微柱凝膠法檢測(cè)孕婦血清IgG抗體效價(jià)參考值的臨床研究

羅國勝 朱彩云 席雅娟 魏玉娥 吳湘蘭 馮春顏 李凌波

1.廣東省深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518109；2.廣東省深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院新生兒科，廣東深圳 518109；3.長(zhǎng)春博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司研發(fā)部，吉林長(zhǎng)春 130012

新生兒溶血?。╤emolytic disease of the newborn，HDN）是由于經(jīng)胎盤傳播的母體免疫球蛋白（Ig）G 抗體與胎兒紅細(xì)胞上不同于母體（即遺傳自父系）的抗原結(jié)合，結(jié)果導(dǎo)致胎兒和/或新生兒紅細(xì)胞壽命縮短的一種疾病[1]。 臨床因母嬰ABO 血型不合引起的HDN最為常見，IgG 是唯一能通過胎盤進(jìn)入胎兒血液循環(huán)的抗體，該抗體進(jìn)入胎兒血液循環(huán)后破壞胎兒紅細(xì)胞而致新生兒ABO 溶血病（ABO-HDN），可出現(xiàn)胎兒黃疸、貧血、水腫、流產(chǎn)、早產(chǎn)，嚴(yán)重者將造成新生兒生理缺陷甚至死亡。由于ABO-HDN 的發(fā)病程度與母體內(nèi)IgG 抗A（B）的效價(jià)有一定相關(guān)性[2-3]，因此可通過定期檢測(cè)孕婦體內(nèi)IgG 抗A（B）的效價(jià)來判斷胎兒受累情況，并根據(jù)IgG 抗體水平及早采取相應(yīng)的防治措施，這對(duì)優(yōu)生優(yōu)育、提高人口素質(zhì)具有重要意義。本研究采用國產(chǎn)微柱凝膠試驗(yàn)技術(shù)對(duì)夫婦ABO 血型不合的3038 例O 型孕婦檢測(cè)其血清IgG 抗A（B）效價(jià)，并分析其與209 例產(chǎn)后臨床診斷為ABO-HDN 新生兒的關(guān)系。 現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下：

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2011 年10 月～2013 年12 月在廣東省深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）產(chǎn)科門診就診的夫婦ABO 血型不合O 型孕婦3038 例，夫婦血型為A-O 型的1355 例，B-O 型1209 例，AB-O 型474 例。孕婦年齡17～44 歲，平均（27.6±1.1）歲，孕16～40 周，上述所有孕婦均無輸血史。 孕婦Rh（D）血型陰性9 例，其余均為陽性，除1 例血清不規(guī)則抗體篩查為陽性（后經(jīng)鑒定為IgG 抗D 且效價(jià)＜2）外，其余均為陰性，故本研究不考慮ABO 血型系統(tǒng)以外IgG 抗體的效價(jià)。 上述O 型血孕婦所分娩的新生兒209 例，均以黃疸或進(jìn)行性黃疸加重為主要癥狀，出生72 h 后總血清膽紅素水平均≥257 μmol/L（15 mg/dL），臨床診斷ABO-HDN 依據(jù)文獻(xiàn)[4-5]。

1.2 試劑和儀器

0.2 mol/L 2-ME 應(yīng)用液、0.8%ABO 血型反定型試劑盒（人血紅細(xì)胞）、ABO、RhD 血型定型檢測(cè)卡（單克隆抗體）、抗人球蛋白檢測(cè)卡（不規(guī)則抗體篩檢）、HDN母體IgG 抗體效價(jià)檢測(cè)卡均由長(zhǎng)春博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；不規(guī)則抗體檢測(cè)試劑（人紅細(xì)胞）由長(zhǎng)春博德生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。以上所有試劑均在效期內(nèi)使用。FYQ 型免疫微柱孵育器、TD-3A 型血型血清學(xué)用離心機(jī)（長(zhǎng)春博研科學(xué)生物儀器有限公司）、DK-600 型電熱恒溫水槽（上海申賢恒溫設(shè)備廠）。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 母體血清不規(guī)則抗體篩檢 采用抗人球蛋白檢測(cè)卡（不規(guī)則抗體篩檢）進(jìn)行不規(guī)則抗體篩查，按廠家使用說明書進(jìn)行操作和判讀。

1.3.2 母體IgG 抗A（B）抗體效價(jià)檢測(cè) 400 μL 血清標(biāo)本與0.2 mol/L 2-ME 應(yīng)用液400 μL 充分混勻，封口膜封緊試管口，37℃60 min， 充分裂解血清中IgM類抗體。 標(biāo)記兩組10 mm×60 mm 的試管各12 個(gè)，第12 管為陰性對(duì)照（生理鹽水）， 吸經(jīng)2-ME 處理后血清用生理鹽水做倍比稀釋，稀釋度分別為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024、1∶2048，用鹽水法確定1∶2 稀釋度管IgM 抗體已被破壞[6-7]。 以HDN 母體IgG 抗體效價(jià)檢測(cè)卡檢測(cè)IgG 抗A（B）血型抗體效價(jià)，取檢測(cè)卡做好標(biāo)記，在微管內(nèi)各加入50 μL與孕婦丈夫同型的0.8%標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞懸液（測(cè)定孕婦ABO 系統(tǒng)IgG 血型抗體），再依次加入處理過的稀釋度為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024、1∶2048 的血清及陰性對(duì)照（生理鹽水）各50 μL，37℃孵育15 min，專用離心機(jī)離心5 min（900 r/min，2 min；1500 r/min，3 min）。 以出現(xiàn)1+凝集強(qiáng)度的血清最高稀釋度為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，并以此血清稀釋度的倒數(shù)為效價(jià)[6]。

1.3.3 O 型血孕婦所分娩的新生兒血清學(xué)檢測(cè) 對(duì)新生兒進(jìn)行HDN 血型血清學(xué)三項(xiàng)試驗(yàn)（包括直接抗人球蛋白試驗(yàn)、游離抗體試驗(yàn)、抗體放散試驗(yàn)，分別簡(jiǎn)稱“直抗試驗(yàn)”、“游離試驗(yàn)”、“放散試驗(yàn)”）均采用微柱凝膠技術(shù)。 具體方法參照文獻(xiàn)[3]。

1.3.4 通過新生兒溶血病3 項(xiàng)試驗(yàn)判斷ABO-HDN 直抗試驗(yàn)以出現(xiàn)凝集為陽性，游離和放散試驗(yàn)以檢出可以和新生兒紅細(xì)胞反應(yīng)的抗體為陽性，單項(xiàng)放散試驗(yàn)陽性及其他項(xiàng)目陽性同時(shí)合并放散試驗(yàn)陽性的結(jié)果均可判為ABO-HDN，直抗及游離試驗(yàn)1 項(xiàng)陽性只能判定為ABO-HDN 可疑陽性，兩者同時(shí)陽性可判為ABO-HDN[8]。

2 結(jié)果

2.1 O 型孕婦IgG 抗A（B）效價(jià)分布

3038 例O 型孕婦中，IgG 抗體效價(jià)≥256（異常例數(shù)）者1388 例，占45.69%。 其中，夫婦為A-O 型的異常例數(shù)有681 例，占總例數(shù)（1355 例）的50.26%，夫婦B-O 型的異常例數(shù)有507 例，占總例數(shù)（1209 例）的41.94%，夫婦AB-O 型的異常例數(shù)有200 例，占總例數(shù)（474 例）的42.19%。 見表1。

2.2 臨床診斷為ABO-HDN 的新生兒血清學(xué)三項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果

臨床診斷為ABO-HDN 的新生兒血清學(xué)三項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，209 例患者均為放散試驗(yàn)陽性，其次游離試驗(yàn)陽性率也高達(dá)86.12%，而游離+放散+直抗實(shí)驗(yàn)陽性率為32.54%。 見表2。

表1 O 型孕婦IgG 抗A（B）效價(jià)分布[n（%）]

表2 臨床診斷ABO-HDN 新生兒血清學(xué)三項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果

2.3 臨床診斷為ABO-HDN 的新生兒母體IgG 抗體效價(jià)分布

209 例中效價(jià)≥256 的有206 例，另有3 例合并有紅細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PD 酶）缺乏新生兒的母體IgG 抗體效價(jià)均為128。 見表3。

表3 臨床診斷ABO-HDN 新生兒母體IgG 抗體效價(jià)分布

3 討論

母嬰血型不合可以引起HDN，溶血結(jié)果可致胎兒及新生兒貧血及發(fā)生顯著的新生兒黃疸，嚴(yán)重黃疸引起的高膽紅素血癥是該病的常見并發(fā)癥之一。早期嚴(yán)重的高膽紅素血癥可能引起核黃疸，從而留下聽力喪失、腦性癱瘓、智力發(fā)育障礙等后遺癥，給社會(huì)及家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。與HDN 相關(guān)的血型抗原超過50 種以上，其中以ABO-HDN 最為常見，但大多數(shù)ABO-HDN 癥狀較輕，通?？杀憩F(xiàn)為產(chǎn)后24 h 內(nèi)出現(xiàn)輕微黃疸，但由于特定族群中二磷酸尿苷葡萄糖醛基轉(zhuǎn)移酶基因啟動(dòng)子變異導(dǎo)致了亞洲部分國家高膽紅素血癥的高發(fā)[7]。

導(dǎo)致新生兒膽紅素升高的原因有多種，如ABO及Rh 溶血癥、G-6-PD 缺陷癥、早產(chǎn)因素、敗血癥等。近年來有研究指出，我國核黃疸的發(fā)生率高于西方國家，且高膽紅素血癥導(dǎo)致核黃疸的新生患兒中伴發(fā)ABO 溶血的概率為29.9%[9]，可見母嬰ABO 血型不合溶血病是膽紅素升高的主要病因。 另據(jù)報(bào)道，我國ABO-HDN 約占新生兒溶血病的85.3%[5]，ABO-HDN治療的重點(diǎn)是降低血清膽紅素，防止核黃疸的發(fā)生[4]。一般認(rèn)為，在產(chǎn)前通過測(cè)定孕婦血清中的免疫性抗體效價(jià)是預(yù)測(cè)母嬰血型不合溶血病發(fā)生及程度的重要依據(jù)之一[2-3]，本研究顯示，采用國產(chǎn)微柱凝膠試驗(yàn)技術(shù)對(duì)夫婦ABO 血型不合的3038 例O 型孕婦產(chǎn)前檢測(cè)其血清IgG 抗A（B）效價(jià)，效價(jià)≥256 的為1388 例，占45.69%，與姚文娟等[10]的研究結(jié)果48.60%相接近。產(chǎn)后臨床診斷為ABO-HDN 的209 例新生兒均為上述1388 例中的孕婦所分娩。 對(duì)此209 例新生兒出生后監(jiān)測(cè)其血清膽紅素并及時(shí)做HDN 三項(xiàng)試驗(yàn)， 本研究結(jié)果表明，209 例全部放散試驗(yàn)陽性，放散合并游離試驗(yàn)陽性的113 例，放散合并直抗+游離試驗(yàn)陽性的為63 例，可見免疫試驗(yàn)結(jié)果支持了臨床診斷，放散試驗(yàn)可作為確診ABO-HDN 的重要依據(jù)，以便對(duì)ABO-HDN 及早發(fā)現(xiàn)和治療，保護(hù)新生兒健康。

研究表明，ABO-HDN 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與母血清IgG 抗A（B）效價(jià)有一定相關(guān)性，隨其水平的升高而遞增[11-12]。一般認(rèn)為，以試管法檢測(cè)孕婦IgG 抗A（B）效價(jià)達(dá)到64 時(shí)[2-3]，則有發(fā)病的可能，如果其水平持續(xù)性升高，應(yīng)及時(shí)采取臨床干預(yù)措施。 以往常用于產(chǎn)前孕婦IgG血型抗體效價(jià)檢測(cè)的方法主要是試管抗人球蛋白試驗(yàn)，用該法測(cè)得孕婦IgG 抗體效價(jià)為64 時(shí)，即是預(yù)防ABO-HDN 有臨床意義的參考值。 微柱凝膠法以其較高的靈敏度、更簡(jiǎn)便的操作，目前已逐步取代傳統(tǒng)的試管法應(yīng)用于ABO-HDN 的產(chǎn)前檢測(cè)[6，11]，鑒于微柱凝膠技術(shù)用于產(chǎn)前IgG 抗體效價(jià)檢測(cè)比試管法具有更高的靈敏度，研究認(rèn)為各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在試驗(yàn)基礎(chǔ)上確立微柱凝膠技術(shù)相應(yīng)的參考值[2，7，13]，以避免靈敏度過高對(duì)正確分析病情造成干擾。對(duì)微柱凝膠技術(shù)參考值的確定，已有的研究報(bào)道觀點(diǎn)不盡相同，有學(xué)者認(rèn)為與傳統(tǒng)試管抗人球蛋白法差別不大，即以效價(jià)64 為參考值[14-15]；另有學(xué)者則認(rèn)為應(yīng)將效價(jià)設(shè)在128 左右[13，16]；還有學(xué)者認(rèn)為應(yīng)設(shè)在256 附近[17-18]。 本研究顯示，產(chǎn)后檢測(cè)確診的209 例ABO-HDN 患兒母體血清IgG 抗體效價(jià)，除3 例合并有G-6-PD 酶缺乏新生兒的母體抗體效價(jià)為128 外，其余的206 例抗體效價(jià)均≥256，考慮G-6-PD 缺乏是由于紅細(xì)胞不能激活戊糖磷酸的代謝途徑，并降低抗氧化能力，從而伴發(fā)高膽紅素血癥。 綜合上述結(jié)果，筆者提出應(yīng)用國產(chǎn)微柱凝膠技術(shù)產(chǎn)前檢測(cè)ABO-HDN 母體IgG 抗體效價(jià)以256 作為參考值是恰當(dāng)?shù)?，而正常參考范圍為?56 較為合理。 當(dāng)然，各實(shí)驗(yàn)室在將不同的微柱凝膠卡用于母體抗體效價(jià)檢測(cè)時(shí)，不同的操作程序及人員，也會(huì)導(dǎo)致其參考值出現(xiàn)差異。 因此，有必要根據(jù)試驗(yàn)建立各實(shí)驗(yàn)室的臨床參考值，根據(jù)各自科室的情況設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)，并把相關(guān)信息通知產(chǎn)科或新生兒科醫(yī)生。

當(dāng)前，臨床實(shí)驗(yàn)室常用于檢測(cè)母體IgG 類抗體的方法是傳統(tǒng)的試管法抗人球蛋白試驗(yàn)[6]。 1945 年，科學(xué)家Coombs 發(fā)明制備了抗IgG 類抗體的抗人免疫球蛋白抗體，以此搭橋使鹽水介質(zhì)中的相應(yīng)IgG 抗體和紅細(xì)胞發(fā)生肉眼可見的凝集反應(yīng)。 該技術(shù)也被稱之Coombs 實(shí)驗(yàn)，由此發(fā)現(xiàn)了很多新生兒溶血性疾病和輸血反應(yīng)是IgG 類抗體所致，而應(yīng)用傳統(tǒng)的鹽水血凝試驗(yàn)無法檢測(cè)。 半個(gè)多世紀(jì)以來，Coombs 試驗(yàn)始終是最經(jīng)典、 最準(zhǔn)確檢測(cè)不完全抗體（主要是IgG 類） 的方法。但由于傳統(tǒng)試管法Coombs 試驗(yàn)方法復(fù)雜，孵育時(shí)間長(zhǎng)等原因，不適用于大批量樣本的檢測(cè)。 1990 年，Lapierre 等[19]報(bào)道了檢測(cè)紅細(xì)胞抗原抗體反應(yīng)的一種新方法—微柱凝膠試驗(yàn)。 至今，在一些國家該方法已成為輸血相容性及HDN 相關(guān)抗體檢測(cè)的一種常規(guī)方法[20-21]。 微柱凝膠免疫檢測(cè)新技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)與凝膠分子篩技術(shù)相結(jié)合，即微柱凝膠免疫實(shí)驗(yàn)。 該技術(shù)的本質(zhì)是血凝試驗(yàn)，即紅細(xì)胞抗原抗體在微柱腔內(nèi)的凝膠介質(zhì)中發(fā)生肉眼可見的免疫凝集反應(yīng)。微柱凝膠Coombs 試驗(yàn)孵育后的紅細(xì)胞不需三洗，且該法孵育時(shí)間只需15 min，具有操作簡(jiǎn)便、影響因素少、結(jié)果可保存等優(yōu)點(diǎn)，尤其提高了免疫凝集試驗(yàn)的敏感性，使其能更廣泛地應(yīng)用在HDN 相關(guān)的母體IgG 類抗體檢測(cè)中[13]。 本研究顯示，確診的209 例ABO-HDN 中，206 例其患兒母血清IgG 抗體效價(jià)均達(dá)到或超過256，也說明了應(yīng)用微柱凝膠技術(shù)進(jìn)行產(chǎn)前效價(jià)的檢測(cè)確能對(duì)HDN 的發(fā)生發(fā)展趨勢(shì)做出一定的預(yù)判， 微柱凝膠法檢測(cè)孕婦IgG 血型抗體效價(jià)可作為評(píng)估HDN發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)之一[22]。

同時(shí)，本文檢測(cè)結(jié)果表明，IgG 抗體效價(jià)≥256（異常例數(shù)）的有1388 例，但確診的僅206 例，約85%的新生兒并未發(fā)病。 由此也表明，IgG 血型抗體效價(jià)并非判斷HDN 嚴(yán)重程度的唯一性指標(biāo)，HDN 的嚴(yán)重程度可能與很多因素有關(guān)，如母體抗體的IgG 亞型和糖基化、血型抗原的結(jié)構(gòu)、位點(diǎn)密度、發(fā)育成熟程度及在其他組織中的分布、IgG 抗體經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)的速率、胎兒脾臟功能成熟度、Fc 受體功能多態(tài)性的影響、人類白細(xì)胞抗原相關(guān)抑制抗體的影響等[7]。 因此有研究認(rèn)為，對(duì)于產(chǎn)前檢測(cè)效價(jià)持續(xù)升高者，還應(yīng)結(jié)合其他檢測(cè)項(xiàng)目，如羊水、B 超檢查等及孕婦臨床狀況綜合分析，做出判斷[12]。

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