魚腥草素鈉聯(lián)合阿奇霉素對金黃色葡萄球菌生物被膜早期黏附的影響

濮燕屏， 程惠娟， 段強軍， 黃衛(wèi)鋒

（安徽中醫(yī)藥大學，安徽合肥230038）

魚腥草素鈉聯(lián)合阿奇霉素對金黃色葡萄球菌生物被膜早期黏附的影響

濮燕屏， 程惠娟*， 段強軍， 黃衛(wèi)鋒

（安徽中醫(yī)藥大學，安徽合肥230038）

目的研究魚腥草素鈉（sodium houttuyfonate，SH）聯(lián)合阿奇霉素（azithromycin，AZM）對金黃色葡萄球菌生物被膜早期黏附的影響。方法微量倍比稀釋法測定魚腥草素鈉和阿奇霉素對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度 （minimum inhibitory concentration，MIC）；連續(xù)稀釋法行活菌計數(shù)，測定1 MIC魚腥草素鈉、1 MIC阿奇霉素單藥組和1/2 MIC魚腥草素鈉+1/2MIC阿奇霉素聯(lián)合組對金黃色葡萄球菌生物被膜黏附的影響；結(jié)晶紫染色法評價不同濃度魚腥草素鈉和阿奇霉素單用及聯(lián)合組對金黃色葡萄球菌早期生物被膜生長量的影響；掃描電鏡 （SEM）觀察各藥物組對金黃色葡萄球菌生物被膜形態(tài)的影響。結(jié)果魚腥草素鈉和阿奇霉素對金黃色葡萄球菌的MIC分別為64、0.25 mg/L。魚腥草素鈉聯(lián)合阿奇霉素聯(lián)合用藥組能增強阿奇霉素對生物被膜早期黏附的清除作用，尤以2MIC藥物濃度聯(lián)合組作用最強 （與陰性對照組比較P＜0.001）。電鏡下觀察細菌數(shù)及形態(tài)也驗證了上述結(jié)果。結(jié)論魚腥草素鈉、阿奇霉素可減少金黃色葡萄球菌的早期黏附，抑制生物被膜的形成，聯(lián)合用藥后對金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制具有協(xié)同作用，預期兩藥聯(lián)合使用可以提高生物被膜相關(guān)感染的臨床療效。

金黃色葡萄球菌；生物被膜；魚腥草素鈉；阿奇霉素；黏附作用

分布廣泛的革蘭氏陽性細菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種人獸共患的重要致病菌，常引起皮膚黏膜及多種組織器官的化膿性炎癥。據(jù)統(tǒng)計，有20%～25%人群是金黃色葡萄球菌的長期宿主，75%～80%人群是間歇性宿主［1-2］。近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，金黃色葡萄球菌可黏附于導尿管、人工心臟瓣膜等植入性醫(yī)療器材表面形成生物被膜 （biofi1m，BF）［3-5］，而由細菌產(chǎn)生多聚復合物基質(zhì)包繞自身形成的生物被膜可大大降低其對抗生素及消毒劑的敏感性，從而增強它的生存能力［6］。臨床上單一抗生素對于金黃色葡萄球菌生物被膜的治療效果欠佳，而兩種抗生素聯(lián)用易誘導耐藥性，鑒于此，以生物被膜為對象，進行定向藥物研發(fā)已經(jīng)成為解決金黃色葡萄球菌耐藥性及其生物被膜相關(guān)感染的熱點，但有關(guān)中藥及其有效成分對金黃色葡萄球菌生物被膜的形成與影響的研究鮮有報道。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，中藥有效單體魚腥草素鈉（sodium houttuyfonate，SH）能顯著抑制生物被膜形成，并對抗生素破壞生物被膜形成有較好的增敏和協(xié)同作用［7-8］。本研究旨在通過觀察魚腥草素鈉聯(lián)合阿奇霉素（azithromycin，AZM）對金黃色葡萄球菌早期生物被膜的作用，以期為中藥治療金黃色葡萄球菌生物被膜相關(guān)感染提供依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株與藥物 金黃色葡萄球菌標準株ATCC25923（中國食品藥品檢定研究院）；魚腥草素鈉對照品 （中國食品藥品檢定研究院，100247-199601）；陽性對照藥阿奇霉素（輝瑞制藥有限公司，批號J20090135）。

1.2 試劑和儀器 LB培養(yǎng)基、胰酶大豆肉湯培養(yǎng)基 （北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司）；結(jié)晶紫 （天津市光復精細化工研究所，分析純）；DPH-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；紫外分光光度計；SpectraMax M2e多功能酶標儀 （美谷分子儀器上海有限公司）；Sirion200型場掃描電鏡 （美國FEI公司）。

2 方法

2.1 魚腥草素鈉及阿奇霉素對金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定 按照文獻方法并改進［9］，魚腥草素鈉和阿奇霉素分別用 MH（B）培養(yǎng)基稀釋成11個質(zhì)量濃度梯度，分別為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/L和32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg/L。向各96孔平底微量培養(yǎng)板中加入0.5 Mc菌液100μL。另設1個不含藥培養(yǎng)基作為陰性對照，37℃孵育24 h后觀察結(jié)果，以無菌生長的最大稀釋濃度為MIC，試驗重復3次。

2.2 藥物對金黃色葡萄球菌黏附作用的影響 分別設魚腥草素鈉、阿奇霉素單藥組，聯(lián)合用藥組，陰性對照組。取6孔無菌培養(yǎng)板，每孔加入1片無菌醫(yī)用濾膜和2 mL TSB培養(yǎng)基和200μL的1×104CFU/mL的金黃色葡萄球菌菌體混懸液，各組加入相應濃度的藥物。魚腥草素鈉、阿奇霉素單藥組藥物濃度為1MIC，聯(lián)合用藥組使用濃度為1/2MIC魚腥草素鈉+1/2MIC阿奇霉素，陰性對照組加入不含藥物培養(yǎng)基，分別在培養(yǎng)6、8、12、24 h后取出濾膜，用無菌PBS清洗浮游菌，將濾膜置于無菌試管中加入5 mL生理鹽水，超聲中震蕩 （超聲頻率40 kHz）20 min，連續(xù)稀釋法傾注培養(yǎng)計算活菌數(shù)，觀察各藥物在不同時間段對細菌黏附清除后的活菌量，實驗重復3次。

2.3 藥物對金黃色葡萄球菌早期生物被膜生長量的影響

按文獻方法［10］將實驗分成魚腥草素鈉、阿奇霉素 2、1、1/2、1/4、1/8、1/16和1/32 MIC藥物濃度單藥組，及1/2 MIC魚腥草素鈉分別與阿奇霉素2、1、1/2、1/4、1/8、1/ 16和1/32 MIC藥物濃度聯(lián)合組，另設不含藥物空白組為陰性對照 （n=4）。96孔板中，每孔中加入調(diào)整好的金黃色葡萄球菌懸液200μL，37℃靜置孵育6、8、12、24 h PBS清洗浮游菌，自然晾干后以0.1%結(jié)晶紫染色20 min，吸棄結(jié)晶紫，PBS清洗，30%冰乙酸脫色，靜置15 min后用紫外分光光度計測定492 nm處吸光度A。以陰性組A為100%生物被膜，換算各藥物組生物被膜生長量計算抑制百分率。

2.4 藥物對金黃色葡萄球菌黏附作用的形態(tài)學觀察 將無菌玻片置于6孔板中，分別加入2mL含菌TSB培養(yǎng)基，試驗分別以1MIC魚腥草素鈉、1MIC阿奇霉素為給藥濃度，1/2 MIC魚腥草素鈉+1/2 MIC阿奇霉素為聯(lián)合給藥濃度，于37℃靜置培養(yǎng)12 h，用鍍銀染法染色后掃描電鏡下觀察細菌形態(tài)的變化以判斷各種藥物的作用效果［11］。

2.5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 11.0軟件進行兩獨立樣本方差分析，數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 藥物對金黃色葡萄球菌的MIC測定 魚腥草素鈉對金黃色葡萄球菌的MIC為64 mg/L，阿奇霉素對金黃色葡萄球菌的MIC為0.25mg/L。

3.2 藥物對金黃色葡萄球菌黏附作用的影響 圖1所示，1 MIC魚腥草素鈉、1 MIC阿奇霉素和1/2 MIC魚腥草素鈉+1/2MIC阿奇霉素藥物濃度分別作用6、8、12、24 h。陰性對照組無藥物處理。結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組相對于單藥組清除金黃色葡萄球菌黏附作用明顯增加。

圖1 阿奇霉素單藥組及聯(lián)合組對金黃色葡萄球菌黏附的影響

3.3 藥物對金黃色葡萄球菌早期生物被膜生長量的影響

本研究選用了6、8、12、24 h共4個時間點作為不同藥物濃度對金黃色葡萄球菌生物被膜抑制作用的觀察，圖2提示隨著藥物濃度的增加，不同時間段魚腥草素鈉單藥組對金黃色葡萄球菌生物被膜生長均有抑制作用，其中以2× MIC抑制作用最強，與陰性對照組比較P＜0.001。6 h時抑制率為68.75%，8 h時為85.33%，12 h時為68.75%，24 h時為58.82%。

圖2 魚腥草素鈉單藥組對金黃色葡萄球菌生物被膜生長量的影響 （，n=4）

圖3提示阿奇霉素各單藥組及各藥物濃度聯(lián)合組在不同時間段對金黃色葡萄球菌生物被膜生長均有抑制作用，隨著培養(yǎng)時間的增加陰性對照組的生物膜量逐漸增加，用藥組的生物膜量增加緩慢，且魚腥草素鈉與阿奇霉素聯(lián)合使用時似乎更能清除生物膜量。例如用藥6 h時，最低濃度1/32 MIC聯(lián)合組從單藥組抑制率30.38%增加到57.14%，最高濃度2 MIC聯(lián)合組從單藥組抑制率57.14%增加到70.24%，抑制作用的增強呈藥物劑量依賴性。

3.4 藥物對金黃色葡萄球菌黏附作用的形態(tài)學觀察 掃描電鏡下觀察到藥物對細菌的黏附清除作用明顯，對照組中能夠看到大量菌體存在和一些菌體分泌物清晰可見，然而藥物作用組中，細菌的黏附能力受到不同程度的減弱，并且無分泌物的存在，與對照組對比鮮明，聯(lián)合用藥組對于金黃色葡萄球菌的抑制作用最為明顯。見圖4。

4 討論

細菌產(chǎn)生耐藥性的主要原因之一是生物被膜的形成。生物被膜是細菌為適應環(huán)境利于生存的一種群居生活現(xiàn)象，包括有細菌的黏附、發(fā)展、成熟和播散等階段［12］。生物被膜的結(jié)構(gòu)特異性使得細菌能夠阻礙或延緩抗生素的通透，從而提高自身的耐藥性及免疫逃避性。有研究表明生物被膜細菌對抗生素的抵抗力是浮游細菌的十倍乃至上千倍［13］。傳統(tǒng)抗生素對細菌生物被膜引起的慢性和反復性感染效果欠佳，因此，臨床上細菌生物被膜感染常表現(xiàn)為反復發(fā)作及愈后差等特點。如何治療由細菌生物被膜引起的難治性感染已成為臨床相當棘手的問題。細菌形成生物被膜的機制雖然相當復雜，但黏附于器官及介質(zhì)表面是引起感染的第一步。不能牢固定植于宿主器官或組織表面的細菌，容易被血液及其他體液沖刷因而不能形成感染，故是否能抑制生物被膜黏附是評判一個藥物治療細菌感染的重要指標之一［14］。

圖3 阿奇霉素單藥組及聯(lián)合組對金黃色葡萄球菌生物被膜生長量的影響 （，n=4）

圖4 掃描電鏡觀察藥物12 h對金黃色葡萄球菌黏附的影響

目前國內(nèi)外抗生物被膜的研究局限于抗菌西藥的單獨使用和抗菌藥與抗菌藥或非抗菌藥的聯(lián)合使用，但鮮見有中藥與抗生素聯(lián)用抗生物被膜的研究。中藥魚腥草性味辛、寒，具有清熱解毒、消腫排毒、健脾、利尿通淋等功效，其主要活性成分魚腥草素鈉生物活性高、毒性低［15］。而臨床常見的阿奇霉素對金黃色葡萄球菌懸浮菌和生物被膜具有較好的抗菌活性［16］。因此，本實驗選用阿奇霉素作為陽性對照藥，設計了6、8、12、24 h 4個不同時間點，觀察魚腥草素鈉單獨用藥及聯(lián)合用藥對金黃色葡萄球菌早期生物被膜的影響。實驗結(jié)果表明一定濃度的魚腥草素鈉對金黃色葡萄球菌早期生物被膜具有抑制作用，能減少生物被膜的早期黏附，且隨著藥物濃度的增加抑制作用增強，尤以2 MIC聯(lián)合用藥組抑制作用最強，活菌計數(shù)較陰性對照組及阿奇霉素組均明顯減少，由此推測魚腥草素鈉具有增強阿奇霉素對生物被膜的滲透及殺菌作用。

抗菌藥的長期使用易產(chǎn)生耐藥性，中藥體外實驗抗菌作用雖弱于抗生素，但卻有著不易耐藥、副作用小、效果持久等優(yōu)勢，近年來有研究表明清熱解毒的中藥也有抗生物被膜的作用［17-18］。由于生物被膜的形成過程涉及環(huán)節(jié)多，且結(jié)構(gòu)復雜，兩種藥物的聯(lián)合可能是作用于同一靶點或不同靶點，但其具體的機制尚不明確。因此，在今后除了嘗試中西用藥結(jié)合，發(fā)揮優(yōu)勢互補之外，對其聯(lián)合用藥過程中對生物被膜的具體作用機制亟待于深入研究。

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R966

B

1001-1528（2015）08-1813-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.040

2014-12-29

國家自然科學基金項目 （81173629）

濮燕屏 （1983—）女，講師，主要從事中藥抗感染與免疫研究。Te1：（0551）65169163，E-mai1：65980935@qq.com

*通信作者：程惠娟 （1953—），女，教授，碩士生導師，主要從事中藥抗感染與免疫研究。Te1：（0551）5169204，E-mai1：chenghuijuan53@sina.com