宣肺清熱合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立

陳群力 李 潔 楊 駿 周淑琴 趙春草 吳 飛

1.上海健康醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，上海 201318；2.上海市黃浦區(qū)香山中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，上海 200020；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)教育部工程研究中心，上海 201203

宣肺清熱合劑是上海市黃浦區(qū)香山中醫(yī)醫(yī)院的醫(yī)院制劑，處方由麻黃、黃芩、桑白皮、枳殼、浙貝母、桔梗、甘草、苦杏仁、魚腥草9 味中藥組成，主要用于治療慢性支氣管炎所致的痰黃、咳喘等癥，長期的臨床實踐證明其宣肺止咳平喘效果顯著[1-3]，但制劑的工藝水平和質(zhì)量控制不夠合理[3-4]，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有檢查項。為更好地控制制劑質(zhì)量、保證臨床療效，需建立定性鑒別和定量測定方法，提高質(zhì)量控制水平，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高和修訂提供依據(jù)[5-7]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Agilent 1200 型，美國安捷倫科技有限公司），半自動薄層點樣儀（Linomat 5 型瑞典卡瑪科技有限公司），分析天平（TE214S 型，0.1 mg，德國賽多利斯科技有限公司）， 分析天平 （XP205 型，0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多科技有限公司），超純水機（Milli-Q 型，密理博中國科技有限公司），離心機（TGL-18C 型，上海安亭科學(xué)儀器廠），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R2003KE 型，上海申生科技有限公司），干燥箱（DZF-6050 型號，上海一恒科技有限公司），電熱套（PTHW型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），pH 計（PHS-3E型，上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥

黃芩苷對照品（批號：110715-201016），枳殼對照藥材（批號：120981-200403），桑白皮對照藥材（批號：121124-200903）均購自中國藥品生物制品檢定所。硅膠G 板購自煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司。 色譜純乙腈、甲醇均購自美國Merck 公司；其余試劑均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

宣肺清熱合劑（批號分別為120607、120609 和120611，規(guī)格：200 mL/瓶）和陰性樣品，均由上海市黃浦區(qū)香山中醫(yī)醫(yī)院藥劑科提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 枳殼薄層鑒別[8]229-230取5 mL 樣品，加水稀釋至20 mL，用乙醚萃取2 次，每次20 mL，棄去乙醚液，合并水溶液，再用乙酸乙酯提取2 次，每次20 mL，合并乙酸乙酯提取液，水浴蒸干，殘渣加甲醇1 mL 溶解，作為供試品溶液。取0.2 g 枳殼（麩炒）對照藥材，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 mL 使溶解，作為對照藥材溶液。

照薄層色譜法（《中國藥典》2010 年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各5 μL，點于同一塊硅膠G 板， 以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15︰40︰22︰10）在5～10℃下放置12 h 后分取的下層液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液顯色，105℃烘干， 在366 nm 下檢視。 供試品色譜中，比移值（Rf）約0.4 的位置處顯藍(lán)黃色斑點，Rf 約0.6 的位置處顯藍(lán)色斑點。 同法制得的供試品陰性樣品色譜中，未見有相應(yīng)斑點。 見圖1（封三）。

2.1.2 桑白皮薄層鑒別[8]280取5 mL 樣品，加水稀釋至20 mL，加鹽酸調(diào)節(jié)pH 至1～2，過濾，濾液用乙酸乙酯振搖萃取2 次，每次20 mL，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，殘渣加1 mL 甲醇溶解，得供試品溶液。 取2 g 桑白皮對照藥材，加20 mL 飽和碳酸氫鈉溶液，超聲20 min，濾過，濾液加鹽酸調(diào)節(jié)pH 至1～2，靜置30 min，濾過，濾液用乙酸乙酯振搖萃取2 次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加1 mL 甲醇溶解，作為對照藥材溶液。

照薄層色譜法（《中國藥典》2010 年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液各5 μL，點于同一塊硅膠G 板，以二氯甲烷-甲醇（5︰1）為展開劑，展開，取出，晾干，在366 nm 下檢視。 供試品色譜中，Rf 約0.8 的位置處顯藍(lán)黃色熒光斑點。 同法制得的供試品陰性樣品色譜中，未見有相應(yīng)斑點。 見圖2（封三）。

圖1 宣肺清熱合劑中枳殼的TLC 鑒別

圖2 宣肺清熱合劑中桑白皮的TLC 鑒別

2.2 黃芩苷含量測定

2.2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-水-磷酸（47︰53︰0.2），流速為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm，柱溫為3℃，進樣體積10 μL，理論塔板數(shù)以黃芩苷計不低于5000。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷對照品適量， 以乙醇溶解， 制得濃度分別為259.44 μg/mL 和164.69 μg/mL 的黃芩苷對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取宣肺清熱合劑樣品0.1 mL，置于10 mL 容量瓶中，加水至刻度，搖勻；取一部分溶液于塑料離心管內(nèi)，以5000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液，以0.45 μm 微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 按照工藝制備宣肺清熱合劑陰性樣品（缺黃芩），按照“2.2.3”項下配制陰性樣品溶液。

2.2.5 專屬性試驗 將黃芩苷對照品、供試品溶液和陰性樣品溶液按“2.2.1”項下條件下分別進樣，記錄色譜圖，黃芩苷的保留時間為13.4 min 左右（圖3）。 高效液相色譜圖顯示在黃芩苷峰位處，陰性樣品中無雜質(zhì)干擾，方法專屬性良好。

圖3 宣肺清熱合劑中黃芩苷高效液相色譜測定

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密移取濃度為259.44 μg/mL的黃芩苷對照品溶液適量， 加乙醇制成濃度分別為3.24、32.43、64.86、97.29、129.72、194.58 和259.44 μg/mL的對照品溶液，分別進樣10 μL，記錄色譜圖，以峰面積對黃芩苷的進樣質(zhì)量（μg）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為Y=3×106X－23 620，r = 0.9996。 結(jié)果表明，在0.032～2.59 μg 范圍內(nèi)，峰面積與黃芩苷進樣質(zhì)量呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗 取濃度為64.86 μg/mL 黃芩苷對照品溶液，重復(fù)進樣6 次，峰面積RSD 為0.08%，表明進樣精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取宣肺清熱合劑樣品（批號120607），按“2.2.3”項下制備，于0、1、2、4、8、16 和24 h 進行測定，峰面積RSD 為0.9%，結(jié)果表明在24 h 內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性試驗 取宣肺清熱合劑樣品（批號120607），按“2.2.3”項下制備，平行處理6 份，測定峰面積，峰面積RSD 為1.9%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

根據(jù)外標(biāo)法計算供試品溶液中黃芩苷的濃度為77.05 μg/mL，宣肺清熱合劑中黃芩苷含量為7.70 mg/mL。2.2.10 回收率試驗 取0.05 mL 宣肺清熱合劑樣品（批號120607，濃度7.70 mg/mL）9 份置于10 mL 容量瓶中，作為低、中、高水平組分別加入濃度為164.69 μg/mL的黃芩苷對照品2.0、3.0 和4.0 mL，每個濃度3 份，按照“2.2.3”項下操作，依次定容、搖勻、離心、過濾，進樣測試，記錄色譜圖，計算黃芩苷各濃度水平的加樣回收率。結(jié)果表明，平均加樣回收率為100.08%，RSD 為1.6%，回收率符合要求。 見表1。

表1 黃芩苷含量測定加樣回收試驗結(jié)果

2.2.11 樣品測定 按照上述驗證的方法， 取不同批次的宣肺清熱合劑測定黃芩苷的含量， 批號120607、120609 和120611 的樣品中黃芩苷的含量分別為7.70、7.94、7.75 mg/mL。 按照3 批樣品計算，以均值的80%作為含量下限[9-12]，每瓶宣肺清熱合劑中黃芩苷應(yīng)不少于1240 mg。

3 討論

已有研究通過建立制劑中麻黃堿和偽麻黃堿的高效液相色譜鑒定法來提高其質(zhì)量控制水平[3，13]。 本研究針對方中另一味君藥黃芩建立其指標(biāo)性成分的含量測定方法，并進行了方法學(xué)驗證，除此之外還對枳殼和桑白皮建立了定性鑒別的方法，有效提升了制劑的質(zhì)量控制水平。

枳殼的薄層色譜鑒別試驗中， 對于樣品的前處理，藥典和多數(shù)文獻均是直接采用甲醇提取[14-17]，本實驗在研究過程中發(fā)現(xiàn)，簡單的前處理無法避免陰性干擾，所以先采取乙醚萃取除雜，然后用乙酸乙酯萃取得到有效成分，制得符合要求的樣品用以薄層色譜點樣分析。實驗中曾考察了以水溶性較好的柚皮苷作為對照品，但是在目前的展開條件下Rf 不到0.1，所以未設(shè)定此指標(biāo)成分的對照鑒別。

桑白皮的鑒別試驗中，藥典中桑白皮藥材的薄層色譜鑒別采用聚酰胺作為固定相，有研究采用硅膠G板作為固定相，展開劑類型各異[18-20]。本研究采用硅膠G 板作為固定相，對展開劑進行了優(yōu)化，分別考察了乙酸乙酯-二氯甲烷-環(huán)己烷、 二氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-水、 二氯甲烷-甲醇、 二氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-水等作為展開劑，最后選定了二氯甲烷-甲醇作為展開劑。

在定性鑒別試驗中，還考察了苦杏仁藥材的薄層色譜鑒別方法[21-22]。 分別使用乙醚萃取除雜后正丁醇萃取、 乙酸乙酯萃取和氯仿萃取3 種方法制備樣品，以藥典方法[8]187-188制備對照藥材（除了除雜溶劑為石油醚外，其余條件均不變），與苦杏仁苷對照品一起點樣于硅膠G 板，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15︰40︰22︰10）5～10℃下放置12 h 分取下層作為展開劑，分別在紫外燈（366 nm）下直接檢視，以磷鉬酸硫酸溶液噴霧顯色后檢視（日光下和紫外燈366 nm 下）。實驗結(jié)果表明，由于苦杏仁苷極性較小，無法從藥材轉(zhuǎn)移到制劑產(chǎn)品中，而對于對照藥材來說，通過優(yōu)化展開條件后仍不能有效排除陰性樣品的干擾，故未建立鑒別方法。

基于有效的臨床經(jīng)驗方開發(fā)醫(yī)院制劑和提高現(xiàn)有醫(yī)院制劑的質(zhì)量控制水平是現(xiàn)代中藥復(fù)方制劑研究政策支持的重要方向，也是研究的熱點方向。 提高現(xiàn)有醫(yī)院制劑質(zhì)量控制水平的手段包括增加含量的測定指標(biāo)，增加定性鑒別指標(biāo)，將定性鑒別項提升為定量測定項，增加檢查項，提高對檢查項的控制水平等。 本研究課題組建議增加一些特殊的質(zhì)量控制項目， 對一些傳統(tǒng)制劑環(huán)節(jié)或技術(shù)的現(xiàn)代研究形成標(biāo)準(zhǔn)，如散劑的含量均勻度檢查，貴重藥材的混合均勻度檢查等[23]。 基于有效的臨床經(jīng)驗方進行醫(yī)院制劑的開發(fā)進而進行中藥新藥的研發(fā)，也是上海等地的藥品相關(guān)部門大力鼓勵的藥品研究方向[24]。 幾十年來的中藥新藥研發(fā)觀念認(rèn)為， 提取工藝可以采用水提取、醇提取、水提取醇沉淀等方式，通過藥效學(xué)或者正交試驗的對比優(yōu)選最佳工藝及參數(shù)。 本研究組認(rèn)為，來自于臨床經(jīng)驗方的中藥制劑研發(fā)應(yīng)受到更多的約束：制劑用藥材應(yīng)與臨床用法保持一致（炮制及產(chǎn)地），制劑的提取工藝應(yīng)與臨床用法保持一致（提取溶劑和煎煮程度），藥物服用特點也應(yīng)與臨床用法保持一致（服用時間、方法和頻率）。

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