飼料磷脂水平對巴丁魚肝臟脂肪沉積及脂肪代謝酶活性的影響

■麻艷群 黃 凱 戴曉玲 于 丹 陳 濤

（廣西大學(xué)動物科技學(xué)院，廣西南寧 530005）

巴丁魚（Pangasius sutchi）是我國新興的一種名貴淡水養(yǎng)殖品種，隸屬于鯰形目，科，圓腹屬，又稱暹羅河鲇、虎頭鯊、八珍魚或巴沙魚，主要分布在東南亞一帶，原產(chǎn)于泰國、馬來西亞等國[1]，我國近年來開始引種馴養(yǎng)。該魚無小骨刺，肉質(zhì)細嫩，口味鮮美。巴丁魚在生長過程中，腹腔內(nèi)會逐漸積累三塊較大的油脂肪，可達到體重的5%～8%，這一特征在其它魚類極為罕見。巴丁魚在越南等地也因此而被稱呼為“卡巴沙”——“三塊脂肪魚”。目前國內(nèi)外對巴丁魚營養(yǎng)生理方面的研究尚屬空白[2-4]。脂肪肝是一種在養(yǎng)殖魚類中較為常見的營養(yǎng)性疾病。營養(yǎng)不平衡的配合飼料，養(yǎng)殖密度過大，養(yǎng)殖模式不當(dāng)?shù)纫蛩囟加锌赡軐?dǎo)致養(yǎng)殖魚類營養(yǎng)代謝紊亂，造成肝臟脂肪代謝失調(diào)、沉積，脂肪含量升高，肝臟病變，脂肪肝發(fā)生。有研究表明，高等動物的肝臟和肌肉均能作為脂肪的貯存位點，體內(nèi)脂肪合成酶的活性也能很快適應(yīng)食物的變化，使脂肪代謝得以有效進行[5]；但在魚類，脂肪的貯存位點主要在肝臟，體內(nèi)脂肪合成酶的活性需要2～3周方可適應(yīng)食物的變化[6]，因此，魚類比高等動物更容易發(fā)生脂肪肝問題。磷脂是指分子中含有磷酸的復(fù)合脂，在自然界里廣泛存在。有報道表明磷脂對脂肪的轉(zhuǎn)運具有重要的作用，它參與脂肪酸代謝，有助于脂肪的溶解和吸收，降低血漿和肝臟中的脂肪含量[7-8]。本試驗以不同水平磷脂飼料飼喂巴丁魚，研究各組巴丁魚肝臟脂肪沉積、脂肪合成相關(guān)酶活性及組織學(xué)變化情況，探討其脂肪代謝規(guī)律，以期通過營養(yǎng)調(diào)控方式預(yù)防魚類營養(yǎng)性脂肪肝發(fā)生，為磷脂在巴丁魚人工飼料中的實際生產(chǎn)應(yīng)用，推廣養(yǎng)殖巴丁魚提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用魚

巴丁魚（Pangasius sutchi）由廣西水產(chǎn)引育種中心提供。馴養(yǎng)7 d后選擇規(guī)格基本一致、健康活力好的魚苗900尾[初始體重約(1.45±0.08)g/尾]，隨機分成5組，每組設(shè)3個重復(fù)，每重復(fù)60尾魚，每重復(fù)的魚放養(yǎng)于一個水泥池（規(guī)格為1.52 m×1 m×1 m）里。

1.1.2 飼料

以豆粕、生物E蛋白、白魚粉、α-淀粉、米糠等為基礎(chǔ)飼料，在該基礎(chǔ)上添加不同比例的大豆磷脂（磷脂含量65%），配制成5組飼料（見表1）。各組的磷脂水平分別為0%（PL0組）、1%（PL1組）、2%（PL2組）、3%（PL3組）和4%（PL4組）。

1.2 飼養(yǎng)管理

各組使用相應(yīng)的飼糧。每天9∶00和17∶00投喂，日投喂量一般為魚體重的3%，以每次投食在1 h內(nèi)吃完為宜。飼養(yǎng)周期為56 d。飼養(yǎng)期間于每日清晨投喂前用虹吸法吸出飼料殘渣和糞便，換水1/3，水源為曝氣后的自來水。試驗期間平均水溫(27.5±1.0)℃，pH值6.9±0.5，溶解氧(7.10±0.34)mg/l，氨氮(0.03±0.01)mg/l。每日觀察記錄各池魚體活動及采食情況。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 魚體成分分析

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，每重復(fù)取10尾魚，解剖取肝臟，按照AOAC（1984）法測定其粗脂肪含量。計算公式如下：

肝臟脂肪含量(%)=100×肝臟脂肪量/肝重。

表1 各組飼料組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）(%)

1.3.2 肝臟組織切片的制備

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，每重復(fù)取3尾魚解剖，取出肝臟組織固定在Bouin's緩沖液中，做組織切片，HE染色，用以觀察肝臟組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.3.3 脂肪合成相關(guān)酶酶活測定

比色法測定與脂肪合成相關(guān)酶的蘋果酸脫氫酶（NADP-malate dehydrogenase，NADP-MDH）和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（Glucose-6-phosphate dehydroge?nase,G-6-PDH）的活性。

1.3.3.1 酶液的調(diào)制

參照周長海的方法[9]進行部分修改。每重復(fù)取魚10尾，用軟布擦干后迅速解剖取出肝臟，用電子天平稱取0.5 g左右肝臟樣品，倒進勻漿器，加入兩倍體積(約1.0 ml)的預(yù)冷1 mmol/l EDTA-2Na溶液和0.25 mol/l蔗糖溶液(1∶1)，勻漿10 min。勻漿液于4℃9 800 r/min離心10 min，取上清液，4℃ 1 2 000 r/min再離心30 min。取上清液，將其分成兩份，一份以1 mmol/l EDTA-2Na溶液和0.25 mol/l蔗糖溶液稀釋3倍，用于測定NADP-MDH活性；另一份稀釋6倍，用于測定G-6-PDH活性。

酶液蛋白質(zhì)濃度采用南京建成生物工程研究所的總蛋白定量試劑盒（考馬斯亮藍法）進行測定。

1.3.3.2 NADP-MDH活性測定

依據(jù)周長海的方法[9]進行。試管中加入于25℃預(yù)溫過的0.25 M雙甘氨二肽1.2 ml（以2 mol/l NaOH調(diào)pH值為7.4）。依次加入0.05 M MnCl20.24 ml；675 μM β-NADP 0.8 ml；0.03 M L-malate(pH值為7.4)0.2 ml；0.25 M 蔗糖 0.51ml；1 mM EDTA-1Na 0.51 ml并混勻，隨后加入前期準(zhǔn)備好的0.05 ml酶液。震動混勻，測定吸光度（波長340 nm）。

1.3.3.3 G-6-PDH活性測定

依據(jù)周長海等(2004)的方法[9]進行。試管中加入于25℃預(yù)溫過的50 mM三乙醇2.65 ml（以0.1 M NaOH調(diào)pH值為7.5）。依次加入酶液0.25 ml；30 mM的β-NADP 0.05 ml；混合后在分光光度儀中培養(yǎng)2 min；加入40 mM G-6-磷酸二鈉0.05 ml使反應(yīng)開始，在340 nm下測定吸光度。空白對照試驗都使用去離子水進行。

1.3.3.4 兩種酶活計算公式

酶活=[V/(ε×D×P×v)]×[△e/△t]×1 000[nmol/(min×mg]。

式中：V——反應(yīng)溶液最終總量；

ε——測定時NADP的分子吸光度系數(shù)(一般默認ε=6)；

D——光路長（1 cm）；

P——酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）；

v——酶液量（ml）；

△e/△t——單位時間內(nèi)的吸光度變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（X±SE）”表示。用SPSS11.5軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)合Dun?can's多重比較法，顯著水平采用＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 飼料磷脂對肝臟脂肪含量的影響（見表2）

表2 飼料磷脂對巴丁魚肝臟脂肪含量的影響（%）

肝臟脂肪含量以PL0組的為最高，達（3.71±0.47）%，顯著高于PL2組（P＜0.05）（見表2）。

2.2 飼料磷脂對巴丁魚肝臟組織學(xué)的影響

各組肝臟組織切片觀察結(jié)果見圖1。由肝臟組織切片圖可以看出，肝臟中部分肝細胞內(nèi)的細胞核發(fā)生偏移，細胞膜模糊，部分細胞核消失，肝細胞漿內(nèi)含有程度不同的脂肪油滴，出現(xiàn)脂肪空泡，嚴重程度依次為PL0組＞PL1組＞PL4組。PL2組和PL3組肝臟細胞形狀較規(guī)則，其整齊度、分布均勻度較之前述3組的情況要好，脂肪空泡也較少；PL2和PL3組間差異不明顯。

2.3 飼料磷脂對巴丁魚脂質(zhì)合成相關(guān)酶活性的影響（見表3）

由表3可以看出，試驗中NADP-MDH活性呈現(xiàn)“U”型變化：對照組的NADP-MDH活性最高（P＜0.05），其次為PL1組，PL3組最低，之后隨著飼料磷脂添加水平的提高，PL4組的NADP-MDH活性又升高，但仍顯著低于對照組（P＜0.05）。

肝臟中的G-6-PDH活性也體現(xiàn)出類似于NADPMDH的“U型”變化：對照組的G-6-PDH活性顯著高于PL2、PL3、PL4組(P＜0.05)，PL1組、PL2組、PL3組隨著磷脂添加水平的提高逐步降低，到了PL4組，活性又升高。

3 討論

3.1 飼料磷脂對魚體脂肪含量的影響

魚類沒有像哺乳類的皮下脂肪層，其脂肪多數(shù)蓄積于肝臟、肌肉和腹脂等部位[10]，肌肉和腹脂是長期儲存部位，而肝臟卻是短期儲存部位，因此它比肌肉和腹脂更容易受到外源物質(zhì)的影響[11]。

Meyers[12]認為，在飼料中添加磷脂，能增加載脂蛋白的脂肪運輸能力，降低脂肪沉積，從而防治脂肪肝，保護肝臟。Fontagne等[13]通過觀察錦鯉（Cyprinus car?pio）仔魚組織發(fā)現(xiàn)飼料中若缺乏磷脂則會使仔魚腸部細胞的脂肪小滴聚積。曹俊明等[14]報道，飼料中添加5%的大豆磷脂，52 d后草魚（Ctenopharyngodon idellus）肝胰臟脂肪含量會大幅度降低。本試驗結(jié)果與前人報道相一致，添加了磷脂的4個處理組魚體肝臟脂肪含量均比對照組有不同程度的降低，這表明飼料中適宜的磷脂水平會促進脂肪代謝，能在一定程度上降低魚體肝臟中的脂肪沉積。

3.2 飼料磷脂對肝臟組織學(xué)的影響

圖1 巴丁魚肝臟組織學(xué)觀察

表3 飼料磷脂對巴丁魚脂質(zhì)合成相關(guān)酶活性的影響[nmol/(min·mg)]

有研究表明，磷脂對脂肪的轉(zhuǎn)運具有重要的作用，有助于脂肪的溶解和吸收，降低肝臟脂肪含量。Izquierdo等(2000)發(fā)現(xiàn)，給金頭鯛（Sparus aurata）仔魚投喂低水平磷脂飼料，魚腸道黏膜和肝組織內(nèi)會有大量脂肪空泡存在，而在飼料中添加大豆磷脂則能顯著增加仔魚腸道脂蛋白的含量，增強脂肪運輸能力[15]。Olsen等（2003）報道[16]，在飼料中補充大豆磷脂能使虹鱒（Oncorhynchus mykiss）魚腸上皮細胞形態(tài)正常，脂滴積累減少。本試驗對肝臟組織學(xué)的觀察結(jié)果與前人的研究報道基本一致，未添加磷脂的對照組出現(xiàn)脂肪空泡的程度最嚴重，顯現(xiàn)輕度脂肪肝癥狀；其次較嚴重的是1%磷脂水平組，這可能是因為磷脂能通過直接或間接的作用影響到乳糜微粒脂蛋白的合成，增強脂類的運輸能力，而當(dāng)飼料中缺乏磷脂或磷脂水平不足時，脂肪運輸能力下降，脂肪難以從肝臟向肝外組織轉(zhuǎn)運，從而脂肪沉積加重，肝臟組織切片圖顯示大量脂肪空泡積累。和2%、3%磷脂水平組相比，4%磷脂水平的肝臟也積累了較多的脂肪空泡，這或許是因為飼料中添加4%的磷脂已超過了該階段巴丁魚機體的磷脂需要量，因而非但未能有效地提高脂肪運輸能力，反而在實質(zhì)上增加了肝臟脂肪代謝的負擔(dān)，脂肪也逐漸堆積在肝細胞內(nèi)。

3.3 飼料磷脂對脂肪代謝酶活性的影響

NADP-MDH是生物體三羧酸循環(huán)中最后一個氧化還原酶，可以將氧化型輔酶Ⅱ（NADP）還原成還原型輔酶Ⅱ（NADPH）[17]；G-6-PDH是戊糖磷酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶，能催化G-6-Pi脫氫產(chǎn)生5-磷酸戊糖和NADPH，不管是NADP-MDH還是G-6-PDH，它們催化反應(yīng)的產(chǎn)物都有NADPH，而NADPH是動物體內(nèi)脂肪酸合成以及碳鏈延長的重要輔酶，為脂肪酸合成提供氫原子[18]，NADPH在體內(nèi)的供應(yīng)狀況會直接影響到脂質(zhì)的合成代謝，因此NADP-MDH與G-6-PDH在肝臟內(nèi)的活性大小和NADPH的生成量直接相關(guān)，進而影響肝臟內(nèi)脂質(zhì)的合成代謝[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，飼喂高膽固醇日糧的小鼠，其肝臟內(nèi)脂肪酸合成有關(guān)的酶活性升高，肝臟因聚積了太多的脂肪而受損[20]；在飲食誘導(dǎo)肥胖的小鼠脂肪組織里G-6-PDH活性顯著升高[21]。豬背膘中的NADPH生成酶的活性與其胴體脂肪率、背膘厚呈正相關(guān)，與瘦肉率呈負相關(guān)，因此也有研究人員指出，豬背和膝外層脂肪中NADPMDH和G-6-PDH活性可作為肉用性狀早期選種的遺傳標(biāo)記，早期選育瘦肉型豬時，以NADPH生成酶活性為標(biāo)準(zhǔn)強于以背膘厚度為標(biāo)準(zhǔn)[22-23]。

本試驗結(jié)果中，NADP-MDH和G-6-PDH活性隨著飼料磷脂水平的添加均呈現(xiàn)“U”型變化，這有可能是因為在飼料缺乏磷脂或磷脂水平不足時，脂肪在肝臟沉積加重，機體需要增強脂質(zhì)代謝酶活性去適應(yīng)脂肪代謝的需要；而當(dāng)飼料中添加的磷脂含量超過了該階段機體的需要量，肝臟脂肪代謝負擔(dān)增加時，肝臟內(nèi)脂質(zhì)代謝酶活性也會相應(yīng)增加。

結(jié)合肝臟組織切片圖，我們發(fā)現(xiàn)，盡管對照組、PL1組的魚體已增強了脂質(zhì)合成酶的活性，但其肝臟組織內(nèi)仍存有較多的脂肪油滴，肝臟脂肪含量大，這或許說明了魚體對相應(yīng)飼料日糧做出的主動代償性增強并不足以真正滿足機體脂質(zhì)代謝的需要，因此在生產(chǎn)養(yǎng)殖中，要預(yù)防“營養(yǎng)性脂肪肝”的發(fā)生，合理配制人工飼料尤為重要。

4 結(jié)論

①在巴丁魚幼魚飼料中添加適宜的磷脂（3%），能有效降低魚體肝臟中的脂肪沉積。

②當(dāng)飼料缺乏磷脂或磷脂過量時，肝臟脂肪沉積增多，脂肪合成相關(guān)酶的活性補償性升高。