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    細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑3在大鼠靜脈移植物中的表達(dá)及意義

    2015-01-19 03:19:30黃進(jìn)啟姚元波蔡彥力劉金平湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院心胸外科湖北恩施445000華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管外科湖北武漢4300
    中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2015年22期
    關(guān)鍵詞:白介素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)移植物

    黃進(jìn)啟 姚元波▲ 向 水 蔡彥力 鄭 勇 劉金平 .湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院心胸外科,湖北恩施 445000;.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管外科,湖北 武漢 4300

    冠狀動脈旁路移植術(shù)(coronary artery bypass graft,CABG) 后靜脈移植物再狹窄嚴(yán)重影響其遠(yuǎn)期預(yù)后[1]。研究表明靜脈移植物再狹窄的病理過程是血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)遷移并增殖引起中層增厚和內(nèi)膜增生,最終導(dǎo)致血管重構(gòu)和管腔狹窄,其啟動和加速進(jìn)展的關(guān)鍵和核心因素是炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)的“瀑布樣”級聯(lián)放大的炎性反應(yīng)[2-4]。大多數(shù)細(xì)胞因子通過janus 激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)信號通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。 研究表明,JAK2/STAT3 在VSMC 從靜止收縮表型向合成分泌表型轉(zhuǎn)換及遷移增殖等病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5],而細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑3(SOCS3)是JAK2/STAT3 信號通路的經(jīng)典及特異性負(fù)反饋抑制劑[6]。 研究表明,SOCS3 通過抑制JAK2/STAT3 信號通路的下游關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄子STAT3 激活及其磷酸化在多種炎癥相關(guān)性疾病、癌癥及自身免疫性疾病的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[7-10]。 然而SOCS3 在靜脈移植物再狹窄的早期病理過程中表達(dá)是否異常及可能的相關(guān)機(jī)制,目前不清楚。 本實(shí)驗(yàn)借助大鼠頸外靜脈頸總動脈移植模型和體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞增殖模型,檢測大鼠靜脈移植物早期病變過程中的相關(guān)炎癥細(xì)胞因子、STAT3 及SOCS3 的表達(dá)情況,初步探討SOCS3在靜脈移植物再狹窄過程中的可能作用及機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    36 只雄性健康SD 大鼠(2~3 月齡大,體重300~330 g) 購買于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心(合格證號:00018829,00018364)。 大鼠SOCS3 重組腺病毒pYrAd-rSOCS3 及對照病毒pYrAd-GFP 由武漢巴菲爾生物技術(shù)有限公司合成,1640 和DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibico 公司。 堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)(50 μg,400-20)購自Sigma 公司,一抗磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)(AB-P-R-001)購于杭州賢至生物科技有限公司, 一抗SATA3(NBP1-19206)、SOCS3(NB600-1075)、磷酸化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子 (P-STAT3)(NBP1-74611)、單核細(xì)胞趨化蛋白1 (MCP-1)(NBP1-07034)、 白介素1β (IL-1β)(NB110-57113)、 細(xì)胞間黏附分子1 (ICAM-1)(NB500-318)購自美國Novus 公司,一抗腫瘤壞死因子α(TNF-α)(SC-1350)、白介素6(IL-6)(SC-1265)購自美國Santa Cruz 公司。 PCR 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。顯微手術(shù)器械包及縫線購自上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 動物模型的建立及取材 將36 只雄性SD 大鼠隨機(jī)分成兩組,對照組和實(shí)驗(yàn)組,各18 只。實(shí)驗(yàn)組采用10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉,去除頸部毛發(fā),行頸部正中切口。 全身肝素化(150 U/kg,皮下注射)后游離右側(cè)頸外靜脈及頸總動脈,切取2 cm 長的靜脈于肝素鹽水中保存?zhèn)溆?。于頸總動脈中段切除5 mm,采用標(biāo)準(zhǔn)顯微外科技術(shù), 用11-0 尼龍線將大鼠頸外靜脈遠(yuǎn)近端顛倒翻轉(zhuǎn)間斷縫合8-10 針端吻合于頸總動脈上,開放后遠(yuǎn)端動脈搏動明顯視為血流通暢,吻合成功。對照組行假手術(shù),只游離頸外靜脈和頸總動脈。術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng),分別于術(shù)后第1、3、7 天取出移植靜脈,對照組取出相應(yīng)長度的頸外靜脈,每個時間點(diǎn)6 只。 取出的靜脈立即分成兩等份置入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 采用差異組織貼塊法分離培養(yǎng)大鼠胸主動脈原代VSMC,α-肌動蛋白(α-actin)免疫熒光法鑒定VSMC, 第3~8 代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。TCID50 法 測 定pYrAd-rSOCS3 及pYrAd-GFP 滴 度均為2×1010pfu/mL。 按感染復(fù)數(shù)40 感染VSMC,感染效率在95%以上。制備細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度,以3×105個細(xì)胞/孔加入24 孔板中,每組6 孔,加入無血清DMEM 培養(yǎng)基,37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h 同步化細(xì)胞,換為10%胎牛血清(FBS)DMEM 培養(yǎng)基。 實(shí)驗(yàn)組分為bFGF 組、bFGF+pYrAd-GFP 組、bFGF+pYrAd-rSOCS3組。 對照組不加刺激因子,bFGF 組只加50 ng/mL 濃度的bFGF 刺激,bFGF+pYrAd-GFP 組和bFGF+pYrAd-rSOCS3 組分別滴加復(fù)數(shù)為40 的pYrAd-GFPp 及YrAd-rSOCS3 預(yù)孵育2 h 后,再加bFGF 刺激,37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)24 h。 收集細(xì)胞。

    1.2.3 Real time-PCR 檢測IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-1β、ICAM-1、SOCS3 mRNA 表達(dá) 從液氮罐中取出1 份移植靜脈,轉(zhuǎn)入另一離心管中,立即碾碎,收集細(xì)胞,分別加入1 mL Trizol。 按照試劑盒說明書步驟依次加入氯仿、異丙醇提取總RNA,最后用4℃無水乙醇清洗3 次,室溫放置10 min 晾干,溶于20 μL 焦碳酸二乙酯(DEPC)水中。 取少量樣本用分光光度計(jì)測定并計(jì)算出RNA 濃度。 取各樣本總RNA 5 μg,嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,反應(yīng)條件為42℃60 min,95℃5 min。 反應(yīng)體系總量為20 μL。PCR 擴(kuò)增:引物序列設(shè)計(jì)見表1。 反應(yīng)體系總量為20 μL,組成如下:10 倍稀釋的cDNA 4 μL,水5.2 μL,SYBR Green/Fluroescein qPCR Master Mix(2×)(Invitrogen)10 μL, 上下游引物各0.4 μL。 置入Eco real time-PCR 儀。 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,95°C 30 s,60℃30 s,72℃延伸10 min,循環(huán)40 周。 使用比較閾值法來測定目的基因的相對表達(dá)量,即實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對于對照組的倍數(shù),記作2-△△Ct;-△△Ct=(Ct 目的基因-Ct 管家基因) 實(shí)驗(yàn)組-(Ct 目的基因-Ct 管家基因) 對照組,Ct 是熱循環(huán)儀檢測到反應(yīng)體系中熒光信號的臨界循環(huán)數(shù)值。

    表1 引物序列

    1.2.4 Wertern blotting 檢 測IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-1β、ICAM-1、STAT3、P-STAT3、SOCS3蛋白表達(dá) 從液氮罐中取出另一份移植靜脈放入EP管中,收集細(xì)胞,均立即置于冰上,移液器分別滴加細(xì)胞裂解液150 μL 和蛋白酶抑制劑4 μL,靜置30 min,4℃、10 000 r/min 離心5 min,提取上清。 上清液中包含提取的總蛋白。BCA 法測定蛋白濃度。 取樣品蛋白40 μg 依次進(jìn)行電泳和濕轉(zhuǎn), 用濃度為5%的脫脂奶粉在室溫條件下封閉1 h。 分別滴加不同比例稀釋過的相應(yīng)鼠抗多克隆抗體磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)(1∶800)、IL-6(1∶400)、MCP-1(1∶1200)、TNF-α(1∶800)、IL-1β(1∶2500)、ICAM-1(1∶800)、STAT3(1∶800)、PSTAT3(P Ser727,1∶800)及SOCS3(1∶800),4℃冰箱中過夜孵育,TBST 緩沖液沖洗硝酸纖維素膜10 min×3次。 滴加稀釋度為1∶2000 的驢抗羊二抗辣根過氧化物酶(HRP),室溫孵育1 h,TBST 緩沖液洗膜10 min×3 次。按照ECL 發(fā)光試劑盒說明書要求在暗室內(nèi)發(fā)光曝光。應(yīng)用圖像分析處理軟件Glyo Bandscan 4.3 分析相應(yīng)的目的蛋白和內(nèi)參電泳條帶的灰度值,目的蛋白相對表達(dá)水平等于目的蛋白條帶灰度值與樣本GAPDH灰度值的比值。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù), 計(jì)量資料數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較運(yùn)用單因素ANVOA 分析及Student-Newman-keuls t 檢驗(yàn)。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 移植靜脈mRNA、蛋白表達(dá)

    取材時檢查發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組所有的移植靜脈內(nèi)血流均通暢, 術(shù)后1 周時移植靜脈內(nèi)膜均有不同程度增生, 說明成功建立大鼠頸外靜脈頸總動脈移植模型。Real time-PCR 和Wertern blotting 檢測移植靜脈中的mRNA 和蛋白表達(dá)水平,結(jié)果表明,與對照組比較,實(shí)驗(yàn)組移植靜脈中的IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-1β、ICAM-1、STAT3(僅檢測蛋白)、P-STAT3(僅檢測蛋白)、SOCS3 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均在術(shù)后1 周內(nèi)均有明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05 或P <0.01)。見表2、3。

    2.2 VSMC 中的mRNA 和蛋白表達(dá)水平

    Real time-PCR 和Western blotting 檢測VSMC 中各細(xì)胞因子的mRNA 和蛋白表達(dá)水平,結(jié)果表明,與對照組比較,bFGF 組中上述指標(biāo)mRNA 和蛋白表達(dá)明顯上調(diào) (P <0.05 或P <0.01); 與bFGF 組比較,bFGF+pYrAd-rSOCS3 組中SOCS3 的mRNA 和蛋白表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)(P <0.01、P <0.05),而IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-1β、ICAM-1 的mRNA 和蛋白表達(dá)以及STAT3、P-STAT3 蛋白表達(dá)明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05 或P <0.01)。bFGF 組與bFGF+pYrAd-GFP組比較,上述指標(biāo)mRNA 和蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05)。 見表4、5。

    3 討論

    3.1 VSMC 受bFGF 刺激后炎癥細(xì)胞因子的變化

    CABG 術(shù)后自體大隱靜脈再狹窄的病理過程主要包括早期血栓形成、中期內(nèi)膜增生和晚期粥樣硬化。炎性反應(yīng)是其始動促發(fā)因素并成級聯(lián)放大始終貫穿于整個病理過程中[2]。 急性炎性反應(yīng)可在大隱靜脈吻合到升主動脈和冠狀動脈間后數(shù)小時即出現(xiàn)并持續(xù)到數(shù)周。 從獲取大隱靜脈時的牽拉、缺血缺氧到置身于動脈環(huán)境中后受到高速動脈血流的沖刷及剪切應(yīng)力的作用均可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞受損及功能失調(diào)。內(nèi)皮屏障功能完整性的破壞及內(nèi)膜下的裸露可招募并激活血小板、白細(xì)胞及巨噬細(xì)胞并形成血栓。 這些表型轉(zhuǎn)換及功能失調(diào)的內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、白細(xì)胞及巨噬細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞因子、生長因子、趨化因子及黏附分子等炎癥介質(zhì)產(chǎn)生急性炎性反應(yīng)。 炎癥因子促使VSMC 從靜止收縮表型轉(zhuǎn)換為合成分泌表型,同時合成分泌大量具有促炎活性的介質(zhì)促使炎性反應(yīng)呈“瀑布樣”級聯(lián)放大。 表型改變的VSMC 即從中層遷移至內(nèi)膜并增殖[3-4],細(xì)胞外基質(zhì)降解并沉積,最終引起內(nèi)膜增生、粥樣硬化等血管重構(gòu),導(dǎo)致管腔狹窄和閉塞。本研究表明,在大鼠自體頸外靜脈移植到頸總動脈術(shù)后1 周的早期階段, 移植物中的炎癥細(xì)胞因子IL-6、MCP-1、TNF-α、IL-1β、ICAM-1 明顯表達(dá)上調(diào), 說明出現(xiàn)明顯的急性炎性反應(yīng)。 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明,VSMC 受到bFGF 刺激后, 其分泌上述炎癥細(xì)胞因子明顯增加。

    表2 實(shí)驗(yàn)組移植靜脈mRNA 表達(dá)(±s,n=6)

    表2 實(shí)驗(yàn)組移植靜脈mRNA 表達(dá)(±s,n=6)

    注:對照組結(jié)果均為(1.00±0.00);與對照組比較,*P <0.05,**P <0.01;IL-6:白介素6;MCP-1:單核細(xì)胞趨化蛋白1;TNF-α:腫瘤壞死因子α;IL-1β:白介素1β;ICAM-1:細(xì)胞間黏附分子1;SOCS3:細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑3

    時間 IL-6 MCP-1 TNF-α IL-1β ICAM-1 SOCS3第1 天第3 天第7 天2.01±0.41*2.79±0.24**3.60±0.51**2.03±0.40*2.55±0.45**3.69±0.51**2.08±0.38*2.91±0.51**4.86±0.74**1.60±0.28 1.87±0.30*2.73±0.52**1.42±0.32 1.74±0.38*1.97±0.35*1.21±0.18 1.58±0.26 1.93±0.38*

    表3 兩組移植靜脈蛋白表達(dá)(±s,n=6)

    表3 兩組移植靜脈蛋白表達(dá)(±s,n=6)

    注:與對照組比較,*P <0.05,**P <0.01;IL-6:白介素6;MCP-1:單核細(xì)胞趨化蛋白1;TNF-α:腫瘤壞死因子α;IL-1β:白介素1β;ICAM-1:細(xì)胞間黏附分子1;STAT3:信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子;P-STAT3:磷酸化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子;SOCS3:細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑3

    組別 IL-6 MCP-1 TNF-α IL-1β ICAM-1 STAT3 P-STAT3 SOCS3對照組第1 天第3 天第7 天實(shí)驗(yàn)組第1 天第3 天第7 天0.30±0.07 0.25±0.04 0.35±0.05 0.74±0.13 0.62±0.12 0.85±0.17 0.33±0.08 0.41±0.11 0.29±0.07 0.22±0.03 0.27±0.04 0.19±0.04 0.17±0.02 0.15±0.03 0.21±0.02 0.24±0.06 0.30±0.07 0.21±0.05 0.32±0.04 0.28±0.05 0.37±0.10 0.37±0.08 0.42±0.12 0.30±0.10 1.11±0.26**1.63±0.35**1.52±0.37**1.23±0.27 1.46±0.25*1.90±0.31*1.11±0.24**1.51±0.27**1.66±0.30**0.53±0.16 0.58±0.15*0.74±0.17**0.65±0.12**1.02±0.39**1.02±0.18**1.14±0.27**1.35±0.31**1.50±0.36**0.92±0.27**1.60±0.37**1.54±0.39**1.14±0.21**0.82±0.18*0.75±0.17*

    表4 VSMC 中的mRNA 表達(dá)水平(±s,n=3)

    表4 VSMC 中的mRNA 表達(dá)水平(±s,n=3)

    注:與對照組比較,*P <0.05,**P <0.01;與bFGF 組比較,△P <0.05,△△P <0.01;IL-6:白介素6;MCP-1:單核細(xì)胞趨化蛋白1;TNF-α:腫瘤壞死因子α;IL-1β:白介素1β;ICAM-1:細(xì)胞間黏附分子1;SOGS3:細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑3

    組別 IL-6 MCP-1 TNF-α IL-1β ICAM-1 SOCS3對照組bFGF 組bFGF+pYrAd-GFP 組bFGF+pYrAd-rSOCS3 組1.00±0.00 1.57±0.31*1.56±0.28 1.28±0.25△1.00±0.00 2.08±0.37**2.14±0.17 1.17±0.23△1.00±0.00 3.06±0.52**3.28±0.61 1.37±0.23△△1.00±0.00 1.71±0.19*1.73±0.34 1.48±0.21△1.00±0.00 2.10±0.27**2.09±0.35 1.34±0.21△1.00±0.00 2.37±0.24**2.31±0.31 5.47±1.03△△

    表5 VSMC 中的蛋白表達(dá)水平(±s,n=3)

    表5 VSMC 中的蛋白表達(dá)水平(±s,n=3)

    注:與對照組比較,*P <0.01;與bFGF 組比較,△P <0.05;IL-6:白介素6;MCP-1:單核細(xì)胞趨化蛋白1;TNF-α:腫瘤壞死因子α;IL-1β:白介素1β;ICAM-1:細(xì)胞間黏附分子1;STAT3:信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子;P-STAT3:磷酸化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子;SOCS3:細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑3

    組別 IL-6 MCP-1 TNF-α IL-1β ICAM-1 STAT3 P-STAT3 SOCS3對照組bFGF 組bFGF+pYrAd-GFP 組bFGF+pYrAd-rSOCS3 組1.00±0.23 2.36±0.48*2.10±0.42 1.68±0.39△0.83±0.19 1.66±0.43*1.67±0.42 1.25±0.21△0.64±0.15 1.54±0.31*1.65±0.30 1.20±0.24△0.67±0.15 1.49±0.35*1.55±0.36 1.00±0.24△0.61±0.11 1.41±0.28*1.31±0.30 0.99±0.21△0.56±0.17 1.30±0.27*1.17±0.22 0.77±0.13△0.79±0.21 1.74±0.36*1.72±0.37 1.18±0.36△0.87±0.24 1.28±0.32*1.27±0.35 1.79±0.38△

    3.2 JAK/STAT 信號通路在靜脈移植物狹窄早期炎性反應(yīng)中的作用

    JAK/STAT 信號通路是一條將信號從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核的經(jīng)典信號通路,在信號通路中具有代表性,通過受體與酪氨酸激酶結(jié)合,激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子與轉(zhuǎn)錄活化因子并進(jìn)入細(xì)胞核,啟動靶基因表達(dá)途徑發(fā)揮功能,為大多數(shù)細(xì)胞因子共用。 對機(jī)體多種細(xì)胞的增殖和凋亡、神經(jīng)和胚胎發(fā)育以及免疫反應(yīng)發(fā)揮復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控作用[11-12]。 JAK/STAT 家族包括4 個JAK和7 個STAT 成員,研究表明,其中JAK2/STAT3是調(diào)控VSMC 表型轉(zhuǎn)換及遷移增殖的一條重要信號通路[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明,術(shù)后1 周內(nèi)的移植靜脈中STAT3 及P-STAT3 表達(dá)明顯上調(diào)。 說明在靜脈移植物狹窄的早期炎性反應(yīng)中, 存在STAT3 的過度激活及其磷酸化,JAK2/STAT3 信號通路發(fā)揮了重要作用。

    3.3 SOCS3 在靜脈移植物再狹窄病變中的調(diào)節(jié)作用

    SOCS 蛋白既是轉(zhuǎn)錄子STAT 的靶基因,反過來,表達(dá)的SOCS 蛋白通過與STAT 競爭結(jié)合停泊位點(diǎn)又抑制其激活及磷酸化, 因此SOCS 是JAK/STAT 信號通路的經(jīng)典負(fù)反饋抑制劑,在細(xì)胞因子表達(dá)及生物學(xué)效應(yīng)中發(fā)揮精細(xì)調(diào)節(jié)平衡作用。 SOCS 家族包括CIS和SOCS1-7 蛋白, 分別由8 個不同的細(xì)胞因子誘導(dǎo)生成,其中SOCS3 是目前研究最多、功能最清楚和作用最強(qiáng)的成員。SOCS3 N 末端的激酶抑制區(qū)結(jié)構(gòu)域?qū)AK2 的激酶區(qū)具有相對更高的親和力[13],而SOCS3對激活STAT3 的受體又具有特異性更高的結(jié)合力,所以,SOCS3 對JAK2/STAT3 信號通路的負(fù)向調(diào)節(jié)有相對更高的特異性。 SOCS3 通過負(fù)反饋抑制JAK2/STAT3 信號通路下游的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子STAT3 的激活及其絲氨酸和酪氨酸磷酸化, 從而阻止其進(jìn)入細(xì)胞核,在精細(xì)平衡免疫應(yīng)答進(jìn)程和調(diào)節(jié)機(jī)體多種細(xì)胞的發(fā)育、分化、增殖及凋亡過程中發(fā)揮重要作用。研究表明,SOCS3 甲基化基因沉默或表達(dá)上調(diào)在多種炎癥相關(guān)性疾病、癌癥及自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[14-17]。 在人動脈粥樣斑塊中的平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中檢測到SOCS3 表達(dá)上調(diào),在ApoE-/-小鼠動物模型中也得到相同結(jié)果。利用腺病毒載體SOCS3基因轉(zhuǎn)染等基因操控技術(shù)誘導(dǎo)其過表達(dá)可抑制單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及VSMC 的分化增殖及合成分泌炎癥細(xì)胞因子。 相反, 應(yīng)用寡核苷酸探針技術(shù)下調(diào)SOCS3 表達(dá)可加速ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化進(jìn)程,加重動脈硬化程度[10]。 在肝炎和肝癌患者的肝細(xì)胞中檢測到SOCS3 mRNA 和蛋白表達(dá)水平下調(diào), 同時存在STAT3 表達(dá)上調(diào)。 通過肝細(xì)胞SOCS3 條件性基因敲除或甲基化基因沉默可加使小鼠肝癌的進(jìn)展加速和程度加重,相反,利用腺病毒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)SOCS3 過表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的分化增殖及生長[18-20]。 SOCS3 基因敲除小鼠在胚胎期死亡。 造血干細(xì)胞SOCS3 基因條件性敲除小鼠會在成年期表現(xiàn)出心臟、肝臟、腎臟及肺等多個重要器官嚴(yán)重的中性粒細(xì)胞浸潤,出現(xiàn)嚴(yán)重的炎性反應(yīng)而死亡[14]。 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎(EAE)存在Th17/Treg 細(xì)胞平衡失調(diào)及Th17 細(xì)胞極化、高表達(dá)MHCⅡ類分子和CD86,體外誘導(dǎo)DC 細(xì)胞過表達(dá)SOCS3 后再過繼性輸注到野生型小鼠后顯著抑制EAE 的進(jìn)程和病變程度[16]。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在靜脈移植物再狹窄的早期病理過程中存在SOCS3 表達(dá)上調(diào),但仍不足以抑制過度激活的JAK2/STAT3 信號通路。 體外通過攜帶大鼠SOCS3 基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染VSMC,誘導(dǎo)其過表達(dá)SOCS3,明顯下調(diào)STAT3、PSTAT3 及炎癥細(xì)胞因子的表達(dá), 說明SOCS3 通過抑制STAT3 的激活及進(jìn)一步磷酸化可能在靜脈移植物再狹窄病變過程中發(fā)揮有益的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。 那么, 利用基因操控技術(shù)誘導(dǎo)體內(nèi)移植靜脈過表達(dá)SOCS3 能否阻斷或減慢靜脈移植物再狹窄的進(jìn)程,還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

    總之, 本實(shí)驗(yàn)研究表明SOCS3 在靜脈移植物再狹窄病變中可能發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用,可為防治靜脈移植物再狹窄提供一種新思路,采取措施啟動炎性反應(yīng)的內(nèi)源性生理性負(fù)向調(diào)節(jié)子SOCS3 的功能可能是治療靜脈移植物再狹窄的一種新策略。

    [1] Sabik JF,Lytle BW,Blackstone EH,et al. Comparison of saphenous vein and internal thoracic artery graft patency by coronary system[J].Ann Thorac Surg,2005,79(2):544-551.

    [2] Kim FY,Marhefka G,Ruggiero NJ,et al. Saphenous vein graft disease:review of pathophysiology,prevention,and treatment [J]. Cardiol Rev,2013,21(2):101-109.

    [3] Muto A,Model L,Ziegler K et al. Mechanisms of vein graft adaptation to the arterial circulation:insights into the neointimal algorithm and management strategies[J].Circ J,2010,74(8):1501-1512.

    [4] Mitra AK,Gangahar DM,Agrawal DK. Cellular,molecular and immunological mechanisms in the pathophysiology of vein graft intimal hyperplasia[J].Immunol Cell Biol,2006,84(2):115-124.

    [5] Yoshimura A,Naka T,Kubo M.SOCS proteins,cytokine signalling and immune regulation[J].Nature Reviews Immunology,2007,7(6):454-465.

    [6] Banes AK,Shaw SM,Tawfik A,et al.Activation of the JAK/STAT pathway in vascular smooth muscle by serotonin [J].Am J Physiol Cell Physiol,2005,288(4):C805-C812.

    [7] Sasaki A,Yasukawa H,Suzuki A,et al. Cytokine-inducible SH2 protein-3(CIS3/SOCS3)inhibits Janus tyrosine kinase by binding through the N-terminal kinase inhibitory region as well as SH2 domain [J]. Genes Cells,1999,4(6):339-351.

    [8] Hiwatashi K,Tamiya T,Hasegawa E,et al. Suppression of SOCS3 in macrophages prevents cancer metastasis by modifying macrophage phase and MCP2/CCL8 induction [J].Cancer Lett,2011,308(2):172-180.

    [9] Liu X,Qu X,Chen Y,et al. Mesenchymal stem/stromal cells ind uce the generation of novel IL-10-dependent regulatory dendritic cells by SOCS3 activation [J]. J Immunol,2012,189(3):1182-1192.

    [10] Ortiz-Munoz G,Martin-Ventura JL,Hernandez-Vargas P,et al. Suppressors of cytokine signaling modulate JAK/STAT-mediated cell responses during atherosclerosis [J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2009,29(4):525-531.

    [11] O'Sullivan LA,Liongue C,Lewis RS,et al. Cytokine receptor signaling through the Jak-Stat-Socs pathway in disease [J]. Mol Immunol,2007,44(10):2497-2506.

    [12] Darnell JE.STATs and gene regulation[J].Science,1997,277(5332):1630-1635.

    [13] Naka T,Narazaki M,Hirata M,et al. Structure and function of a new STAT-induced STAT inhibitor [J]. Nature,1997,387(6636):924-929.

    [14] Croker BA,Metcalf D,Robb L,et al. SOCS3 is a critical physiological negative regulator of G-CSF signaling and emergency granulopoiesis[J].Immunity,2004,20(2):153-165.

    [15] Wong PK,Egan PJ,Croker BA,et al.SOCS-3 negatively regulates innate and adaptive immune mechanisms in acute IL-1-dependent inflammatory arthritis [J]. J Clin Invest,2006,116(6):1571-1581.

    [16] Li Y,Chu N,Rostami A,et al. Dendritic cells transduced with SOCS-3 exhibit a tolerogenic/DC2 phenotype that directs type 2 Th cell differentiation in vitro and in vivo[J]. J Immunol,2006,177(3):1679-1688.

    [17] Asari A,Kanemitsu T,Kurihara H. Oral administration of high molecular weight hyaluronan(900 kDa)controls immune system via Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium[J].J Biol Chem,2010,285(32):24751-24758.

    [18] Ogata H,Kobayashi T,Chinen T,et al.Deletion of the SOCS3 gene in liver parenchymal cells promotes hepatitis-induced hepatocarcinogenesis [J]. Gastroenterology,2006,131(1):179-193.

    [19] Niwa Y,Kanda H,Shikauchi Y,et al. Methylation silencing of SOCS-3 promotes cell growth and migration by enhancing JAK/STAT and FAK signalings in human hepatocellular carcinoma [J]. Oncogene,2005,24(42):6406-6417.

    [20] Cui Q,Jiang W,Wang Y,et al.Transfer of suppressor of cytokine signaling 3 by an oncolytic adenovirus induces potential antitumor activities in hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2008,47(1):105-112.

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