAK1等細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子并最終激活通路下游的核因子κB（NF-κB）從基因水平調(diào)控TNF-α、caspase-3、IL-1β、IL-2、IL-8等多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)[37-39]，在局部可引起腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡，參與腸道組織器官的損傷，同時(shí)又可以作用于遠(yuǎn)隔器官，引起更大范圍的全身炎癥反應(yīng)。

Fukata等[40]研究發(fā)現(xiàn)TLR4可以促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖并抑制腸道細(xì)菌的移位，但同時(shí)實(shí)驗(yàn)證明[41-42]，TLR4缺陷小鼠與野生型小鼠相比，結(jié)腸炎所致的腸道上皮損傷程度減輕，細(xì)胞因子及巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤減少。Soares等[43]研究表明，TLR4可能在腸道損傷后細(xì)菌移位引發(fā)的炎癥反應(yīng)中起到至關(guān)重要的作用。La Serre等[44]報(bào)道指出，肥胖易感的SD大鼠在高脂飲食喂養(yǎng)后腸道TLR4表達(dá)上調(diào)，并伴隨著occludin在細(xì)胞層面上的重新分布，免疫組化顯示occludin從胞膜轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)致使增加，進(jìn)而引起屏障功能的損傷。由此可見，研究氧化應(yīng)激激活TLR4/NF-κB信號(hào)通路引起的腸道屏障功能損傷和細(xì)菌移位以及腸道細(xì)胞凋亡具有重要的意義。

3 LA對(duì)動(dòng)物腸道氧化損傷的干預(yù)作用

LA又名二氫硫辛酸，系統(tǒng)命名為1，2-二硫戊環(huán)-3-戊酸，分子式為C8H14O2S2，相對(duì)分子質(zhì)量為206.33；通常為白色晶體，略有異味；分子中只有一個(gè)手性碳，具有旋光性。LA具有雙硫五元環(huán)結(jié)構(gòu)，具有顯著的親電性和與自由基反應(yīng)的能力。其結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖2 LA結(jié)構(gòu)式

3.1 與金屬離子絡(luò)合

Cu2+、Hg2+等過渡金屬離子及砷等元素在機(jī)體的氧化反應(yīng)過程中起催化作用，如果過量攝入容易導(dǎo)致組織損傷[45]。LA及二氫硫辛酸可以與這些金屬離子絡(luò)合，阻斷其催化作用，降低機(jī)體的氧化作用，抑制自由基的形成。研究表明[46]，當(dāng)LA與砷的摩爾比為8∶1時(shí)，可以完全防止小鼠砷中毒。

3.2 修復(fù)受損細(xì)胞

LA不僅對(duì)長時(shí)間的氧化損傷有較強(qiáng)抵抗作用，而且對(duì)VC和VE不能修復(fù)的、較嚴(yán)重的細(xì)胞氧化損傷也可進(jìn)行有效修復(fù)[47]。并且由于LA具有脂溶性，二氫硫辛酸具有水溶性，二者結(jié)合可以深入到細(xì)胞中的各個(gè)部位而起作用，而只具有脂溶性或水溶性的抗氧化劑卻沒有這一功能。

3.3 影響基因表達(dá)

NF-κB是一種能與免疫球蛋白κ鏈基因的增強(qiáng)子κB序列特異性結(jié)合的核蛋白因子，LA和二氫硫辛酸能夠調(diào)節(jié)NF-κB的激活。并且LA能夠阻止HIV復(fù)制，影響C-fos類原癌基因的表達(dá)，對(duì)自由基代謝過程中的中間產(chǎn)物H2O2造成的細(xì)胞DNA氧化損傷具有明顯的保護(hù)作用[48]。

3.4 LA修復(fù)動(dòng)物腸道氧化損傷

Guven等[49]報(bào)道，LA可以通過清除ROS和RNS對(duì)大鼠小腸缺血性再灌注損傷進(jìn)行修復(fù)。李軍華等[50]報(bào)道，LA通過抗氧化作用對(duì)UC大鼠具有保護(hù)作用。王艷艷等[51]指出，高脂日糧引起的小鼠氧化應(yīng)激及消化系統(tǒng)功能障礙可以通過LA進(jìn)行緩解。王嘯春等[52]報(bào)道，LA能夠修復(fù)OFR引起的大鼠小腸上皮細(xì)胞損傷。李武等[53]研究表明，LA通過直接清除自由基以及提高抗氧化通路相關(guān)功能基因的表達(dá)水平解除氧化應(yīng)激而有助于防治高脂引發(fā)的腸道功能損傷。在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的通路中，細(xì)胞膜電位下降，Caspase-3激活、CytC釋放、Bax和Bcl-2等的表達(dá)引起廣泛關(guān)注。Powell等[54]報(bào)道，小腸細(xì)胞系DLD-1高糖損傷組的GSH濃度與對(duì)照組相比明顯降低，添加LA后細(xì)胞中GSH含量恢復(fù)正常；同時(shí)發(fā)現(xiàn)高糖損傷組iNOS啟動(dòng)子基因表達(dá)上調(diào)，而LA損傷修復(fù)組顯著降低了iNOS啟動(dòng)子表達(dá)上調(diào)量，在轉(zhuǎn)錄水平證明了LA對(duì)小腸細(xì)胞氧化損傷的修復(fù)作用。

LA可以通過減輕免疫抑制力，調(diào)整氧化應(yīng)激下腸道菌群來減少腸道氧化損傷。張蓉等[55]研究指出，小鼠消化道氧化應(yīng)激引起腸道微生物區(qū)系的紊亂，LA可以通過調(diào)整腸道氧化還原狀態(tài)使微生物區(qū)系恢復(fù)正常。Cui等[56]進(jìn)一步從腸道免疫細(xì)胞受體基因表達(dá)量驗(yàn)證LA的抗氧化作用，高脂飼糧能引起慢性氧化損傷，抑制腸道相關(guān)淋巴細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致了對(duì)黏膜免疫力的抑制，而LA能夠通過從轉(zhuǎn)錄水平修復(fù)相關(guān)基因，腸道氧化損傷和免疫抑制反應(yīng)。這些結(jié)果表明具有脂水兩親特性和高效抗氧化能力的LA，為LA作為飼料添加劑的進(jìn)一步開發(fā)提供了自由基生物學(xué)方面的根據(jù)，已成為腸道氧化損傷干預(yù)機(jī)理研究較為成熟的一種抗氧化劑。

4 小結(jié)

近年來，動(dòng)物的健康和福利受到了越來越多的關(guān)注，科學(xué)家們?yōu)榇颂岢隽搜芯繎?yīng)激的新模型。氧化應(yīng)激作為動(dòng)物胃腸道疾病的誘因也備受人們的關(guān)注，研究氧化應(yīng)激對(duì)動(dòng)物胃腸道損傷的機(jī)制機(jī)理已成為當(dāng)今的熱門課題，同時(shí)，進(jìn)一步開發(fā)實(shí)用的飼料添加劑以有效地緩解氧化應(yīng)激顯得尤為重要。