高糖對小鼠足細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響

葉迅 侯鵬超 洪郁芝

高糖對小鼠足細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響

葉迅 侯鵬超 洪郁芝

目的 通過觀察高糖環(huán)境下小鼠足細(xì)胞表達(dá)NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7的變化，探討高糖損傷足細(xì)胞的機(jī)制。方法 將培養(yǎng)成熟的小鼠足細(xì)胞用RandA 1.0軟件完全隨機(jī)分為高糖1、2、3組（葡萄糖濃度分別為15、25和30mmol/L）和對照組（葡萄糖濃度5mmol/L），倒置顯微鏡下觀察高糖干預(yù)前后足細(xì)胞的形態(tài)變化，采用RT-PCR和Western blot技術(shù)分別檢測足細(xì)胞NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7的mRNA和蛋白表達(dá)變化。結(jié)果 與對照組相比，高糖環(huán)境下培養(yǎng)48h后，足細(xì)胞形態(tài)發(fā)生不同程度變化。NEPH1和Smad7的mRNA表達(dá)較對照組顯著減少（P＜0.05或0.01），desmin和TGF-β1的mRNA表達(dá)較對照組增加（P＜0.05或0.01）。其中高糖2組的NEPH1和Smad7的蛋白表達(dá)較對照組顯著減少（均P＜0.01），而desmin和TGF-β1的蛋白表達(dá)較對照組顯著增加（P＜0.01）。小鼠足細(xì)胞在高糖培養(yǎng)下NEPH1 mRNA和desmin mRNA的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.993，P＜0.01）；NEPH1 mRNA和TGF-β1 mRNA的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.989，P＜0.01）；TGF-β1 mRNA的表達(dá)和Smad7 mRNA的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.996，P＜0.01）。結(jié)論 高糖可能通過激活TGF-β/Smad信號通路誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化。

高糖 足細(xì)胞 表型轉(zhuǎn)化 NEPH1 Smad7

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of high-glucose on epithelial-mesenchymal transition in mouse podocytes.Methods Matured mouse podocytes were cultured and randomly divided into controlgroup(5mmol/LD-glucose)and different high glucose groups(15,25 and 30 mmol/L D-glucose,respectively)by means of RandA1.0 randomized software.Morphological changes of podocytes were examined with inverted microscope and expression changes of NEPH1,desmin,TGF-β1 and Smad7 mRNAand protein were detected by RT-PCR and Western blot,respectively.Results Matured podocytes incubated with high glucose were converted from arborized cells into cobblestone appearance after 48h culture.Compared with the control group,the expression ofNEPH1 and Smad7 mRNA in pedocytes cultured with different high glucose were significantly decreased (P＜0.05 or 0.01);meanwhile,the expressions ofdesmin and TGF-β1mRNAin pedocytes cultured with different doses ofhigh glucose were significantly increased in comparison with those ofcontrolgroup(P＜0.05 or 0.01).The protein expressions ofNEPH1 and Smad7 were significantly decreased while those ofdesmin and TGF-β1 were significantly increased in 25mmol/Lglucose group compared with control group(P＜0.01).The expression of NEPH1 mRNA was negatively correlated with that of desmin mRNA (r=-0.993,P＜0.01)and TGF-β1mRNA(r=-0.989,P＜0.01).The expression ofTGF-β1 mRNAwas negatively correlated with that ofSmad7 mRNAin mouse podocyte exposed to high glucose (r=-0.996,P＜0.01).Conclusion The phenotypic transformation of mouse podocytes can be possibly induced by high glucose via activating the TGF-β/Smad signalpathway.

目前已知足細(xì)胞脫落或凋亡是導(dǎo)致糖尿病腎病發(fā)生進(jìn)行性腎小球硬化和腎臟纖維化的關(guān)鍵因素[1]。近年來的研究顯示，成熟足細(xì)胞的上皮細(xì)胞樣表型標(biāo)志蛋白在高糖環(huán)境、糖基化終產(chǎn)物等有害刺激誘導(dǎo)下，表達(dá)下降或消失，向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），即足細(xì)胞喪失特異性標(biāo)志物，發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，是其脫落或凋亡的關(guān)鍵病理學(xué)變化，也是導(dǎo)致足細(xì)胞功能紊亂和產(chǎn)生蛋白尿的潛在病理機(jī)制[2-3]。TGF-β/Smad信號通路在足細(xì)胞EMT過程中起重要的調(diào)節(jié)作用[4]。Smad7是TGF-β/Smad信號通路中起負(fù)反饋?zhàn)饔玫姆肿?，一旦Smad7的表達(dá)量明顯減少，TGF-β/ Smad信號通路的活性會增強(qiáng)，從而啟動足細(xì)胞EMT。本研究通過觀察不同濃度高糖體外干預(yù)小鼠足細(xì)胞發(fā)生EMT，及對TGF-β/Smad信號通路的影響，探討高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象及試劑 小鼠足細(xì)胞（英國倫敦大學(xué)國王學(xué)院Guy′s醫(yī)院贈送），RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS，美國GIBCO公司），γ-干擾素（美國PEPROTECH公司），葡萄糖（中國大冢制藥有限公司）。Trizol提取試劑盒（美國Invitrogen公司），RT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），RCR引物（上海生工生物工程公司）。NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7抗體（美國SANTA CRUZ公司），蛋白Marker（美國Thermo公司），SDSPAGE凝膠試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠足細(xì)胞的復(fù)蘇、凍存與傳代 復(fù)蘇-196℃液氮罐凍存的小鼠足細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶液1ml室溫下消化，細(xì)胞變圓、細(xì)胞間隙增寬時終止消化，置33℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育，待細(xì)胞長至80%～90%融合時再傳代培養(yǎng)。

1.2.2 小鼠足細(xì)胞培養(yǎng) 將復(fù)蘇的小鼠足細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有5ml 10%FBS1640培養(yǎng)液的25cm2培養(yǎng)瓶，每瓶加入500U γ-干擾素。置33℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育，細(xì)胞增殖傳代后，轉(zhuǎn)移入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱分化成熟。將成熟的足細(xì)胞以4×104/cm2的密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長至80%～90%融合時再次傳代，直到在37℃培育箱中培養(yǎng)滿14d。

1.2.3 高糖干預(yù)小鼠足細(xì)胞 37℃培養(yǎng)滿14d，細(xì)胞處于70%～80%融合時，加入無血清培養(yǎng)液饑餓24h使細(xì)胞同步化后根據(jù)10%FBS1640培養(yǎng)液要求，分別配置成含有5、15、25和30mmol/L的葡萄糖細(xì)胞培養(yǎng)液。將分化成熟為樹枝狀的小鼠足細(xì)胞20瓶，采用RandA 1.0軟件完全隨機(jī)分組法分為4組：高糖1、2、3組（葡萄糖濃度分別為15、25和30mmol/L）和對照組（葡萄糖濃度5mmol/L），每組5瓶足細(xì)胞在不同濃度的葡萄糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育48h后供檢測各組足細(xì)胞 NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7的表達(dá)。

1.2.4 RT-PCR半定量檢測小鼠足細(xì)胞NEPH1、desmin、TGF-β1、Smad7和GAPDH mRNA的表達(dá) Trizol試劑和氯仿抽提足細(xì)胞總RNA，微量核酸測量儀（美國Thermo公司）測定每個RNA樣品的濃度（ng/μl）；逆轉(zhuǎn)錄酶M-MulV催化下合成cDNA；在DNA自動擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。25μl反應(yīng)體系中含10×buffer 2.5μl，dNTP 10μl，引物正反義鏈各10μl，TaqDNA聚合酶1.25U，cDNA 1μl，加去離子水至終體積25μl。PCR引物均根據(jù)已知的小鼠NEPH1、desmin、TGF-β1、Smad7和GAPDH設(shè)計，見表1。試驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 PCR引物序列

1.2.5 擴(kuò)增反應(yīng)條件 在94℃2min進(jìn)行預(yù)變性后，NEPH1：94℃30s、56.9℃30s、72℃30s，進(jìn)行35個循環(huán)。desmin：95℃3min，進(jìn)入循環(huán)，94℃30s、58.7℃30s、72℃60s，進(jìn)行34個循環(huán)。TGF-β1：94℃30s、59.6℃30s、72℃60s，進(jìn)行33個循環(huán)。Smad7：94℃30s、59.1℃30s、72℃60s，進(jìn)行35個循環(huán)。GAPDH：94℃30s、59.8℃30s、72℃30s，進(jìn)行25個循環(huán)。完成循環(huán)后，在72℃2min進(jìn)行終延伸。陰性對照以雙蒸水替代cDNA。各PCR產(chǎn)物與DNA Marker（上海生工生物工程公司）在1.7%瓊脂糖凝膠（含0.5μg/ml溴化乙錠），0.5%TBE液中電泳（100V，30min），用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像，凝膠定量軟件Quantity-one分析其光密度值，以GAPDH為內(nèi)參照基因，比較各目的基因條帶與內(nèi)參照基因條帶的光密度比值。

1.2.6 Western blot檢測高糖2組和對照組小鼠足細(xì)胞NEPH1、desmin、TGF-β1和 Smad7蛋白的表達(dá) 用RIPA冰上提取細(xì)胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度，按照測定濃度添加4×上樣緩沖液和雙蒸水，使蛋白上樣量為20μg，并使上樣體積達(dá)到20μl。取各組細(xì)胞蛋白在100℃變性5min，然后與Marker一起行SDS-PAGE電泳，后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1h后與NEPH1、desmin、TGF-β1、Smad7和GAPDH兔抗小鼠一抗抗體（稀釋度分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000和1∶10 000）結(jié)合，洗膜后與山羊抗兔IgG（目的蛋白1∶5 000，內(nèi)參1∶40 000）雜交1h，洗膜后顯影。凝膠定量軟件Quantity-one掃描其光密度值，以NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7條帶與內(nèi)參GAPDH條帶的光密度值之比值代表目的蛋白的相對含量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時采用Tamhane檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠足細(xì)胞在不同溫度條件下形態(tài)變化 見圖1（插頁）。

由圖1可見，在33℃條件下細(xì)胞呈現(xiàn)“鵝卵石狀”，胞體較小，在小鼠γ-干擾素誘導(dǎo)下不斷地增生傳代；在37℃條件下，經(jīng)1～2周逐漸長出足突，胞體變大，足突與足突之間相互連接，足細(xì)胞逐漸分化成熟為“樹枝狀”。

2.2 各組足細(xì)胞 NEPH1、desmin、TGF-β1和 Smad7 mRNA的表達(dá) 見表2、圖2。

表2 各組足細(xì)胞NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7 mRNA的表達(dá)

圖2 各組足細(xì)胞NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7 mRNA的表達(dá)電泳圖（M：標(biāo)準(zhǔn)參照物；A：對照組；B：高糖1組；C：高糖2組；D：高糖3組）

由表2可見，與對照組相比，在不同濃度的高糖培養(yǎng)液孵育48h后，足細(xì)胞NEPH1和Smad7 mRNA表達(dá)顯著減少差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05或0.01），且NEPH1 mRNA的表達(dá)以高糖2組減少最明顯，高糖3組的表達(dá)反而較高糖2組增加（P＜0.05）；Smad7 mRNA表達(dá)在高糖2、3組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），但與高糖1組相比表達(dá)顯著減少差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。不同濃度高糖組足細(xì)胞desmin和TGF-β1 mRNA的表達(dá)較對照組顯著增多（P＜0.05或0.01）。高糖2、3組之間desmin mRNA和TGF-β1 mRNA的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），但兩者均較高糖1組顯著增多（均P＜0.01）。

2.3 對照組和高糖2組小鼠足細(xì)胞NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7蛋白的表達(dá) 見表3、圖3。

表3 對照組和高糖2組小鼠足細(xì)胞NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7蛋白的表達(dá)

圖3 對照組和高糖2組小鼠足細(xì)胞NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7蛋白的表達(dá)

由表3可見，與對照組相比，高糖2組小鼠足細(xì)胞在25mmol/L高糖培養(yǎng)液孵育48h后，表達(dá)NEPH1和Smad7蛋白顯著減少而desmin和TGF-β1蛋白顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。

2.4 兩因素間的相關(guān)性分析 小鼠足細(xì)胞在濃度從低到高的葡萄糖培養(yǎng)下NEPH1 mRNA和desmin mRNA的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.993，P＜0.01）；NEPH1 mRNA和TGF-β1 mRNA的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.989，P＜0.01）；TGF-β1 mRNA和desmin mRNA的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.991，P＜0.01）；TGF-β1 mRNA和Smad7 mRNA的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.996，P＜0.01）。

3 討論

晚近的研究發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞的脫落和凋亡明顯滯后于蛋白尿的發(fā)生，當(dāng)糖尿病大鼠模型中出現(xiàn)明顯的微量白蛋白尿時，腎小球足細(xì)胞的數(shù)量并沒有明顯的改變。導(dǎo)致早期足細(xì)胞功能受損、形成蛋白尿的機(jī)制可能和足細(xì)胞在持續(xù)的高糖環(huán)境誘導(dǎo)下，上皮細(xì)胞樣表型標(biāo)志蛋白表達(dá)下降或消失，向EMT有關(guān)，而后期出現(xiàn)的大量蛋白尿則與足細(xì)胞脫落和凋亡有關(guān)，并且足細(xì)胞EMT是脫落和凋亡之前的一個可逆過程。足細(xì)胞發(fā)生EMT時，將失去成熟足細(xì)胞的上皮細(xì)胞樣表型標(biāo)志物，而表達(dá)上調(diào)間充質(zhì)細(xì)胞樣表型標(biāo)志物。表型轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞樣的足細(xì)胞凋亡增多，且和腎小球基底膜的黏附力下降。導(dǎo)致足突融合、引發(fā)蛋白尿。在以蛋白尿?yàn)樘卣鞯奶悄虿∧I病發(fā)生發(fā)展過程中，EMT可能是導(dǎo)致足細(xì)胞功能失調(diào)和蛋白尿的共同始發(fā)途徑。若深入研究其發(fā)生機(jī)制，并阻斷調(diào)節(jié)該過程的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，將會有效逆轉(zhuǎn)足細(xì)胞的EMT，從而減輕腎小球?yàn)V過屏障損傷、減少糖尿病腎病蛋白尿。

NEPH1是裂孔隔膜上的重要的組成蛋白和信號分子，當(dāng)基因突變或者蛋白缺失時會破壞裂孔隔膜的完整性，導(dǎo)致足突融合、蛋白尿。越來越多的臨床和動物研究提示NPHS1基因編碼的nephrin蛋白參與糖尿病腎病足細(xì)胞EMT過程，雖然NEPH1和nephrin有相似的結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位，兩者的基因缺失均可導(dǎo)致足突融合、蛋白尿[5]。但在高糖環(huán)境下NEPH1是否參與足細(xì)胞EMT目前尚缺乏實(shí)驗(yàn)證據(jù)。當(dāng)足細(xì)胞因各種原因發(fā)生損傷時，可大量表達(dá)desmin蛋白并發(fā)生表型轉(zhuǎn)化。后者可作為光鏡下足細(xì)胞損傷的標(biāo)志性蛋白。

本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度高糖培養(yǎng)48h后，小鼠足細(xì)胞與對照組相比形態(tài)、表型均發(fā)生明顯變化；NEPH1 mRNA表達(dá)顯著減少，desmin mRNA表達(dá)顯著增多，從低到高濃度葡萄糖培養(yǎng)下NEPH1和desmin mRNA的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)；與對照組相比，高糖2組NEPH1的蛋白表達(dá)顯著減少，而desmin的蛋白表達(dá)則顯著增加；均表明足細(xì)胞在高糖誘導(dǎo)下發(fā)生了EMT。此外，本研究觀察到小鼠足細(xì)胞發(fā)生EMT的程度并非呈葡萄糖濃度依賴性增加，NEPH1 mRNA表達(dá)減少以高糖2組最明顯，在高糖3組NEPH1 mRNA表達(dá)反而有所上調(diào)，desmin mRNA表達(dá)增加在這兩組之間無統(tǒng)計學(xué)差異，NEPH1這種表達(dá)上調(diào)是否與NEPH1相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的上下游分子調(diào)節(jié)有關(guān)，值得研究。

TGF-β是誘導(dǎo)足細(xì)胞和小管上皮細(xì)胞EMT的主要介質(zhì)，在介導(dǎo)EMT中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。糖尿病腎病患者和小鼠模型纖維化的腎臟均普遍存在TGF-β表達(dá)的上調(diào)[6]。目前認(rèn)為高糖可通過TGF-β/Smad信號途徑介導(dǎo)足細(xì)胞損傷。Smad7是TGF-β/Smad信號通路中起負(fù)反饋?zhàn)饔玫姆肿?，一旦Smad7的表達(dá)量減少，該通路活性會增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)近曲小管上皮細(xì)胞Smad7的表達(dá)下調(diào)可能是腎臟近曲小管發(fā)生EMT的啟動因素[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，不同濃度高糖培養(yǎng)48h后小鼠足細(xì)胞Smad7 mRNA表達(dá)顯著減少，TGF-β1mRNA表達(dá)顯著增多，從低到高濃度葡萄糖培養(yǎng)下TGF-β1和Smad7的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)；高糖2組足細(xì)胞Smad7的蛋白表達(dá)較對照組顯著減少，而TGF-β1的蛋白表達(dá)較對照組顯著增加。提示高糖可能通過誘導(dǎo)Smad7表達(dá)下調(diào)后激活TGF-β/Smad信號途徑，啟動足細(xì)胞發(fā)生EMT。此外，本研究觀察到小鼠足細(xì)胞Smad7 mRNA表達(dá)下調(diào)和TGF-β1 mRNA表達(dá)增加并非呈葡萄糖濃度依賴性，在高糖2、3組表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異，提示高糖誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞EMT作用似乎存在一個濃度平臺期。

綜上所述，高糖誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化是導(dǎo)致早期

足細(xì)胞功能受損、糖尿病腎病早期微量蛋白尿發(fā)生的病理機(jī)制。同時，Smad7表達(dá)下調(diào)可能是高糖激活TGF-β/ Smad信號途徑，促使足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的因素之一。因此，研發(fā)抑制TGF-β/Smad信號通路的活化，靶向保護(hù)足細(xì)胞的藥物，有望在糖尿病腎病早期抑制甚至部分逆轉(zhuǎn)足細(xì)胞的EMT，延緩蛋白尿的發(fā)生。

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（本文編輯：章潔）

本刊可直接用縮寫的常用詞匯

Impact of high-glucose on epithelial-mesenchymal transition in mouse podocytes

YE Xun,HOU Pengchao,HONG Yuzhi.
Department of Endocrinology,Hangzhou Traditional Chinese Medical Hospital,Hangzhou 310007，China

High glucose Podocyte Phenotypic transformation NEPH1 Smad7

白細(xì)胞介素（IL）變異系數(shù)（CV）丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）丙型肝炎病毒（HCV）磁共振成像（MRI）蛋白質(zhì)印跡（Western blot）低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）動脈血氧二氧化碳分壓（PaCO2）動脈血氧分壓（PaO2）輔助性T淋巴細(xì)胞（Th）干擾素（IFN）甘油三酯（TG）高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）核因子-κ（NF-κB）紅細(xì)胞沉降率（ESR）活化部分凝血活酶時間（APTT）獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）甲型肝炎病毒（HAV）接受者操作特征曲線（ROC曲線）精制結(jié)核菌素試驗(yàn)（PPD）磷酸鹽緩沖液（PBS）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）凝血酶時間（TT）凝血酶原時間（PT）曲線下面積（AUC）人類免疫缺陷病毒（HIV）腎小球?yàn)V過率（GFR）食品藥品管理局（FDA）世界衛(wèi)生組織（WHO）隨機(jī)對照試驗(yàn)（RCT）胎牛血清（FBS）體重指數(shù)（BMI）天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）纖維蛋白原（Fb）血管性血友病因子（vWF）血紅蛋白（Hb）嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）乙型肝炎病毒（HBV）乙型肝炎病毒表面抗體（抗-HBs）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）乙型肝炎病毒e抗體（抗-HBe）乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）乙型肝炎病毒核心抗體（抗-HBc）直接膽紅素（DBil）腫瘤壞死因子（TNF）重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）總膽固醇（TC）總膽紅素（TBil）最小抑菌濃度（MIC）

2014-09-25）

浙江省中醫(yī)藥科學(xué)研究基金計劃（2012ZA097）；杭州市科委醫(yī)療衛(wèi)生及重點(diǎn)專科專病科研攻關(guān)專項(xiàng)（20130733Q16）

310007 杭州市中醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科

洪郁芝，E-mail：hyzhcy@aliyun.com