煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶對(duì)血管疾病病理過程的影響

孫 濤 楊蒙蒙 朱寶義 張 琰▲

1.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院藥學(xué)部，陜西西安 710038；2.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院眼科，陜西西安 710038

活性氧（ROS）是細(xì)胞中調(diào)控許多生理和病理過程的重要分子。ROS 涉及正常細(xì)胞功能和疾病發(fā)展的機(jī)制， 消除ROS 的策略必須考慮到它們對(duì)器官正常功能的關(guān)鍵性影響。 然而，過量的產(chǎn)生ROS 涉及到很多疾病。動(dòng)物模型和臨床研究均證實(shí)血管壁中過量產(chǎn)生的ROS 與動(dòng)脈粥樣硬化、心衰、高血壓和斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)[1]。 一般而言，有兩種清除自由基的方式：①給予抗氧化劑或刺激內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)消除自由基； ②通過抑制產(chǎn)生ROS 的酶干擾氧化應(yīng)急激的發(fā)生。 第一種方式已被廣泛用于基礎(chǔ)和臨床研究，然而卻沒有獲得預(yù)期的對(duì)心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用；而后一種方式被認(rèn)為可提高血管功能，但需進(jìn)一步明確潛在的機(jī)制和氧化應(yīng)激的本質(zhì)。

1 氧化應(yīng)激的損傷作用

ROS 對(duì)心血管系統(tǒng)的病理作用源于其對(duì)血管細(xì)胞功能的影響，及其可消除某些血管保護(hù)性成分。 內(nèi)皮釋放的舒張因子（EDRF）和超氧陰離子（O2-·）之間的相互作用發(fā)生非常迅速，這使得一氧化氮（NO）沒有機(jī)會(huì)發(fā)揮生物作用。目前認(rèn)為這種相互作用是內(nèi)皮功能異常的最常見機(jī)制，該機(jī)制使血管內(nèi)皮細(xì)胞不能為血管壁提供血管保護(hù)性因子[2-3]。ROS 對(duì)血管平滑肌細(xì)胞和纖維母細(xì)胞的直接作用在心血管疾病的早期階段也發(fā)揮重要作用。 一些ROS 對(duì)血管可發(fā)揮直接調(diào)節(jié)作用，另一些ROS 通過對(duì)蛋白、脂質(zhì)和DNA 的毒性氧化而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。 過量產(chǎn)生的ROS 導(dǎo)致血管再生和細(xì)胞增殖，同時(shí)激活大量的前炎癥基因[4]。此外，ROS 也在關(guān)鍵的信號(hào)通路中發(fā)揮作用。 在生理濃度時(shí)ROS 激活受體酪氨酸激酶和轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)抗氧化基因的表達(dá)，伴隨著其他氧化還原敏感性轉(zhuǎn)錄因子的活化，影響細(xì)胞和組織的功能[5]。

2 抗氧化維生素缺乏臨床有效性

離體和動(dòng)物研究均證明維生素E、維生素C 和維生素A 具有抗氧化活性[6-7]，同時(shí)考慮到ROS 在心血管系統(tǒng)疾病中的作用。 因此，引入抗氧化維生素用于血管藥理學(xué)研究是合理的。 然而，隨機(jī)臨床研究所得數(shù)據(jù)卻具有爭(zhēng)議性。糖尿病、高膽脂醇血癥、高同型半胱氨酸血癥患者和吸煙者給予抗氧化劑可以改善血流介導(dǎo)的舒張（FMD）和血管內(nèi)皮功能異常[8]。但是，進(jìn)一步研究顯示單一消除ROS 不能有效地阻止心血管疾病的病理過程[9]。 多中心臨床研究沒有證實(shí)維生素E 在動(dòng)脈粥樣硬化病理過程或主要心血管事件中的保護(hù)作用。 事實(shí)上，Meta 分析揭示給予維生素E 的劑量超過400 IU/d 可能增加心血管疾病患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)[10]。

抗氧化劑清除ROS 缺乏臨床有效性的可能原因。 抗氧化劑可消除部分ROS，但不能消除過量產(chǎn)生的ROS，因此整個(gè)病理過程依然可以繼續(xù)。此外，抗氧化劑，包括維生素，與O2-·之間的相互作用比NO 慢一百萬倍。 結(jié)果，超氧自由基與NO 的相互作用是一個(gè)熱力學(xué)的過程，導(dǎo)致了NO 生物活性的喪失。 也有研究顯示維生素不能充分滲入血管壁，因此它們可能在血漿中達(dá)到治療水平，但在組織中不能達(dá)到治療水平。最后，維生素E 和O2-·相互作用可以形成自由基。這種自由基分子在給予維生素C 或輔酶Q 的情況下可轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素E。 然而，研究證實(shí)聯(lián)合使用維生素E 和C 不能增強(qiáng)臨床有效性。

由于臨床研究沒有證實(shí)抗氧化維生素治療心血管疾病的有效性，這使人們意識(shí)到現(xiàn)有關(guān)于氧化應(yīng)激的理解可能并不完全正確。 然而，在考慮治療心血管疾病時(shí)依然不能忽視它們[11]。

3 氧化應(yīng)激發(fā)生的復(fù)雜分子機(jī)制——煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶的中心作用

ROS 主要來源于氧化還原酶，如NADPH（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）氧化酶、黃嘌呤氧化酶、脂氧化酶和環(huán)氧合酶。同時(shí)，應(yīng)該注意到這些來源（酶）之間的相互影響。 目前認(rèn)為NADPH 氧化酶和黃素氧化酶將O2轉(zhuǎn)化為O2-·是這些事件的中心環(huán)節(jié)。 產(chǎn)生ROS 的氧化酶可以被其他來源的ROS 修飾。 一些氧化酶結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致NADPH 氧化酶產(chǎn)生過量的ROS，而過量的ROS 導(dǎo)致它們功能的異常，并進(jìn)一步促進(jìn)ROS 的生成， 形成氧化應(yīng)激的惡性循環(huán)（圖1）。 例如，巰基可逆的氧化隨后發(fā)生不可逆的蛋白水解修飾，轉(zhuǎn)換黃嘌呤脫氫酶（參與嘌呤代謝）轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)生ROS 的黃嘌呤氧化酶。 這種轉(zhuǎn)變導(dǎo)致了分子量明顯的變化 （圖1）。 這種現(xiàn)象在許多血管疾病狀態(tài)、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化中被發(fā)現(xiàn)[3，12]。

圖1 NADPH 氧化酶在血管氧化應(yīng)激和內(nèi)皮功能異常發(fā)病機(jī)制中的中心作用

ROS 具有平行雙向活性，Nox 蛋白可以發(fā)揮保護(hù)和損傷作用。 ROS 是調(diào)節(jié)血管張力、基因表達(dá)、增殖、遷移和分化的重要信號(hào)分子。 另一個(gè)方面，心血管危險(xiǎn)因素和血管疾病促進(jìn)ROS 的產(chǎn)生而加快動(dòng)脈粥樣硬化、血管功能異常、高血壓、血管肥大和血栓的病理過程。 因此，有效地抑制NADPH 氧化酶對(duì)于理解其結(jié)構(gòu)、活性和功能非常重要[13]。

4 NADPH 氧化酶結(jié)構(gòu)和激活

NADPH 氧化酶家族包括多個(gè)同源物， 它們的表達(dá)、結(jié)構(gòu)和功能各異。 簡(jiǎn)要來說，這些同源物包括Nox1、Nox2、Nox3、Nox4、Nox5、Duox1 和Duox2。 Nox 亞型包含一個(gè)FAD 和NADPH 結(jié)合位點(diǎn)， 兩個(gè)血紅素分子和6 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。Duox 亞型也包含同樣的結(jié)構(gòu)域；然而， 有一個(gè)7 次跨膜的結(jié)構(gòu)域并具有過氧化物酶同源性[14]。

NADPH 氧化酶在不同的血管細(xì)胞中的表達(dá)各異。Nox1 和Nox5 分別主要表達(dá)于血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞[15]。 Nox2 在內(nèi)皮細(xì)胞、外膜纖維細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。 而上述所有細(xì)胞中均有Nox4的表達(dá)。 重要的是在特定情況下，不同的類型細(xì)胞中一種以上的Nox 亞型被激活， 而促進(jìn)氧化應(yīng)激的發(fā)生， 并且在一些情況下不同的Nox 亞基可能相互作用。 Nox3 主要表達(dá)于內(nèi)耳，包括螺旋神經(jīng)節(jié)、耳庭和耳蝸上皮細(xì)胞。 Duox1 和Duox2 表達(dá)水平很高，特別是在甲狀腺，參與了甲狀腺激素的氧化[14]。 同系物分布部位的不同可能與它們?cè)诮】岛图膊≈邪l(fā)揮的作用不同相關(guān)。血管NADPH 氧化酶，特別是Nox1、Nox2和Nox5， 通過單一電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生ROS 而主要產(chǎn)生O2-·。 Nox4 是一個(gè)例外，因?yàn)樗腅 環(huán)有一個(gè)特殊的改變，可以產(chǎn)生過氧化氫H2O2，盡管Nox4 的生物學(xué)特征依然有爭(zhēng)議。 H2O2是一個(gè)重要的血管擴(kuò)張劑，它可以產(chǎn)生內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)， 并可降低小鼠的血壓。H2O2可增加內(nèi)皮細(xì)胞NOS 的表達(dá)和活性，并可直接氧化蛋白激酶Giα 亞基，產(chǎn)生血管舒張作用[15]。 此外，目前認(rèn)為Nox 不同亞型在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展過程中表達(dá)的部位不同。 Nox4 可以增加動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性， 在斑塊發(fā)展的早期階段Nox2 似乎對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展起關(guān)鍵作用， 而Nox5 也可表達(dá)于人類動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的位置[16]。

5 NADPH 氧化酶信號(hào)通路和調(diào)節(jié)的復(fù)雜性

NADPH 氧化酶的活性可被因子、激素、剪切應(yīng)力、血流停止、凝血酶、5-羥色胺、內(nèi)皮素-1、血管緊張素Ⅱ、組胺、緩激肽、溶血磷脂酸、佛波醇（PMA）、前列腺素F2α（PGF2α）和鞘氨醇1-磷酸等所影響。近期的研究重點(diǎn)是葡萄糖的刺激作用、 高級(jí)糖化產(chǎn)物（AGE）、非酯化脂肪酸（NEFAs）、腫瘤壞死因子和氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）對(duì)NADPH 氧化酶活性和表達(dá)的影響[17-18]。

刺激細(xì)胞膜表面的受體， 如血管緊張素Ⅱ受體，可激活NADPH 氧化酶。血管緊張素Ⅱ結(jié)合AT1 受體后導(dǎo)致磷脂酶C（PLC）和磷脂酶D（PLD）的激活。 兩者都可以產(chǎn)生二酰甘油（DAG），而PLC 還可以產(chǎn)生三磷酸肌醇（IP3）。DAG 和IP3 誘導(dǎo)了鈣離子的釋放，而激活蛋白激酶C（PKC）。 PKC 磷酸化p47phox 亞基需要其他因子與該亞基的結(jié)合，而激活NADPH 氧化酶。 NADPH 氧化酶同樣也可以通過脂性第二信使激活氧化酶[17]。

同樣有一些反饋機(jī)制使NADPH 氧化酶的調(diào)節(jié)更加復(fù)雜。例如，過氧化氫激活c-Src（酪氨酸激酶，分子伴侶v-Src），這可能通過激活c-Abl 或?qū)е卤砥どL(zhǎng)因子受體（EGFR）反式激活（激活PI3-激酶產(chǎn)生PIP3）增強(qiáng)NADPH 氧化酶活性，而對(duì)ROS 的產(chǎn)生起正反饋?zhàn)饔谩?值得注意的是雖然NADPH 氧化酶影響其他氧化酶產(chǎn)生的ROS，而它們自身的活性也可以被其他氧化酶產(chǎn)生ROS 所影響[19]。

6 NADPH 氧化酶激活的分子后果

超氧陰離子，NADPH 氧化酶主要的產(chǎn)物， 與NO反應(yīng)產(chǎn)生過氧硝酸鹽，這是內(nèi)皮功能異常的主要特征性機(jī)制[20]。 超氧陰離子可自發(fā)或酶促變?yōu)楦€(wěn)定的H2O2。過氧化氫可被轉(zhuǎn)化為活性氮和活性氯而攻擊LDL 和HDL，促進(jìn)斑塊的形成[21]。 H2O2可影響蛋白激酶和磷酸酶。H2O2通過鈍化磷酸酶和激活一些蛋白激酶調(diào)節(jié)蛋白的磷酸化。 一個(gè)公認(rèn)的例子是細(xì)胞內(nèi)ROS 的增加可能抑制酪氨酸磷酸酶， 并增加酪氨酸激酶活性。這可能導(dǎo)致絲裂原激活蛋白激酶（MAPKs）磷酸化。而Akt 激酶（IP3-激酶下游）和半胱天冬酶-3 激活涉及細(xì)胞凋亡過程，并被ROS 調(diào)控[22]。

ROS 主要通過在DNA 結(jié)合域的關(guān)鍵氨基酸殘基上形成二硫鍵調(diào)控轉(zhuǎn)率因子活性或間接通過調(diào)節(jié)氧化還原信號(hào)通路（磷酸化/去磷酸化）而發(fā)揮作用。 激活的蛋白-1（AP-1）通過MAPKs 和NF-κB 通路發(fā)揮作用， 特別是通過ERK1/2 和c-jun N-端蛋白激酶（JNKs）導(dǎo)致前-炎癥基因的表達(dá)，伴隨細(xì)胞因子和趨化因子的生產(chǎn)[23]。而NF-κB 可誘導(dǎo)E-選擇素、細(xì)胞間黏附分子-1 （ICAM-1） 和血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1） 的表達(dá)而涉及單核細(xì)胞黏附到內(nèi)皮細(xì)胞和它們的激活[24]。

除了調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路之外，ROS 促進(jìn)了DNS、 脂質(zhì)和蛋白的損傷。 ROS 誘導(dǎo)DNA 損傷激活poly（ADP-核糖）聚合酶（PARP），導(dǎo)致PKC 激活和進(jìn)一步增強(qiáng)NF-κB 的活性[25]。

在上面描述的信號(hào)通路， 涉及其他中間蛋白，如細(xì)胞內(nèi)還原因子（谷胱甘肽、過氧化氫酶、氧化酵素和SOD）[26]。

通過這些分子機(jī)制，ROS 影響血小板聚集、 單核細(xì)胞遷移、 脂質(zhì)過氧化和氧化還原敏感性基因的表達(dá)。 ROS 也涉及調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能異常、血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡、遷移和免疫反應(yīng)。 說明這些潛在的機(jī)制是發(fā)展新型治療動(dòng)脈粥樣硬化和血管功能異常藥物最重要的第一步。

7 NADPH 氧化酶靶點(diǎn)

激活NADPH 氧化酶涉及復(fù)雜的機(jī)制，這些酶以不同活性水平被激活。首先，降低NADPH 氧化酶的表達(dá)可以抑制其活性。通過阻斷其細(xì)胞溶質(zhì)亞單位轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜也可以降低NADPH 氧化酶的活性。 其他方式可能為通過使用PKC 抑制劑阻止p47phox 亞單位磷酸化，或通過阻止p47phox 亞單位結(jié)合到其他亞單位。此外，通過減少信號(hào)傳導(dǎo)和抑制Rac1 移位已經(jīng)被證實(shí)可以減少ROS 的產(chǎn)生[5]。 最后，需要特別重視的是策略目標(biāo)不應(yīng)該是抑制所有已知的氧化酶，而是抑制特定的NADPH 氧化酶亞型。 這些靶點(diǎn)可以幫助指導(dǎo)研究新型的NADPH 氧化酶抑制劑。

ROS 在調(diào)控血管組織的許多生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。 近年隨著對(duì)氧化應(yīng)激本質(zhì)認(rèn)識(shí)的深入， 對(duì)ROS 在血管疾病中的意義也有了進(jìn)一步的理解。 NADPH 氧化酶是血管中ROS 的主要來源，因此對(duì)NADPH 氧化酶的研究，將揭示血管疾病新的病理生理機(jī)制和防治途徑。

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