NF-κB在胃癌組織中的表達(dá)與臨床病理的相關(guān)性研究

趙 煜 曾 杰

四川省人民醫(yī)院急診外科，四川成都 610072

我國胃癌的新發(fā)病例數(shù)和胃癌死亡率居惡性腫瘤之首，其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制尚未完全明確。大約65%胃癌患者確診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。 故侵襲與轉(zhuǎn)移的機(jī)制成為胃癌研究的重要方向， 研究顯示，細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[2]。 NFκB 是一種細(xì)胞核內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要因子， 活化的NF-κB 能靶向調(diào)控腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[3]。NF-κB 與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切， 但與胃癌的關(guān)系研究不多。我們通過免疫組化法分析NF-κB 在胃癌組織中的表達(dá)，探討其作為判斷胃癌預(yù)后指標(biāo)的臨床意義，現(xiàn)將材料歸納如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2004 年1 月～2009 年1 月四川省人民醫(yī)院病理科收治的50 例胃癌根治標(biāo)本， 其中男38 例，女12 例，年齡30～78 歲；高、中分化23 例，低、未分化27例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18 例；腫瘤直徑≥5 cm 者33 例，＜5 cm 者17 例； 患者術(shù)前均未接受放療和化療。 另取同期50 例非腫瘤患者胃黏膜組織作為對照，其中男35 例，女15 例，年齡30～75 歲。所有患者性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

RAW 264.7 細(xì)胞株（中國科學(xué)院上海細(xì)胞所產(chǎn)品）；重組質(zhì)粒NF-κB 熒光素酶（NF-κB-LUC）（美國國立癌癥研究所提供）；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitmgen 公司產(chǎn)品）；熒光素酶分析試劑（美國Promega公司產(chǎn)品）兔抗大鼠NF-κB p65 抗體一抗（武漢博士德）。 SA-1022 山羊抗兔IgG 二抗SABC 免疫組化試劑盒（武漢博士德）；核-胞漿蛋白制備試劑盒（Pierce公司）。

1.3 檢測方法

1.3.1 標(biāo)本處理 RAW 264.7 細(xì)胞在37℃、5%CO2的條件下，在含10%小牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基（GIBCO-BRL）中貼壁生長。用Lipofectamine 2000 介導(dǎo)NFκB-LUC 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW 264.7 細(xì)胞。首先采集兩組研究對象的靜脈血標(biāo)本，采集量為80 mL，分別取4.0 mL置于乙二胺四乙酸（EDTA）試管及BD 試管。將EDTA試管中血液樣本進(jìn)行處理，以PBS 液進(jìn)行混合，再以淋巴細(xì)胞液加入并離心，3500 r/min， 離心15 min，取上清液進(jìn)行檢測，去沉淀物，然后以核-胞漿蛋白制備試劑盒進(jìn)行檢測，依次再進(jìn)行細(xì)胞胞漿提取液（CERI）加入、震蕩、冰浴，再進(jìn)行CERI 加入、震蕩、冰浴及離心，取胞漿冷藏，沉淀層反復(fù)進(jìn)行上述處理4 次，后離心進(jìn)行上清液冷藏。

1.3.2 組織芯片的制備及免疫組化染色處理 由兩名資深病理科醫(yī)師進(jìn)行相應(yīng)的處理，將空白石蠟芯片放入組織，然后以鼠組織定位，并連續(xù)切片，后貼在載玻片上以HE 染色進(jìn)行對照。 以SP 免疫組化染色試劑盒及DAB 酶底物顯色劑對標(biāo)本進(jìn)行染色處理， 嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.3.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)NF-κB 主要在細(xì)胞漿內(nèi)陽性表達(dá)，顏色成棕黃色。 每張切片隨機(jī)選取10 個(gè)視野（400 倍鏡下）,每個(gè)視野下計(jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞。另以陽性細(xì)胞所在比例≥40%和＜40%分別表示高表達(dá)和低表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， 計(jì)數(shù)資料用率表示， 組間比較采用χ2檢驗(yàn)， 等級資料用Spearman 等級相關(guān)分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織、 癌旁組織和非腫瘤患者胃黏膜組織中NF-κB 的表達(dá)比較

胃癌組織、癌旁組織和非腫瘤患者胃黏膜組織中NF-κB 蛋白的表達(dá), 表達(dá)陽性率分別為76.0%（38/50）、4.0%（2/50）和16.0%（8/50），三者相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。其中，胃癌組織與癌旁組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=20.404，P=0.000）；胃癌組織與正常胃黏膜組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2=43.51l，P=0.000）；癌旁組織與正常胃黏膜組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.655，P=0.010）。 見圖1（封三）。

圖1 不同胃黏膜組織中NF-κB 的表達(dá)（SP 染色，400×）

2.2 NF-κB 表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征關(guān)系的比較

50 例胃癌組織中NF-κB 的表達(dá)與脈管侵犯呈正相關(guān)（r=0.318，P=0.002），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（r=0.243，P=0.035），當(dāng)腫瘤直徑＜5 cm 時(shí)，與腫瘤大小呈正相關(guān)（r=0.315，P=0.002），與浸潤程度呈正相關(guān)（r=0.350，P=0.001），與分化程度無相關(guān)性（r=0.119，P=0.242）。不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤程度、脈管侵犯情況的胃癌患者NF-κB 陽性表達(dá)例數(shù)比較， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。 見表1。

2.3 不同NF-κB 表達(dá)情況者5 年生存率比較分析

研究顯示，胃癌組織低表達(dá)的16 例患者中，達(dá)到5 年生存率的占68.75%（11/16），高表達(dá)的22 例患者中， 達(dá)到5 年生存率的占27.27%（6/22） NF-κB 低表達(dá)者的5 年生存率顯著高于高表達(dá)者（χ2=14.642，P ＜0.05），5 年生存率與NF-κB 表達(dá)關(guān)系分析結(jié)果顯示5 年生存率與NF-κB 表達(dá)呈負(fù)相關(guān) （r=-0.337，P=0.003）。

3 討論

越來越多的證據(jù)表明，NF-κB 與腫瘤的發(fā)生有密切的關(guān)系，目前已證明在乳腺癌、甲狀腺癌、T 或B淋巴細(xì)胞白血病、 結(jié)腸癌及幾種病毒誘導(dǎo)的腫瘤中，均存在NF-κB 活性高表達(dá)[5-7]。 胃腺癌在男性常見癌癥中位于第4 位，在女性中為第5 位，并且與慢性炎癥密切相關(guān)[8]。 目前普遍認(rèn)為幽門螺桿菌在胃炎到胃癌的惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用， 但僅有約l%感染人群最終轉(zhuǎn)變?yōu)槲赴9]。 這種差異的出現(xiàn)可能是因?yàn)槭艿骄植垦装Y因子的遺傳易感性的影響。幽門螺桿菌是慢性胃炎的主要病因，亦是第一類致胃癌因子[10]。幽門螺桿菌感染后，患者內(nèi)皮細(xì)胞上的多種與癌通道受到影響，導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，而這些受影響的指標(biāo)即有NF-κB。 NF-κB 表達(dá)與胃癌發(fā)生的關(guān)系，目前報(bào)道較少，觀點(diǎn)也不一致。 研究發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌可以激活NF-κB，從而進(jìn)一步導(dǎo)致胃癌的發(fā)生[11-12]。NF-κB 是一種能與免疫球蛋白κ 輕鏈基因增強(qiáng)子κB 序列特異性結(jié)合并調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白因子，其活化形式通常指NF-κB p65。 NF-κB 調(diào)控的基因參與了腫瘤的發(fā)生、血管生成和癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，同時(shí)NF-κB 基因產(chǎn)物異常表達(dá)會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[13]。NF-κB 在腫瘤中的異常狀態(tài)與癌細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)， 而TLR4/NFκB 又與炎性及免疫應(yīng)激有一定的關(guān)系， 通過通路與抗炎免疫機(jī)制密切相關(guān)，該通路的MYD 88 依賴和非依賴兩條途徑發(fā)揮作用， 形成相輔相承的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[14]。 TLR4 受體的激活所需的四種蛋白又與上述指標(biāo)相關(guān)，并對炎癥細(xì)胞，尤其是促炎細(xì)胞產(chǎn)生影響，對其表達(dá)狀態(tài)產(chǎn)生一定的影響作用[15]。 相關(guān)研究認(rèn)為，NF-κB p65 對于胃癌的早期診斷有較高的價(jià)值，主要與其在此類患者早期組織中的表達(dá)狀態(tài)有關(guān)，且其表達(dá)越高則患者生存率越高[16]，另外其與患者治療后的生存期也密切相關(guān)，因此臨床認(rèn)為可將其作為胃癌預(yù)后的重要了解及監(jiān)測指標(biāo)[17]。有研究表明NF-κB轉(zhuǎn)錄因子亞單位的結(jié)合位點(diǎn)在TFF3 的5′端區(qū)域。TFF3 可通過IKK 短暫激活NF-κB 的炎性應(yīng)激反應(yīng)，并進(jìn)一步影響Twist 蛋白，兩者相互抑制，從而抑制炎癥及腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程[18-19]。

表1 胃癌組織臨床病理特征與NF-κB 的表達(dá)的關(guān)系（例，n=50）

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測了胃癌組織和癌旁肺組織中NF-κB 的表達(dá)，結(jié)果提示，在胃癌組織中，NF-κB 陽性表達(dá)明顯高于癌旁組織， 提示NF-κB 表達(dá)可能與胃癌發(fā)生有關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)NF-κB 表達(dá)陽性率越高，淋巴轉(zhuǎn)移率越高，預(yù)后也越差。有針對性地選擇其活化途徑的不同水平層次進(jìn)行選擇性調(diào)控NF-κB 的活性，可以從基因水平上防治胃癌，是抗癌藥物設(shè)計(jì)的一個(gè)很好的靶點(diǎn)，為臨床治療胃癌提供一條新的途徑。 NF-κB 是一種多項(xiàng)多功能核轉(zhuǎn)錄因子，其調(diào)節(jié)許多重要的生理過程，包括細(xì)胞生長、凋亡和腫瘤形成，同時(shí)可能影響腫瘤的血管形成，促進(jìn)腫瘤的生長浸潤和轉(zhuǎn)移[20]。 本研究結(jié)果顯示NF-κB 的表達(dá)與脈管侵犯，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小呈正相關(guān)，與分化程度無相關(guān)性。

綜上所述，NF-κB 陽性表達(dá)與胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)， 檢測NF-κB 的表達(dá)對胃癌病情監(jiān)測及轉(zhuǎn)移潛能及預(yù)后估計(jì)等方面有重要參考價(jià)值。

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