北京、河北地區(qū)荊芥揮發(fā)油的GC特征圖譜

趙立子， 金 鉞， 韓曉敏，2， 褚慶龍， 魏建和*

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京100193；2.燕山大學(xué)，河北秦皇島066004）

北京、河北地區(qū)荊芥揮發(fā)油的GC特征圖譜

趙立子1， 金 鉞1， 韓曉敏1，2， 褚慶龍1， 魏建和1*

（1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京100193；2.燕山大學(xué)，河北秦皇島066004）

目的建立北京、河北地區(qū)不同品種荊芥揮發(fā)油的GC特征圖譜。方法GC-FID法測定揮發(fā)油的乙酸乙酯萃取液，并對其進行相似度評價、聚類和主成分分析。結(jié)果40批荊芥樣品的GC特征圖譜中有10個共有峰，通過歐式距離可歸為4類，即中荊1號、中荊2號、安國荊芥和玉田荊芥。結(jié)論該圖譜能可靠地鑒定荊芥的品種，可用于其質(zhì)量控制。

荊芥；品種；揮發(fā)油；GC；特征圖譜

荊芥為唇形科植物荊芥Schizonepeta tenuifolia（Benth.）Briq.的干燥地上部分，為中國八大祁藥之一，是中醫(yī)臨床常用解表藥物［1］，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗病原微生物、止血和抗氧化等作用［2-3］，常用于治療感冒發(fā)熱、頭痛、咽喉腫痛等。荊芥的化學(xué)成分種類較多，主要是揮發(fā)油類、苷類、單萜類、酚酸類和黃酮類等，其中最主要的是揮發(fā)油類。文獻 ［4］報道，荊芥揮發(fā)油中含有29種成分，主要是（+）-胡薄荷酮 （占29% ～ 32%）和薄荷酮 （占14%～15%）等單萜類化合物，也是其發(fā)揮藥理作用的主要成分。荊芥原為野生，現(xiàn)臨床上所應(yīng)用的多為人工栽培，市場上主要流通的是河北安國、玉田等地的生產(chǎn)種質(zhì)。由于長期自種自繁和不科學(xué)引種，導(dǎo)致群體混雜、種質(zhì)退化，影響了荊芥藥材的產(chǎn)量和品質(zhì)。魏建和［5］通過選擇不同特點優(yōu)良單株自交純化開始系統(tǒng)選育，4年后最終獲得新品種 “中荊1號”和 “中荊2號”，具有有效成分含有量高、外觀性狀好和抗病性強等優(yōu)點，在示范種植時深受藥農(nóng)喜愛，種植面積逐年增加，前景廣闊。

中藥特征圖譜是中藥整體性的化學(xué)表征，能反映其全面的化學(xué)信息，為近年來中藥質(zhì)量控制方法的一個研究熱點［6］。張麗等［7］對河北安國荊芥進行指紋圖譜分析，建立了荊芥穗揮發(fā)油HSGC指紋圖譜；錢雯等［8］利用HPLC法，對江蘇、山西、安徽等不同產(chǎn)地的荊芥建立了指紋圖譜。然而，這些研究或未針對不同品種進行鑒定，或?qū)嶒灅颖静⒎鞘袌龃罅苛魍ㄆ贩N，并且未對近期出現(xiàn)的新品種進行收錄。本實驗選取了新品種荊芥和市面上流通的主要生產(chǎn)種質(zhì)，采用氣相色譜方法 （GC），對來源于北京、河北地區(qū)40批次不同品種的荊芥樣品進行測定，建立了其GC特征圖譜。同時，應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，對數(shù)據(jù)結(jié)果進行了系統(tǒng)聚類和主成分分析，取得了比較理想的分析結(jié)果，為荊芥藥材的品種鑒定和質(zhì)量控制提供了參考。

1 儀器與材料

Agi1ent7890A氣相色譜儀，包括自動進樣器（G4513A）、FID檢測器、化學(xué)工作站（美國Agi-1ent公司）；Sartorius BP211D分析天平（十萬分之一，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

薄荷酮、胡薄荷酮對照品 （中國藥品生物制品檢定所，批號分別為111705-201105、111706-201205，純度＞99.8%）。乙酸乙酯為色譜純 （德國Merck公司）；蒸餾水、雙蒸水 （自制），所有試劑均經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾。40批荊芥藥材見表1，均于6月播種，在10月花序下部2/3結(jié)籽時采收，除去雜質(zhì)后陰干、粉碎，過2號篩。

表1 40批荊芥樣品Tab.1 Forty samples of S.tenuifolia（Benth.）Briq.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agi1ent HP-5石英毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25μm）；進樣口溫度230℃；檢測器溫度300℃，升溫程序為初始溫度65℃，以3℃/min速率升至90℃，再以2℃/min速率升至115℃，最后以40℃/min速率升至280℃，保持5 min；恒流模式；體積流量為1.5 mL/min；載氣為氮氣；不分流進樣，進樣量1μL。

2.2 對照品溶液的制備 取胡薄荷酮237.63 mg，置于25mL量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，搖勻后靜置，即得質(zhì)量濃度為9.505 2 mg/m L的胡薄荷酮標準溶液。然后，精密稱取薄荷酮93.87 mg，置于25 mL量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，搖勻后靜置，即得質(zhì)量濃度為3.754 8 mg/mL的薄荷酮標準溶液。

精密吸取上述兩種標準溶液適量，配制成質(zhì)量濃度分別為95.05和187.74 mg/L的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 按照 《中國藥典》2010年版一部中荊芥揮發(fā)油的含有量測定方法 （甲法，附錄XD），對藥材進行處理。精密稱取荊芥樣品粉末適量，置于圓底燒瓶中，加入蒸餾水，連接揮發(fā)油提取器，自提取器上端加蒸餾水至溢流入燒瓶為止，并研究了水蒸氣蒸餾法提取荊芥揮發(fā)油的不同因素對其得率的影響，以藥材料液比、浸泡時間、提取時間等因素為考察指標，設(shè)計了L9（33）的正交試驗。結(jié)果表明，提取時間對荊芥揮發(fā)油得率的影響最大，其次是料液比，而浸泡時間影響最小。綜合費效比，決定提取方法為料液比10∶1、浸泡時間2 h、提取時間3 h，停止加熱后冷卻，取揮發(fā)油層，再經(jīng)無水硫酸鈉干燥后即得淡黃色透明油狀物。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度 精密稱取供試品 （S21）適量，按照 “2.3”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各色譜峰相對保留時間RSD均小于1%，相對峰面積RSD均小于3%，說明儀器精密度良好，符合特征圖譜研究要求［9］。

2.4.2 重復(fù)性 精密稱定同一供試品 （S10）6份，每份30 g，按照 “2.3”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項色譜條件下檢測，分別對各色譜峰的相對保留時間及峰面積進行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各色譜峰相對保留時間RSD均小于1%，相對峰面積RSD均小于3%，說明該方法重復(fù)性良好，符合特征圖譜研究要求。

2.4.3 穩(wěn)定性 將同一供試品溶液 （S29）在“2.1”項色譜條件下分別于0、2、4、8、12、24 h進樣分析，計算各色譜峰相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各色譜峰相對保留時間RSD均小于1%，相對峰面積的RSD均小于3%，說明24 h內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性良好，符合特征圖譜研究要求。

2.5 樣品測定 將40批荊芥藥材樣品按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項色譜條件下依次進樣進行檢測，記錄色譜圖及峰面積。通過比較各樣品的GC色譜圖后發(fā)現(xiàn)，各批次荊芥樣品的出峰時間基本一致，其中峰面積較大的共有特征峰有10個，見圖1。在相同色譜條件下，將標準品溶液進樣分析，并與樣品特征圖譜中相應(yīng)的色譜峰進行比較，結(jié)果確定樣品共有特征峰中的峰5為薄荷酮，峰8為胡薄荷酮。

圖1 40批荊芥共有模式圖圖譜Fig.1 Standard fingerprint chromatogram of 40 batches of sam ples

2.6 特征圖譜的建立及模式識別分析

2.6.1 特征圖譜的建立及相似度評價 將40批樣品色譜圖導(dǎo)入 《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》，選取 “時間窗寬度”為0.10 min，對照圖譜的生成方法為 “中位數(shù)”，經(jīng)多點校正和自動匹配后，得到對照圖譜。然后，將該圖譜與40批樣品色譜圖導(dǎo)入 《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004B版》，得到樣品與對照圖譜的匹配圖，并計算出兩者的相似度。由圖可知，相同品種荊芥具有較高的相似度，而不同品種荊芥的相似度有差異，結(jié)果見表2和圖2。

表2 40批荊芥樣品相似度Tab.2 Sim ilarities of 40 batches of S.tenuifolia（Benth.）Briq.

2.6.2 聚類分析 將40批荊芥樣品中的10個主要色譜峰的單位質(zhì)量藥材峰面積進行量化，結(jié)果得到40×38階的數(shù)據(jù)矩陣。所有數(shù)據(jù)經(jīng)標準化處理后，應(yīng)用 SPSS軟件 （20.0版）進行聚類分析（HCA），選擇系統(tǒng)聚類方法，采用Between-group 1inkage法，以歐式距離（Euc1ideandistance）為測量距離作出樹狀圖，見圖3。

圖2 40批樣品GC特征圖譜Fig.2 GC fingerprint chrom atogram of 40 batches of sam p les

圖3 40批樣品聚類分析圖Fig.3 Dendrogram of hierarchical cluster analysis of 40 batches of sam p les

由圖可知，40批樣品聚為4組，不同品種的荊芥各聚為一組，分別為中荊1號、中荊2號、安國荊芥和玉田荊芥。而且，它們之間距離較遠，獨立性較高，說明聚類分析對相同品種的荊芥有很高的識別能力。其中，市場上主要流通的的安國產(chǎn)和玉田產(chǎn)荊芥關(guān)系較近，而新品種 “中荊1號”和“中荊2號”與這兩個品種關(guān)系稍遠，并且 “中荊2號”歐式距離大于 “中荊1號”。

2.6.3 主成分分析 運用SPSS軟件，對40批荊芥樣品進行主成分分析 （PCA），將原始數(shù)據(jù)矩陣經(jīng)標準化處理后進行運算。結(jié)果，由碎石圖 （圖4）可知，特征值在1以上的主成分有2個，以此為提取標準，可得到2個主成分，累計貢獻率達到81.83%，說明只需保留這2個主成分就能了解原始數(shù)據(jù)的大部分信息內(nèi)容。另外，根據(jù)主成分因子得分，可得到樣品散點圖 （圖5），從中可以看出，40批荊芥樣品被分為4個區(qū)域，與聚類分析結(jié)果基本一致。

圖4 主成分碎石圖Fig.4 Scree plot of principal constituents

圖5 40批荊芥藥材主成分分析（PCA）得分圖Fig.5 Scores plot of PCA of 40 S.tenuifolia（Benth.）Briq.samples

圖5顯示，樣品S8、S9及S20與各自類群有所偏離，其中，S8和S9屬于 “中荊1號”種質(zhì)，而S20屬于 “中荊2號”種質(zhì)。以上3個樣品均來源于北京周邊地區(qū)，與河北傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)樣品相比，其產(chǎn)地、種植環(huán)境和種植方式均有所不同。北京地區(qū)的種植為山地林果間作模式，播種期與收獲期均晚于河北地區(qū)15～20 d，種植方式也有差異。中藥材內(nèi)在品質(zhì)是由品種的遺傳特性、特定的生態(tài)環(huán)境、成熟的栽培與加工技術(shù)等因素共同作用的結(jié)果。文獻研究表明［10-12］，產(chǎn)地、遺傳因子、生態(tài)因子和栽培措施等因素會對中藥材的有效成分產(chǎn)生影響，從而造成不同來源中藥材之間的差異。因此，筆者認為上述因素可能是樣品產(chǎn)生偏差的原因，具體有待進一步研究。

3 討論

本實驗對北京、河北地區(qū)不同品種荊芥揮發(fā)油進行了氣相色譜 （GC）實驗，并首次對 “中荊1號”、“中荊2號”等新品種進行了特征圖譜研究。通過與市場上主要流通的安國、玉田產(chǎn)等種質(zhì)進行比較分析，建立了4個品種荊芥藥材的GC特征圖譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該圖譜可有效地將中荊1號、中荊2號、安國荊芥、玉田荊芥這4個品種進行歸類區(qū)分，有利于荊芥的質(zhì)量控制和新品種的應(yīng)用推廣。

實驗表明，不同品種荊芥的樣品色譜圖雖然都出現(xiàn)了相應(yīng)的色譜峰，但是不同產(chǎn)地荊芥揮發(fā)油的相對峰面積仍然存在一定差異，說明產(chǎn)地、環(huán)境生態(tài)等因素使其揮發(fā)油的質(zhì)量有所不同，與戴靜波等［13］研究報道相符合。

另外，本實驗在化學(xué)計量學(xué)方面進行了相似度評價、聚類和主成分分析，與先前研究方法［13-14］相比，先采用聚類分析法對不同品種的荊芥藥材做出初步分組，再使用主成分分析法對其結(jié)果的準確性作進一步驗證。結(jié)果可知，這兩種方法之間不存在沖突，而且可以互相驗證，使分析結(jié)果更加準確可靠［15-17］，表明聚類和主成分分析均可顯示不同品種荊芥在主要成分含有量上有一定差別，并由此將其區(qū)分開，而且兩者分析結(jié)果基本一致。本實驗通過多種化學(xué)計量學(xué)手段，較為客觀和成功地區(qū)分開不同品種的荊芥樣品，為控制其質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)，也對建立品質(zhì)優(yōu)良的荊芥藥材和選定具有代表性的荊芥品種提供了一定參考。

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GC fingerprint of volatile oil in Jingjie cultivated in Beijing City and Hebei Province

ZHAO Li-zi1， JIN Yue1， HAN Xiao-min1，2， CHU Qing-1ong1， WEIJian-he1*

（1.InstituteofMedicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College，Beijing 100193，China；2.Yanshan University，Qinhuangdao 066004，China）

AIMTo estab1ish the GC fingerprint of vo1ati1e oi1 in different varieties of Jingjie（Schizonepeta tenuifolia［Benth.］Briq.）cu1tivated in Beijing City and Hebei Province.METHODSVo1ati1e oi1ethy1acetate extractwas determined by GC-FID.The simi1arity eva1uation，c1uster ana1ysis and principa1 constituent ana1ysis were thenmade.RESULTSTen common chromatographic peakswere obtained from 40 samp1es，which cou1d be grouped into four categories，inc1uding Zhongjing 1，Zhongjing 2，Anguo Jingjie and Yutian Jingjie.CONCLUSIONThis fingerprint can re1iab1y distinguish different varieties of Jingjie and provide the qua1ity contro1of this p1ant.

Jingjie（Schizonepeta tenuifolia［Benth.］Briq.）；variety；vo1ati1e oi1；GC；fingerprint

R284.1

A

1001-1528（2015）08-1762-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.028

2015-01-27

國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)科研專項 （201107011）

趙立子 （1985—），男，博士，從事藥用植物基因資源及分子育種研究。Te1：（010）57833363，15901013383，E-mai1：zhao1izi@imp1ad.ac.cn

*通信作者：魏建和 （1970—），男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，從事藥用植物基因資源及分子育種研究。Te1：（010）62899703，E-mai1：wjianh@263.net