二氫楊梅素誘導凋亡抗腫瘤作用

左彥珍， 孫大永， 畢紅東， 丁 實， 周 健， 魯艷杰

（1.承德醫(yī)學院藥理教研室，河北 承德067000；2.承德市中心醫(yī)院放化療中心，河北 承德067000；3.承德醫(yī)學院病理教研室，河北承德067000）

二氫楊梅素誘導凋亡抗腫瘤作用

左彥珍1， 孫大永2*， 畢紅東1， 丁 實1， 周 健1， 魯艷杰3

（1.承德醫(yī)學院藥理教研室，河北 承德067000；2.承德市中心醫(yī)院放化療中心，河北 承德067000；3.承德醫(yī)學院病理教研室，河北承德067000）

目的以HeLa細胞為研究對象，研究二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）的誘導凋亡作用，進一步研究和驗證DMY誘導腫瘤凋亡的作用和機制，為探索研發(fā)治療宮頸癌新藥提供思路的同時，對DMY在抗腫瘤方面的應用提供進一步的資料。方法倒置顯微鏡觀察給藥后細胞形態(tài)的變化，MTT實驗研究DMY對于HeLa細胞的抗腫瘤作用，流式細胞術研究DMY對HeLa細胞的誘導凋亡作用，Western b1otting檢測促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bc1-2表達水平，進一步探討其機制。結果DMY濃度越大，對HeLa細胞的抑制作用越明顯，48 h的IC50約125μg/m1；流式細胞術顯示在DMY為140μg/mL時HeLa細胞凋亡明顯；Western b1otting結果顯示DMY可誘導HeLa細胞中Bax蛋白表達增加，同時Bc1-2蛋白減少。結論DMY可以通過誘導HeLa細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。

二氫楊梅素；細胞凋亡；宮頸癌；流式細胞術

二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）是葡萄科藤茶植物黃酮提取物中的主要活性成分二氫黃酮類化合物，近些年研究顯示DMY可以通過抑制侵襲、抗增殖、促凋亡等機制發(fā)揮抗腫瘤的作用，很可能成為一種低毒高效的抗腫瘤藥物。另外有研究顯示黃酮類化合物還可以增加腫瘤放化療的敏感性［1］。宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，2008年的統(tǒng)計資料顯示，宮頸癌是女性第三常見的惡性腫瘤，居婦科惡性腫瘤發(fā)病率首位，新發(fā)病例52.9萬，85%發(fā)生在發(fā)展中國家，死亡病例27.4萬［2］，且近二十年來發(fā)病日趨年輕化，嚴重威脅著女性的身體健康和生命。手術、放療、化療和綜合治療是治療癌癥的主要手段。手術治療是早、中期宮頸癌的一種重要治療手段，有較好的治療效果，但經根治術治療后約有30%未控或者復發(fā)［3］。手術輔以化療能夠提高治愈率，降低復發(fā)和轉移風險，提高生存率，改善患者生存質量［4］，但是目前臨床上常用的化療藥物多為順鉑、5-氟尿嘧啶等細胞毒類藥物，毒副作用比較重。本研究以HeLa細胞為對象，研究二氫楊梅素對宮頸癌的抗腫瘤作用，探索二氫楊梅素誘導腫瘤凋亡的作用和機制，以期探索和研發(fā)新的抗宮頸癌藥物，為提高宮頸癌的治愈率提供新思路，同時也為二氫楊梅素在抗腫瘤方面的應用開發(fā)提供進一步的資料。

1 材料

二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）國家標準物質對照品，批號MUST-13013108，純度99%以上。改良型RPMI-1640培養(yǎng)液、PBS磷酸鹽緩沖液、胎牛血清 （FBS）均購自HyC1one公司，0.25%胰酶（Sigma），培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板（Corning），流式細胞凋亡試劑盒（聯科生物）。Bc1-2和Bax為兔抗人單克隆抗體（EPITOMICS公司）。宮頸癌HeLa細胞系由承德醫(yī)學院中心實驗室提供。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 人宮頸癌HeLa細胞加入含100 U/m L青霉素和100μg/mL鏈霉素的10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞長滿培養(yǎng)皿的80%左右，用0.25%含EDTA的胰酶消化傳代。取對數生長期細胞進行實驗，倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)和生長狀態(tài)。

2.2 MTT法檢測二氫楊梅素對HeLa細胞抗增殖作用 取對數生長期細胞，消化收集細胞，并將細胞密度調整至1× 104個/mL，按照實驗的不同分組，于96孔板中每孔接種0.1mL，每組設6個復孔，分別設空白組、對照組和不同藥物濃度組。24 h后細胞貼壁并處于對數生長期時，將培養(yǎng)基換成含不同濃度二氫楊梅素的等體積培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，在培養(yǎng)結束前4 h每孔加入5 mg/mLMTT 10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心棄培養(yǎng)基，每孔加入150μL DMSO，使結晶充分溶解，酶標儀490 nm處檢測各孔吸光度，計算細胞生長抑制率（抑制率=對照組OD-藥物組OD）/對照組OD×100%），并利用IC50軟件計算藥物的IC50值。實驗重復4次，取平均值。

2.3 流式細胞術分析細胞凋亡 對數生長期HeLa細胞，以不同濃度二氫楊梅素作用48h后用不含EDTA的胰酶消化制成單細胞懸液，按照流式凋亡試劑盒的步驟收集細胞，并加入相應的AV、PI染色，用BD FACSCa1ibur流式細胞儀在激發(fā)波長488nm處檢測細胞凋亡情況，并用隨機軟件進行分析，實驗重復3次。

2.4 Western b1otting檢測Bax和Bc1-2的蛋白表達 對數生長期細胞給予不同質量濃度二氫楊梅素 （0、100、140 μg/mL）作用48 h，加入裂解液充分裂解，低溫反復凍融3次，4℃，12 000 r/min離心15 min，取上清，提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒進行定量，SDS-PAGE電泳，穩(wěn)壓電泳進行聚偏乙烯 （PVDF）膜轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗按一定比例稀釋后 （Bc1-2、Bax：1∶1 000，βactin：1∶1 000）4℃孵育過夜，分別加入HRP標記的山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h，增強型化學發(fā)光（ECL），顯影，免疫印跡條帶應用Quntity One 4.62軟件進行定量分析。

2.5 統(tǒng)計學方法 應用統(tǒng)計學處理軟件SPSS 17.0進行單因素方差分析，數據以表示，選取P＜0.05為顯著性檢驗標準。

3 結果

3.1 二氫楊梅素對HeLa細胞形態(tài)的影響 不同質量濃度二氫楊梅素對HeLa細胞處理48 h后，可見空白對照組細胞生長貼壁良好，細胞間隙小，形態(tài)均一，呈胖三角形團簇狀生長，克隆增殖良好；隨著二氫楊梅素質量濃度的增高，細胞固縮變圓，細胞間隙明顯增大，貼壁能力下降，克隆增殖能力下降明顯，細胞密度同對照組相比明顯減少（圖1）。

圖1 不同質量濃度二氫楊梅素作用HeLa細胞48 h后形態(tài)變化 （×40）

3.2 MTT法檢測二氫楊梅素對HeLa細胞的抗增殖作用

不同質量濃度二氫楊梅素作用48 h后，HeLa細胞的增殖明顯被抑制 （P＜0.05），且隨著二氫楊梅素質量濃度的增加，抑制作用越顯著，其IC50約125μg/mL。見圖2。

圖2 二氫楊梅素對HeLa細胞的體外抗增殖作用（n=6）

3.3 流式細胞儀檢測二氫楊梅素對HeLa細胞的誘導凋亡作用 流式細胞儀檢測顯示，經不同質量濃度的二氫楊梅素 （0、100、140μg/mL）干預48 h后，HeLa細胞的凋亡率分別為15.36%±2.6%、35.43%±1.6%、75.08%± 5.8%，可見隨著藥物質量濃度的增加，凋亡也越明顯（P＜0.01），尤其140μg/m L組大部分細胞已經凋亡 （P＜0.01），見圖3。

3.4 Western b1otting檢測蛋白表達 β-actin條帶各組表達均一，總蛋白量相同。二氫楊梅素干預后，可見隨著藥物質量濃度的增加，Bax表達逐漸增加，Bc1-2表達逐漸減少，尤其140μg/mL組顯著（P＜0.05）；與MTT結果一致（圖4）。

4 討論

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和治療中起著重要的作用，通過誘導和調控凋亡通路來誘導腫瘤細胞凋亡是目前治療腫瘤的一個重要途徑［5］。另外誘導腫瘤細胞凋亡是黃酮類化合物增加放化療治療敏感性，降低治療副反應的重要途徑之一［1］。二氫楊梅素是我國近幾年開發(fā)的新的黃酮類化合物，有研究顯示二氫楊梅素可以通過誘導腫瘤細胞AGZY-83-a凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用［6］。研究黃酮類化合物二氫楊梅素通過誘導凋亡途徑在HeLa細胞發(fā)揮抗腫瘤作用不僅可以為宮頸癌的治療提供新的思路，也可以進一步明確二氫楊梅素發(fā)揮抗腫瘤作用的機制，為二氫楊梅素在抗腫瘤和腫瘤增敏治療藥物開發(fā)利用方面提供實驗資料。

圖3 流式細胞術AV/PI雙染檢測不同質量濃度二氫楊梅素誘導HeLa細胞的凋亡（n=3）

圖4 Western blotting檢測不同質量濃度二氫楊梅素作用后Bax/Bcl-2蛋白表達（n=3）

MTT實驗顯示二氫楊梅素在體外對HeLa細胞有抗增殖作用，并且隨著藥物質量濃度的增加作用也越顯著。誘導細胞凋亡是藥物發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機制之一，因此實驗進一步通過流式細胞術檢測了二氫楊梅素對HeLa細胞的誘導凋亡作用，結果同MTT一致，隨著藥物濃度的增加HeLa細胞凋亡率也明顯增加。

Bc1-2家族蛋白在細胞凋亡調控信號中起著重要作用，按其功能主要分為兩大類：即促凋亡蛋白Bax、Bak、Bid和抗凋亡蛋白Bc1-2、Bc1-xL等［7］。Bc1-2可通過調控細胞膜通透性來阻止細胞色素C釋放，從而阻止細胞凋亡的級聯反應。Bc1-2的高表達已成為腫瘤細胞逃逸凋亡的重要機制之一，抑制Bc1-2表達可明顯上調腫瘤細胞的凋亡率。而凋亡蛋白Bax的功能恰恰相反，位于細胞質的Bax受到凋亡信號的刺激后，形成二聚體并插入線粒體膜，從而誘導線粒體膜的電位降低，促進細胞色素C釋放，誘發(fā)細胞凋亡級聯反應［8］。Bc1-2與Bax可相互拮抗，當細胞受到促凋亡因素刺激時，兩者的比率決定細胞的存亡［9］。當Bc1-2/Bax比值上調時，細胞對死亡的信號反應性就會降低，從而使凋亡受到抑制；Bc1-2/Bax比值下調時，細胞對死亡信號的反應性增強，促進了凋亡的發(fā)生［10］。在甘草酸對人肺癌細胞A549的研究中顯示下調抑凋蛋白Bc1-2表達和上調促凋蛋白Bax表達可以誘導細胞的凋亡［11］；白藜蘆醇可以通過提高Bc1-2/Bax蛋白表達比減少神經細胞凋亡［12］；槲皮素可以通過調控Bax蛋白增加和Bc1-2蛋白減少而抑制小細胞肺癌H446的增殖并促進其凋亡［13］。本研究中蛋白印跡結果顯示二氫楊梅素質量濃度越高Bax蛋白表達量越高，而Bc1-2蛋白表達則減少。提示MTT實驗中二氫楊梅素抗增殖和流式實驗中二氫楊梅素誘發(fā)凋亡可能與下調Bc1-2/Bax比值有關。由此可見，二氫楊梅素與其他黃酮類化合物一樣都能促進細胞凋亡，這種促進凋亡的作用與下調Bc1-2/Bax比值有關。

綜上所述，本研究顯示二氫楊梅素對宮頸癌HeLa細胞有抗腫瘤作用，其機制可能與激活了Bc1-2/Bax參與調控的凋亡通路有關。二氫楊梅素發(fā)揮抗腫瘤作用是否還與其它通路有關需要進一步研究，另外二氫楊梅素在體內是否也能發(fā)揮抗腫瘤作用我們將做進一步研究。但是有研究顯示二氫楊梅素不僅在體外能夠抑制乳腺癌等腫瘤細胞的增殖［14］，活體條件下也可以顯著抑制人肺癌GLC82裸鼠移植瘤和人肝癌Be1-7402裸鼠移植瘤的生長［15-16］，并且劉德育等發(fā)現二氫楊梅素在不產生毒素的作用下就可以顯著抑制黑色素瘤細胞B16的侵襲黏附，對黑色素瘤的抑制作用與目前臨床抗黑色素瘤的首選藥氮烯咪胺相當［17］。蘇東林等［18］在二氫楊梅素的急性毒理學評價中也發(fā)現二氫楊梅素毒性很小，毒副作用不明顯，Wistar大鼠口服灌胃的最大耐受量為5.0 g/kg。并且二氫楊梅素低毒高效的同時還有保護肝臟、降血脂、抗氧化、提高免疫力等優(yōu)點［19］。這些都提示二氫楊梅素在作為抗癌藥物開發(fā)利用方面有巨大潛力。但是藤茶和二氫楊梅素的研究近幾年剛剛開始，加之藤茶主要產于我國，國外鮮有報道。本實驗結果二氫楊梅素體外抗宮頸癌作用的存在可以為二氫楊梅素在抗腫瘤方面的應用開發(fā)提供進一步的資料，并可為我國開發(fā)天然植物抗腫瘤藥提供新思路。

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R966

B

1001-1528（2015）08-1849-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.050

2014-11-12

河北省高等學校科學技術研究項目 （QN2014036）；河北省衛(wèi)生廳重點課題 （ZL20140247）；承德市科學技術研究項目（20142015）；承德醫(yī)學院自然科學項目 （201407）；河北省高校病理與病理生藥學重點學科項目 （冀教高2013）

左彥珍（1981—），女，碩士，講師，主要從事腫瘤藥物研究。Te1：（0314）42291149，E-mai1：yanzhen926@163.com

*通信作者：孫大永 （1980—），男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤臨床研究。Te1：（0314）2020075，E-mai1：109024380@qq.com