兔脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞復(fù)合豬小腸黏膜下層構(gòu)建組織工程骨膜的實(shí)驗(yàn)研究

王光楠 陳 艷 秦書(shū)儉

1.解放軍第二〇五醫(yī)院顯微外科，遼寧錦州 121001；2.遼寧醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，遼寧錦州 121001

在臨床工作中，骨缺損修復(fù)一直沒(méi)有得到很好的解決，目前常把植骨術(shù)作為主要的方法。 植骨術(shù)可以分為3 種：自體來(lái)源植骨術(shù)、同種異體或異種植骨術(shù)以及組織工程骨植骨術(shù)。 前兩種方法由于供源不足、供區(qū)損傷、移植排斥反應(yīng)等影響而限制其在臨床工作中的廣泛應(yīng)用，但是組織工程骨移植可以克服這些不足和弊端，成為骨缺損修復(fù)的新方法。 在組織工程骨移植中，種子細(xì)胞的性能與生物材料的選擇，以及細(xì)胞和生物材料的復(fù)合情況是最為核心的部分，關(guān)系到組織工程產(chǎn)品的治療效果，而以及生物產(chǎn)品在使用中的安全性等各個(gè)方面。

脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是存在于脂肪組織基質(zhì)中的貼壁細(xì)胞，具有增殖能力強(qiáng)以及向多個(gè)方向分化的潛能[1-2]。其與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stem cells，BMSCs）相近的分子生物學(xué)特性[3-4]，而B(niǎo)MSCs 已經(jīng)應(yīng)用于同種異體組織工程化組織構(gòu)建以及組織修復(fù)的研究，ADSCs 是否具有與BMSCs 相似的修復(fù)特性，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)少見(jiàn)報(bào)道。 本研究旨在探討ADSCs 誘導(dǎo)產(chǎn)生的成骨細(xì)胞與豬小腸黏膜下層（small intestinal submucosa，SIS）支架復(fù)合構(gòu)建生物活性骨膜的可行性， 為進(jìn)一步應(yīng)用同種異體ADSCs 誘導(dǎo)產(chǎn)生的成骨細(xì)胞為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程骨修復(fù)骨缺損提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

成年健康日本大耳白兔10 只，體重2～2.5 kg，雌雄不限。 動(dòng)物由上海SLAC 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)：2007000520595。

1.2 方法

1.2.1 制備豬脫細(xì)胞SIS、兔ADSCs 培養(yǎng)及構(gòu)建組織工程骨膜

1.2.1.1 制備豬脫細(xì)胞SIS 采用物理方法處理及化學(xué)方法，按文獻(xiàn)[5]方法制備脫細(xì)胞小腸黏膜下層，凍干后用環(huán)氧乙烷消毒，備用。 具體方法如下：

物理方法處理：取屠宰4 h 內(nèi)經(jīng)過(guò)檢疫的健康成年豬的小腸，先使用清水洗凈，再挑選粗細(xì)均勻的管腔管壁沒(méi)有破損且無(wú)淋巴結(jié)的部位。 翻轉(zhuǎn)小腸，使黏膜面向外，清除小腸黏膜層直至黏膜下層暴露，再次翻轉(zhuǎn)小腸，使用包裹有紗布的刀柄去除漿膜層和肌層的組織。 用40℃水持續(xù)沖洗干凈。

化學(xué)方法：按文獻(xiàn)[5]方法制備，將經(jīng)過(guò)上述物理方法處理后的小腸首先進(jìn)行如下化學(xué)方法處理操作（以下所有操作均在室溫進(jìn)行， 處理的材料與溶液的體積比要始終保持在1∶100）：將用上述物理方法處理過(guò)的SIS 浸泡在含有乙二胺四乙酸（EDTA，100 mmol/L）和氫氧化鈉（100 mmol/L）溶液中，2 周后取出；然后用去離子水沖洗干凈后，在含有鹽酸（1 mmol/L）和氯化鈉（1 mmol/L）的溶液中（pH 0～1）浸泡6～8 h；用去離子水沖洗干凈后在氯化鈉（1 mmol/L）的磷酸鹽緩沖液中浸泡16 h；用去離子水沖洗后，在磷酸鹽緩沖液中（pH 7～7.14）中浸泡2 h；再用去離子水沖洗2 h；殺菌：將SIS 在含過(guò)氧乙酸（0.1%）的乙醇溶液（20%）中浸泡8 h， 再用含0.05%疊氮化鈉的磷酸鹽緩沖液清洗2 h，然后程序性降溫到-80℃，凍干后用環(huán)氧乙烷消毒，備用。

1.2.1.2 ADSCs 的獲取、原代和傳代培養(yǎng)及鑒定 取大白兔，麻醉取腹股溝部及腎下脂肪組織，PBS 沖洗，脂肪剪成直徑為1 mm 的3 個(gè)小塊， 置0.1%Ⅰ型膠原酶中，消化60 min，置于離心機(jī)以1000 r/min 離心10 min，棄去上清，采用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，置恒溫培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)，1∶2 傳代，擴(kuò)增培養(yǎng)。取第3 代細(xì)胞采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD29、CD34 的表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞鑒定。1.2.2.3 ADSCs 成骨誘導(dǎo) 對(duì)照組：取第3 代細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，DMEM 培養(yǎng)基（含50 μmol/L 抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉以及0.1 μmol/L 地塞米松的）培養(yǎng)，每隔3 d 換液1 次。 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞基本長(zhǎng)滿之后，用0.25%胰酶，0.01%EDTA 消化后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 實(shí)驗(yàn)組：培養(yǎng)基更換為加入成骨誘導(dǎo)劑的DMEM 培養(yǎng)基，其他步驟同對(duì)照組。

1.2.1.3 ADSCs 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞與SIS 復(fù)合 組織工程骨膜（以下用“M”表示）的復(fù)合：于操凈工作臺(tái)修剪SIS 與培養(yǎng)板6 孔和96 孔的孔徑大小基本一致，取6 孔及96 孔培養(yǎng)板，經(jīng)消毒滅菌后，每孔加入BSA（600 μL/50 μL），置于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中12 h后，取由ADSCs 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞，傳2 代后制成兩種濃度的細(xì)胞懸液（5×104/孔、5×103/孔），分別接種于6孔和96 孔板中，置于37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中復(fù)合培養(yǎng)10 d，每3 天更換培養(yǎng)液1 次。 觀察、檢測(cè)ADSCs 復(fù)合SIS 構(gòu)建的M。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)

1.2.2.1 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài) 倒置光學(xué)顯微鏡下觀察原代及傳至3 代ADSCs 的生長(zhǎng)情況以及形態(tài)變化特點(diǎn)。

1.2.2.2 誘導(dǎo)成骨細(xì)胞檢測(cè) 成骨誘導(dǎo)第12 天， 每組取一塊6 孔培養(yǎng)板，按照堿性磷酸酶顯色試劑盒要求進(jìn)行BCIP/NBT 染色，顯微鏡下觀察拍照。 對(duì)照組處理方法及時(shí)間同實(shí)驗(yàn)組。

1.2.2.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線情況 用胰酶-EDTA 消化誘導(dǎo)后傳至第2 代成骨細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞密度為3×103個(gè)，體積為200 μL/孔。每個(gè)培養(yǎng)板設(shè)10 孔為實(shí)驗(yàn)組，6 孔設(shè)為對(duì)照組，總共接種6 板。置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1、3、5、7、10 d后，各取1 板，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組每孔加入5 mg/mL MTT，每孔20 μL，培養(yǎng)4 h 后，吸棄培養(yǎng)孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，于自動(dòng)酶標(biāo)儀上（λ=490 nm）檢測(cè)各個(gè)孔的吸光度值，數(shù)據(jù)以（s）表示，橫坐標(biāo)以時(shí)間，縱坐標(biāo)以吸光度值制作細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，觀察誘導(dǎo)后傳至第2 代成骨細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.2.2.4 檢測(cè)M 中的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）表達(dá)情況 取M 的6 孔板，從復(fù)合培養(yǎng)10 d 之后，分別取0、5、10、15 d 為時(shí)間點(diǎn)，吸除成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，先用PBS 沖洗2 次，然后在各孔中加入400 μL的1%TritonX-100 溶液，放置在4℃的冰箱中過(guò)夜之后，取出50 μL 的細(xì)胞裂解液，依據(jù)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作：設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)管以及測(cè)定管；每組測(cè)定管均加入0.5 mL 的緩解液、50 μL 的細(xì)胞上清液和0.5 mL 的基質(zhì)液。 在混勻之后，放置在37℃的水浴箱中孵育15 min，然后再加入105 mL 顯色劑，充分混勻后，在波長(zhǎng)為520 nm 處測(cè)定各孔的吸光度。根據(jù)相應(yīng)空白管以及標(biāo)準(zhǔn)管的吸收值計(jì)算ALP 的含量，ALP=測(cè)定管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度×標(biāo)準(zhǔn)管含酚量（0.1×0.005）×（100/0.005），取平均值，結(jié)果用金氏單位（U/100 mL）表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析， 正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，采用Oneway ANOVA 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SIS 大體形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

經(jīng)物理機(jī)械及化學(xué)方法處理獲得的SIS 呈淺乳白色半透明薄膜狀。 見(jiàn)圖1、2。

圖1 物理法制成的豬小腸黏膜下層

圖2 化學(xué)處理后的干燥豬小腸黏膜下層

2.2 原代及傳代細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果

原代培養(yǎng)的細(xì)胞在接種8 h 后，貼壁細(xì)胞為成纖維樣形態(tài)細(xì)胞，ADSCs 則是懸浮在培養(yǎng)瓶的底部。 細(xì)胞接種24 h 后，ADSCs 達(dá)到85%貼壁， 體積開(kāi)始小、形態(tài)為圓形透明狀態(tài)；在2～4 d 時(shí)貼壁細(xì)胞的逐漸伸展，體積逐漸增大，外形為短梭形或多角形，細(xì)胞多數(shù)為單核，而且核仁清晰，細(xì)胞之間互相連接，形態(tài)類(lèi)似成纖維細(xì)胞。 在7 d 左右細(xì)胞數(shù)量明顯增多，貼壁細(xì)胞呈現(xiàn)團(tuán)簇狀或漩渦狀排列狀態(tài)， 部分形成細(xì)胞集落，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形，細(xì)胞間排列緊密，常伴有2～3 個(gè)突起，細(xì)胞核大，呈扁圓形。 在接種14 d 時(shí)，貼壁的ADSCs 匯合成單層細(xì)胞，基本鋪滿于整個(gè)瓶底。部分集落細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)脂肪顆粒，貼壁細(xì)胞由梭形形態(tài)逐漸變?yōu)闄E圓形形態(tài)。 見(jiàn)圖3A～D。

傳代后細(xì)胞呈長(zhǎng)梭型及多角形貼壁分布，形態(tài)大小較一致，突起減少，增殖迅速，一般3～4 d 即可匯合成單層，平行或漩渦狀排列。 各代細(xì)胞于形態(tài)上無(wú)明顯變化。

流式細(xì)胞表型分析結(jié)果顯示：貼壁細(xì)胞高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志物CD29（93.58%），CD44（91.16%），僅表達(dá)少量的造血干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志物CD34（0.96%），確定貼壁細(xì)胞為ADSCs。見(jiàn)圖3E～G。

圖3 倒置顯微鏡下脂肪干細(xì)胞一般狀態(tài)觀察及流式細(xì)胞鑒定結(jié)果

2.3 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞倒置顯微鏡觀察結(jié)果

細(xì)胞在成骨細(xì)胞誘導(dǎo)后， 生長(zhǎng)速度明顯變慢，細(xì)胞形態(tài)逐漸由梭形變?yōu)槿切巍⒍嘟切?，有?shù)個(gè)突起（圖4）。 隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞均出現(xiàn)重疊生長(zhǎng)，形成多個(gè)散在的細(xì)胞結(jié)節(jié)、基質(zhì)堆積，在細(xì)胞結(jié)節(jié)中央?yún)^(qū)形成礦化結(jié)節(jié)。 對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)無(wú)改變。

圖4 成骨細(xì)胞誘導(dǎo)第8 天倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)（200×）

2.4 ALP 染色觀察結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞ALP 表達(dá)陽(yáng)性， 表現(xiàn)為細(xì)胞漿被染成藍(lán)色（圖5，封三）。 對(duì)照組細(xì)胞漿未被染色（圖6，封三）。

圖5 實(shí)驗(yàn)組堿性磷酸酶染色（200×）（見(jiàn)內(nèi)文第7頁(yè)）

圖6 對(duì)照組堿性磷酸酶染色（200×）（見(jiàn)內(nèi)文第7頁(yè)）

2.5 由ADSCs 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

實(shí)驗(yàn)組ADSCs 誘導(dǎo)成骨細(xì)胞在第1～5 天， 細(xì)胞數(shù)目增殖變化不大， 第7 天起細(xì)胞大量增加達(dá)到頂點(diǎn)，1 周后生長(zhǎng)速度略有減慢。 見(jiàn)圖7。

圖7 脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)的第2 代成骨細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.6 M 表面細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

M 表面ADSCs 誘導(dǎo)成骨細(xì)胞在第1～3 天， 細(xì)胞數(shù)目增殖變化不大，6 d 達(dá)到峰值， 之后速度又減慢。見(jiàn)圖8。

2.7 ALP 定量表達(dá)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，相同時(shí)間點(diǎn)ALP 活性明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。 實(shí)驗(yàn)組M培養(yǎng)后5 d 表達(dá)明顯增多，并且達(dá)到最高值，在10～15 d都有不同程度降低。 見(jiàn)表1。

圖8 組織工程骨膜表面細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

表1 兩組不同時(shí)間點(diǎn)的堿性磷酸酶活性比較（n = 10，U/100 mL，s）

表1 兩組不同時(shí)間點(diǎn)的堿性磷酸酶活性比較（n = 10，U/100 mL，s）

組別 0 d 5 d 10 d 15 d對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組P 值0.64±0.15 3.96±0.33＜0.01 0.65±0.17 9.43±4.15＜0.01 0.37±0.15 8.36±0.24＜0.01 0.76±0.17 8.05±0.33＜0.01

3 討論

骨組織工程的研究熱點(diǎn)是將具備良好成骨能力的種子細(xì)胞接種到生物相容性良好、有利于種子細(xì)胞黏附生長(zhǎng)的生物支架材料上體外復(fù)合培養(yǎng)，從而構(gòu)建出具有成骨活性的植骨材料，即組織工程化骨。 一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，具有成骨潛能的種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合有較強(qiáng)的成骨能力[6]。

ADSCs 在含有成骨誘導(dǎo)劑的特定條件下可以向成骨細(xì)胞分化[7-12]。在本實(shí)驗(yàn)中采用地塞米松、β-甘油磷酸鈉和抗壞血酸加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，作為成骨誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)液。 地塞米松促進(jìn)ADSCs 早期成骨分化是通過(guò)與干細(xì)胞上的糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合，從而激活干細(xì)胞表面的受體， 促進(jìn)ADSCs 的ALP 活性表達(dá)增強(qiáng)。也有研究表明地塞米松通過(guò)增強(qiáng)其受體與基因組中靶序列的親和力從而調(diào)控分化細(xì)胞中的基因表達(dá)，提高ALP 活性，促進(jìn)成骨分化。 在成骨誘導(dǎo)后期地塞米松可誘導(dǎo)干細(xì)胞發(fā)生礦化；β-甘油磷酸鈉可釋放磷酸根，為提供干細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生鈣沉積所需要的磷離子， 為細(xì)胞礦化提供離子環(huán)境，促進(jìn)生理性鈣鹽沉積；抗壞血酸可以通過(guò)延長(zhǎng)Ⅰ型膠原轉(zhuǎn)錄因子的半衰期從而使Ⅰ型膠原mRNA 的含量增加，促進(jìn)膠原合成。 這些調(diào)控因子的聯(lián)合應(yīng)用為ADSCs 體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)提供了良好環(huán)境[13-17]。

本研究中ADSCS 在成骨誘導(dǎo)后， 生長(zhǎng)速度明顯變慢，細(xì)胞形態(tài)逐漸由梭形變?yōu)槿切?、多角形，有?shù)個(gè)突起。隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞均出現(xiàn)重疊生長(zhǎng)，形成多個(gè)散在的細(xì)胞結(jié)節(jié)，基質(zhì)堆積，在細(xì)胞結(jié)節(jié)中央?yún)^(qū)形成礦化結(jié)節(jié)。

本研究將兔的ADSCS 誘導(dǎo)而成的成骨細(xì)胞與SIS 復(fù)合構(gòu)建組織工程骨膜后進(jìn)行成骨生長(zhǎng)特性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞在SIS 膜上表現(xiàn)為M 表面細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，可見(jiàn)M 表面ADSCs生長(zhǎng)情況，1～3 d 增殖緩慢。證實(shí)細(xì)胞在組織工程骨膜上生長(zhǎng)狀態(tài)很好，而且SIS 具有一定的促進(jìn)成骨細(xì)胞分裂作用。

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