枸杞多糖對電離輻射小鼠睪丸組織損傷的保護(hù)作用

唐 霖， 吳立新， 汪 俊， 孫振蛟*

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江 寧波 315100；2.寧波立華植物提取技術(shù)有限公司，浙江 寧波315100）

枸杞多糖對電離輻射小鼠睪丸組織損傷的保護(hù)作用

唐 霖1， 吳立新2， 汪 俊2， 孫振蛟2*

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江 寧波 315100；2.寧波立華植物提取技術(shù)有限公司，浙江 寧波315100）

目的觀察枸杞多糖對X射線電離輻射小鼠睪丸組織損傷的保護(hù)作用。方法雄性昆明小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、枸杞多糖低劑量和高劑量組，給藥組動物分別按照0.25 g/kg和1 g/kg劑量灌胃枸杞多糖，其余組動物灌胃蒸餾水，每日一次。第7天小鼠經(jīng)水合氯醛麻醉仰臥位固定，僅睪丸部位接受X射線照射 （3.0 Gy），正常組小鼠僅麻醉不照射。照射后各組小鼠繼續(xù)灌胃藥物，第21天處死動物取睪丸及附睪，稱定質(zhì)量并觀察精子活力、精子密度以及睪丸生精小管結(jié)構(gòu)。結(jié)果枸杞多糖各組小鼠一般狀況均優(yōu)于模型組，枸杞多糖高劑量組小鼠睪丸質(zhì)量與模型組比較明顯增加，精子數(shù)量和活力明顯升高，組織病理學(xué)顯示枸杞多糖高劑量組小鼠睪丸生精小管內(nèi)含大量精子，部分區(qū)域見少量生精細(xì)胞脫落。結(jié)論枸杞多糖對X射線所致的小鼠睪丸組織損傷有明顯的保護(hù)作用。

枸杞多糖；X射線；電離輻射；睪丸組織

放射療法與外科手術(shù)和化學(xué)療法共同構(gòu)成腫瘤治療三大療法，由于機(jī)體不同組織細(xì)胞對放射線敏感性差異，因而在放射治療同時(shí)會對正常組織細(xì)胞產(chǎn)生損傷。睪丸生精細(xì)胞對電離輻射非常敏感，以精原干細(xì)胞最敏感，其次為精母細(xì)胞，而精子細(xì)胞和成熟精子耐受力較高。當(dāng)受到射線照射后，睪丸中的精子數(shù)量就會減少，可暫時(shí)不育，甚至可永久不育［1］。由于睪丸生精細(xì)胞對電離輻射的這種高度敏感性，臨床上應(yīng)用電離輻射治療男性患者腹部癌癥時(shí)，常常伴隨有少精、無精、暫時(shí)不育甚至永久不育、以及性功能障礙等并發(fā)癥［2-3］。

枸杞作為傳統(tǒng)的強(qiáng)精健體之補(bǔ)藥，《本草綱目》記載“枸杞，補(bǔ)腎生精，養(yǎng)肝；明目安神，令人長壽”。據(jù) 《中國藥典》2010年版一部所載，枸杞為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果實(shí)；甘，平；滋補(bǔ)肝腎，益精明目，用于虛勞精虧，腰膝酸痛，眩暈耳鳴，陽萎遺精，內(nèi)熱消渴，血虛萎黃，目昏不明，同時(shí)規(guī)定含枸杞多糖不得少于1.8%［4］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明枸杞多糖有抗衰老［5］、抗腫瘤［6］、抗疲勞［7］、增強(qiáng)機(jī)體免疫力［8］、降血脂［9］、降血糖［10］、改善性功能［11］等作用，最近研究表明枸杞多糖對糖尿病雄性大鼠生殖損傷有保護(hù)作用［12］，但對電離輻射的雄性生殖損傷是否有保護(hù)作用卻未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過探討枸杞多糖對電離輻射小鼠睪丸病理性損傷的保護(hù)作用，為枸杞多糖用于生殖保健提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 藥物與試劑 枸杞多糖，寧波立華植物提取技術(shù)有限公司提供 （批號20121201），含枸杞多糖以葡萄糖計(jì)不低于90%；蘇木精-伊紅染液和福爾馬林固定液均購于上海滬峰化工有限公司。

1.2 動物 健康雄性昆明小鼠，體質(zhì)量 （25±2）g，SPF級，由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號SYXK（浙）2007-009。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 正置光學(xué)顯微鏡 （日本奧林巴斯公司）；切片機(jī) （德國萊卡公司）；便攜式X射線機(jī) （意大利基拉多尼公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模及分組給藥 雄性小鼠40只，隨機(jī)分成正常組、模型組、枸杞多糖低和高劑量組，每組10只。照射造模前枸杞多糖低和高劑量組動物分別按照0.25 g/kg和1 g/kg灌胃給予枸杞多糖，每日1次，連續(xù)7 d，正常組和模型組給與相應(yīng)體積的生理鹽水。小鼠采用水合氯醛 （350 mg/kg）麻醉，仰臥位固定在有機(jī)玻璃板上，除睪丸外各部分采用1mm鉛板保護(hù)，電壓200 kV，電流15 mA，距離40 cm，吸收劑量率0.96 Gy/min，總劑量3.0 Gy。正常組動物僅接受麻醉處理。照射后繼續(xù)給藥3周，末次給藥后2 h處死動物，摘取睪丸、附睪，做相關(guān)檢測。

2.2 精子密度和活力測定［13］將盛有6 mL生理鹽水的試管置于恒溫水浴箱內(nèi)預(yù)熱至37℃，然后將一側(cè)附睪剪碎放入試管中，搖勻，37℃保溫15min，使精子充分游離。取1滴適當(dāng)稀釋后滴人血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，200倍顯微鏡下計(jì)數(shù)5個中方格內(nèi)精子數(shù) （n），每1mL精子數(shù)為n×5×稀釋倍數(shù)×10。另取1滴涂片，觀察精子活率，至少觀察200個精子，分別計(jì)數(shù)有活動力及無活動力的精子數(shù)。精子活率=活動精子數(shù)/（活動精子數(shù)+不動精子數(shù)）×100%。

2.3 睪丸組織病理學(xué)檢查 取新鮮的睪丸組織，采用4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，蘇木精-伊紅染色，光鏡下進(jìn)行病理學(xué)檢查。

3 結(jié)果

3.1 枸杞多糖對電離輻射模型小鼠大體狀況及睪丸重量的影響 模型小鼠在睪丸照射處理后自主活動減少并豎毛，3～5 d逐漸恢復(fù)正常，而枸杞多糖低、高劑量組小鼠自主活動與豎毛狀況優(yōu)于模型組。同時(shí)實(shí)驗(yàn)開始時(shí)和結(jié)束時(shí)各組小鼠體質(zhì)量基本一致，而實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)模型對照組小鼠睪丸與空白對照組比較明顯減輕 （P＜0.01），而枸杞多糖高劑量組與模型組比較顯著增加 （P＜0.05），見表1。

表1 枸杞多糖對電離輻射小鼠體質(zhì)量和睪丸質(zhì)量的影響 （n=10，）

表1 枸杞多糖對電離輻射小鼠體質(zhì)量和睪丸質(zhì)量的影響 （n=10，）

注：與空白對照組比較，##P＜0.01；與模型對照組比較，*P＜0.05

/mg空白對照組組別 劑量/（g·kg-1） 體質(zhì)量/g開始 結(jié)束 睪丸質(zhì)量25.3±2.4 37.4±3.1 212.2±18.5模型對照組 - 24.9±2.1 36.5±2.9 148.4±21.7##枸杞多糖低劑量組 0.25 25.8±2.3 36.8±3.3 157.8±15.3枸杞多糖高劑量組 1 25.6±2.5 37.7±3.6 170.1±19.3 -*

3.2 枸杞多糖對電離輻射模型小鼠精子質(zhì)量影響 由表2所示，小鼠睪丸接受X射線照射后精子密度與活力均明顯下降，與正常組比差異有顯著性意義 （P＜0.05，P＜0.05）。而連續(xù)灌胃枸杞多糖21 d后，枸杞多糖低、高劑量組小鼠精子密度與活力與模型組比較有升高趨勢，其中高劑量組精子密度與活力與模型組比較均明顯升高 （P＜0.05，P＜0.05）。

表2 枸杞多糖對電離輻射小鼠精子質(zhì)量影響 （n=10，）

表2 枸杞多糖對電離輻射小鼠精子質(zhì)量影響 （n=10，）

注：與空白組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05

組別 劑量/（g·kg-1）精子密度/（×106·mL-1）精子活力/ % - 35.1±4.1 72.1±6.8模型對照組 - 18.6±2.6# 43.5±5.1#枸杞多糖低劑量組 0.25 21.2±3.1 46.6±5.9枸杞多糖高劑量組 1 25.6±2.9* 65.6±7.1空白對照組*

3.3 枸杞多糖對電離輻射模型小鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)的影響 如圖1所示，正常組小鼠曲精細(xì)管內(nèi)各期生精細(xì)胞排列整齊、緊密、有序，層次分明，精原細(xì)胞小而圓，緊貼曲精管的基底膜，向內(nèi)依次為初級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子，同時(shí)支持細(xì)胞形態(tài)正常。經(jīng)X射線照射的模型組小鼠睪丸生精小管生精上皮明顯變薄，生精細(xì)胞脫落，細(xì)胞層次紊亂，精原細(xì)胞、精母細(xì)胞減少，精子細(xì)胞及精子減少更加明顯，睪丸間質(zhì)細(xì)胞輕度水腫。枸杞多糖組尤其以高劑量組小鼠睪丸生精小管內(nèi)含大量精子，生精細(xì)胞排列稍疏松，結(jié)構(gòu)清楚，層次分明，細(xì)胞層次減少，精原細(xì)胞數(shù)量正常，形態(tài)圓而規(guī)則，緊貼在生精小管的基底膜，其他各期生精細(xì)胞數(shù)量略減少，部分區(qū)域見少量生精細(xì)胞脫落。

圖1 枸杞多糖對電離輻射模型小鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)的影響

4 討論

本研究表明枸杞多糖可改善睪丸接受3.0 Gy劑量X射線照射小鼠模型的一般狀況，增加模型小鼠睪丸質(zhì)量，提高精子數(shù)量和活力；組織病理學(xué)顯示枸杞多糖高劑量組小鼠睪丸生精小管內(nèi)含大量精子，部分區(qū)域見少量生精細(xì)胞脫落。以上研究結(jié)果表明枸杞多糖對X射線所致的小鼠睪丸組織損傷有明顯的保護(hù)作用。

機(jī)體分子、細(xì)胞、組織和器官受電離輻射影響所造成形態(tài)和功能的后果稱為輻射生物效應(yīng)，損傷效應(yīng)程度與機(jī)體各組織的輻射敏感性密切相關(guān)，其中性腺是最為敏感組織之一。研究早已證實(shí)電離輻射可導(dǎo)致睪丸生精上皮、附睪上皮、生精小管上皮出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)改變，破壞睪丸生精過程［14］。本研究也證實(shí)小鼠睪丸在X射線照射后精子密度與活力均明顯下降，睪丸生精小管生精上皮明顯變薄，生精細(xì)胞脫落，細(xì)胞層次紊亂，精原細(xì)胞、精母細(xì)胞減少，精子細(xì)胞及精子減少更加明顯，睪丸間質(zhì)細(xì)胞輕度水腫。小鼠在照射前灌胃枸杞多糖并持續(xù)到照射后14 d可改善模型小鼠自主活動與豎毛狀況，增加模型小鼠睪丸質(zhì)量，枸杞多糖低、高劑量組小鼠精子密度與活力與模型組比較有升高趨勢，其中高劑量組精子密度與活力與模型組比較均明顯升高。枸杞多糖高劑量組小鼠睪丸生精小管內(nèi)含大量精子，生精細(xì)胞排列稍疏松，結(jié)構(gòu)清楚，層次分明，細(xì)胞層次減少，精原細(xì)胞數(shù)量正常，形態(tài)圓而規(guī)則，緊貼在生精小管的基底膜，其他各期生精細(xì)胞數(shù)量略減少，部分區(qū)域見少量生精細(xì)胞脫落。枸杞多糖可增加睪丸損傷大鼠血清性激素水平，提高大鼠睪丸組織SOD活性和降低丙二醛含量，使受損的睪丸組織恢復(fù)到接近正常，這可能是枸杞多糖保護(hù)睪丸電離輻射損傷的作用機(jī)理［15］。

綜上所述，枸杞多糖對X射線所致的小鼠睪丸組織損傷有明顯的保護(hù)作用，為枸杞多糖用于生殖保健提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為治療電離輻射所致生殖功能障礙的藥物開發(fā)提供了新的方向。

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R285.5

B

1001-1528（2015）08-1846-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.049

2014-03-29

高等學(xué)校訪問工程師校企合作項(xiàng)目 （2012）

唐 霖（1976—），女，碩士，講師，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物研究與應(yīng)用。Te1：（0574）88222795，E-mai1：tang1@mai1.zjpc. net.cn

*通信作者：孫振蛟 （1979—），男，工程師，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物研究與應(yīng)用。Te1：（0574）86503230，E-mai1：sunzhenjiao1@ 163.com