柚皮素脂質體的制備及大鼠肺部給藥藥動學研究

季 鵬， 趙文明

（遼寧醫(yī)學院藥學院，遼寧錦州121001）

柚皮素脂質體的制備及大鼠肺部給藥藥動學研究

季 鵬， 趙文明*

（遼寧醫(yī)學院藥學院，遼寧錦州121001）

目的制備柚皮素 （naringenin）脂質體，研究其理化性質及經大鼠肺部給藥后的體內藥動學行為。方法采用薄膜分散法制備柚皮素脂質體，考察其形態(tài)、粒徑、Zeta電位、載藥量、包封率及滲漏率，透析袋測定脂質體在磷酸鹽緩沖液中的釋放，通過肺部滴注給藥考察脂質體在大鼠體內的藥動學行為。結果柚皮素脂質體外形圓整，平均粒徑為 （137.6±8.1）nm，Zeta電位為 （-21.9±5）mV，包封率為 （80.51±2.63）%，泄漏率低；24 h累積釋放達70%以上，脂質體的體外釋放符合Weibu11方程；柚皮素原料藥和脂質體的MRT分別為 （14.650±0.242）h和（20.721±0.873）h，Cmax分別為 （117.910±0.012），（722.477±0.025）ng/mL，AUC0-48分別為 （928.431± 0.137），（1 850.061±0.348）ng·h/mL。結論薄膜分散法成功制備了柚皮素脂質體；與原料藥相比，柚皮素脂質體肺部給藥后有明顯的緩釋作用，能提高藥物的生物利用度。

柚皮素；脂質體；肺部給藥；藥動學

柚皮素（naringenin，4＇，5，7-三羥基黃酮）廣泛存在于檸檬、葡萄、橘子等植物中，具有較強的抗炎、抗氧化、清除自由基、抗動脈粥樣硬化、抗纖維化等多種藥理作用［1-4］。最新藥理研究發(fā)現(xiàn)，柚皮素對急性肺損傷 （ALI）有很好的保護，拓展了治療ALI這類疾病的藥物［5］。ALI是指嚴重感染、創(chuàng)傷、休克等打擊后，出現(xiàn)以肺泡毛細血管損傷導致肺水腫和肺不張為病理特征的一種肺部炎癥與通透性增加綜合癥，目前臨床還沒有特效治療藥物。由于柚皮素水溶性和脂溶性均較差，分子結構中含有多個酚羥基易氧化變質，不適合制備成注射劑；腸胃給藥時吸收差，口服給藥的絕對生物利用率只有4%［6］。為了探索柚皮素治療ALI的效果，結合治療疾病的特點，我們選擇肺部給藥系統(tǒng)進行研究。

從制劑學角度看，脂質體是目前研究較多的肺內給藥載體，膜材主要由磷脂構成，而肺泡表面液層約90%為脂質成分，磷脂又占脂質成分的80%，故脂質體與肺泡壁具有很好的生物相容性［7］。將藥物包裹入脂質體，肺部給藥后，脂質體能蓄積于肺部發(fā)揮藥物貯庫的作用，不僅使包裹于其中的藥物通過磷脂雙分子層緩慢釋放，還可以減少藥物的治療劑量，降低藥物的毒副作用，提高藥物的生物利用度，且在各類納米制劑中最易實現(xiàn)產業(yè)化［8］。因此，本實驗將柚皮素制成脂質體，采用氣管滴注方式肺部給藥，比較柚皮素脂質體和原料藥溶液在大鼠體內的藥動學行為，探討其肺部給藥的可行性。

1 材料

1.1 儀器 L-2000E1ite型高效液相色譜儀（日立高新技術集團）；真空離心濃縮干燥機 （北京松源華興科技發(fā)展有限公司）。TU-1901雙光束紫外可見分光光度計 （UV，北京普析通用儀器有限責任公司）；Mastersizer2000激光粒度測定儀（英國Ma1vern公司）；RE-52A型旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；電子天平 （北京賽多利斯天平有限公司）；KQ-250B型超聲波清潔器 （昆山市超聲儀器有限公司）；LD4-2A低速離心機 （北京醫(yī)用離心機廠）；EM-1400高襯度透射電子顯微鏡 （日本電子公司）。

1.2 試劑 柚皮素 （質量分數(shù)≥98%，南京康維盛生物技術有限公司，批號20140219）；大豆卵磷脂 （上海太偉藥業(yè)有限公司，批號20140427）；膽固醇 （中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司，批號20140619）；Sephadex G-50（上海藍季科技發(fā)展有限公司，批號20140820）；透析袋 （美國聯(lián)合碳化公司，截留分子質量8 000～14 000 Da，批號20140608）。甲醇和乙腈為色譜純，其他試劑均為國產分析純或藥用。

1.3 動物 SD大鼠，體質量180～220 g，雌雄各半，遼寧醫(yī)學院動物實驗中心提供。

2 方法與結果

2.1 柚皮素脂質體的制備 采用薄膜分散法［9］，取磷脂60 mg、膽固醇12 mg、柚皮素3 mg溶于10 mL三氯甲烷-乙醇 （2∶1）中，超聲溶解后置于茄形瓶中，37℃旋轉蒸發(fā)除去有機溶劑，在瓶壁上形成一層均勻的類脂薄膜，通氮氣吹5 min以完全除去有機溶劑，向茄形瓶中加入0.1 mo1/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4）10 mL洗膜，37℃下水合2 h形成脂質體初乳液，經探頭超聲 （65 W，2 min）后，過0.45μm微孔濾膜，即得淡藍色的柚皮素脂質體混懸液，4℃儲存?zhèn)溆?。空白脂質體除不加藥物外，其他條件一樣。

2.2 形態(tài)、粒徑和Zeta電位 將脂質體混懸液用超純水稀釋數(shù)倍后，激光粒徑分析儀測定其粒徑和Zeta電位；將脂質體滴至銅網上，1%磷鎢酸負染，自然揮干，用透射電子顯微鏡觀察其形態(tài)并攝制照片。結果：脂質體平均體粒徑為 （137.6±8.1）nm，粒徑分布見圖1，多分散系數(shù) （PDI）為0.218±0.044，Zeta電位為（-21.9±5）mV；透射電鏡下柚皮素脂質體多呈球形及類球形，分布均勻，粒子間未見粘連和聚集 （圖2）。

圖1 柚皮素脂質體粒徑分布圖Fig.1 Particle size distribution of naringenin liposome

圖2 柚皮素脂質體透射電鏡照片F(xiàn)ig.2 T ransm ission electron m icroscope photo of naringenin liposome

2.3 脂質體含藥量的測定

2.3.1 檢測波長的確定 精密量取柚皮素脂質體0.1 mL，置10 mL量瓶中，無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。同法對空白脂質體進行處理。所得溶液用紫外分光光度計在200～400 nm內分別進行掃描。考察柚皮素的最大吸收波長及輔料對其測定的干擾情況。結果表明柚皮素在288 nm處有最大吸收，而空白脂質體 （輔料）對藥物的檢測在288 nm處基本無干擾，故本實驗選288 nm作為檢測波長。

2.3.2 線性關系 取柚皮素適量，用無水乙醇配成4、6、8、10、12μg/m L系列標準液，并在288 nm處測定各溶液的吸光度值 （A）。以A值對質量濃度 （C）進行線性回歸，回歸方程：A= 0.091 4C+0.102（r=0.999 9，n=5）。結果表明，溶液在4～12μg/m L范圍內線性關系良好。

2.3.3 精密度試驗 分別配制質量濃度為4、8、12μg/mL的柚皮素無水乙醇溶液，并在288 nm處測定各溶液的吸光度值，計算日內和日間精密度。日內精密度RSD分別為0.77%、0.43%、1.09%（n=5），日間精密度 RSD分別為 1.42%、1.77%、1.65% （n=5）。表明本方法精密度良好。

2.3.4 回收率的試驗 精密稱取2 mg柚皮素于10 mL量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，得200μg/mL的柚皮素貯備液。精密吸取0.2 mL空白脂質體于5 mL量瓶中，分別加入100、200、300μL柚皮素貯備液，加入無水乙醇稀釋至刻度，得質量濃度分別為4、8、12μg/mL樣品溶液，按“2.3.2”項測吸光度，重復3次，代入標準曲線方程，計算回收率。結果3種質量濃度的平均回收率分別為99.72%、101.3%、100.34%，RSD分別為0.92%、1.33%、1.57%。

2.3.5 含藥量的測定 精密吸取300μL柚皮素脂質體至10 mL量瓶中，無水乙醇稀釋至刻度，按“2.3.2”項測定光密度，重復3次，代入標準曲線方程，計算得柚皮素脂質體的平均含藥量為（0.30±0.02）mg/mL。

2.4 包封率和滲漏率的測定

2.4.1 柚皮素洗脫曲線的繪制 采用葡聚糖凝膠層析柱-UV法［10］。精密吸取柚皮素脂質體混懸液0.5 m L上SephadexG-50柱（內徑1.5 cm，長度20 cm），以雙蒸水洗脫，體積流量0.5 mL/min，每0.5 mL接1管，共收集20管，用無水乙醇稀釋適當倍數(shù)，以無水乙醇為空白，在288 nm處測定吸光度 （A），繪制出柚皮素洗脫曲線 （圖3）。由圖3可以看出柚皮素和游離藥物可以完全分開。該方法可用于柚皮素脂質體包封率的測定。

圖3 柚皮素脂質體的洗脫曲線Fig.3 E lution curve of naringenin liposome

2.4.2 上柱回收率的測定 精密吸取0.5 mL柚皮素脂質體上柱洗脫后收集含藥脂質體和游離藥物，測定兩部分洗脫液的藥物總量，以兩者之和與上柱前脂質體中的總藥量相比，重復3次，計算平均回收率為 （97.87±0.97）%。

2.4.3 包封率的測定 精密量取柚皮素脂質體混懸液0.5 mL上柱洗脫，每瓶0.5 mL，收集并合并有藍色乳光的部分，加入無水乙醇超聲溶解并定容至10 mL；另取未過柱的樣品0.5 mL加無水乙醇溶解定容至10mL，采用紫外分光光度法于288 nm處測定A值，代入線性回歸方程計算藥物的質量濃度，根據(jù)下式計算包封率（EE%）：EE%=（C1/C2）×100%。式中，C1為脂質體中包封的藥物濃度；C2為脂質體混懸液中柚皮素的總藥物濃度。測得脂質體中藥物的包封率為 （80.51± 2.63）%，n=3。

2.4.4 滲漏率的測定 將制得的3批脂質體當日測定包封率后，分別分裝2份置于4℃和室溫（25℃）保存一周后，測定包封率，根據(jù)下式計算滲漏率。滲漏率=［（當日測得的包封率-存放一周后的包封率）/當日測得的包封率］×100%。結果室溫放置的3批樣品滲漏率分別為3.32%、3.48%、3.37%，4℃冷藏保存的樣品滲漏率分別為0.34%、0.27%、0.36%，可見低溫保存時藥物泄漏較少。

2.5 體外釋放研究 將載有總量為1 mg柚皮素的脂質體和原料藥溶液（1 mg/m L的乙醇溶液）分別置透析袋 （截留分子質量為8 000～14 000 Da）中，兩端扎牢。置于裝有50 mL含0.5%十二烷基硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）的具塞瓶中，在37℃，100 r/min攪拌下考察其釋放情況。間隔一定時間取樣0.5 m L，同時補加新鮮釋放介質。紫外分光光度法測定釋放介質中藥物的A值，計算累積釋放率，繪制釋放曲線如圖4所示。體外釋放試驗表明，原料藥溶液在5 h累計釋放達到80%以上，6 h已經基本釋放完全；而脂質體6 h釋放不到30%，且釋放速度遠遠小于原料藥溶液，可見柚皮素脂質體的釋放有明顯的緩釋效果。分別用零級動力學、一級動力學、Higuchi方程及Weibu11方程對柚皮素脂質體和原料藥的體外釋放數(shù)據(jù)進行擬合，結果見表1。從擬合結果看，脂質體中柚皮素的釋放符合Weibu11方程，原料藥的釋放用一級和Weibu11方程擬合效果均較好。

2.6 脂質體大鼠肺部給藥藥動學研究

2.6.1 血漿樣品處理［11］取200μL血樣，依次加入0.1 mo1/L的NaOH 0.3 mL和100μL內標物（橙皮苷，5μg/mL），渦旋5 min。精密加入1 mL乙酸乙酯萃取血樣后，渦旋5 min，5 000 r/min離心10min，上清液轉移至離心管中，置真空離心濃縮干燥機揮干，殘留物用50μL流動相復溶，渦旋5 min，樣品在10 000 r/min離心10 min，取20μL，按照 “2.6.2”項進樣，記錄色譜峰面積。

圖4 柚皮素脂質體體外釋放曲線 （n=3）Fig.4 In vitro release of naringenin liposome（n=3）

表1 體外釋放擬合方程Tab.1 Results of release k inetic models of naringenin liposome and naringenin

2.6.2 大鼠血漿中柚皮素測定方法 通過高效液相測定大鼠血漿中柚皮素，測定條件如下：Hypersi1BDS-C18色譜柱（200 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為0.5%三乙胺（用醋酸調節(jié)pH到3）-乙腈（78∶28，v/v）；體積流量是1 m L/min；檢測波長是283 nm；進樣量為20μL；柱溫30℃。在該色譜條件下，最低檢測限為20 ng/mL（信噪比為3∶1），柚皮素的保留時間為 （8.675±0.105）min，峰形良好，血漿對柚皮素的測定無干擾，在0.05～0.85 mg/mL內線性關系良好，其標準曲線方程為Y=1 388.1X-9.397 1，r=0.999 8。分別配制低、中、高質量濃度 （100、450和 800 ng/mL）的柚皮素空白血漿標準溶液，按血漿樣品的處理操作，計算回收率，測定日內與日間 （3 d內）精密度。結果低、中、高3個質量濃度樣品的平均回收率分別為 107.25%、99.40%和107.25%，日內精密度 RSD分別為 4.41%、6.63%和7.53%（n=3），日間精密度的RSD值分別為3.30%、2.62%和4.21%（n=3）。該方法符合體內生物樣品測定要求。

2.6.3 給藥方法及樣品采集 取健康的SD大鼠12只，隨機分成2組，實驗過程中嚴格遵守動物倫理委員會的規(guī)定。實驗前禁食至少12 h，自由飲水，按照20 mg/kg的劑量分別將柚皮素脂質體（含藥量為0.30 mg/mL）和原料藥（取10 mg柚皮素分散在0.5%羥丙基纖維素溶液中，臨用現(xiàn)配）進行肺部給藥。肺部給藥方法為注射器氣管滴注，給藥前用0.3%戊巴比妥鈉（10 mL/kg）腹腔注射麻醉。然后將大鼠固定在一傾斜約80°的木板上，大鼠自主呼吸，用喉鏡使大鼠開口，鑷子輕輕拉出舌頭，慢慢將通氣導管一端插入大鼠氣管，預先裝好樣品的注射器連接導管另一端并快速滴入肺，給藥后維持鼠板傾斜80°1 min，再呈水平放置［12］。給藥后分別于0.5、1、2、4、6、8、12、24、48 h眼眶取血0.5 mL，置于加有肝素鈉的離心管中，6 000 r/min離心15 min，分離血漿，置-20℃冰箱中儲存待分析。

2.6.4 藥動學結果分析 根據(jù)HPLC測定結果，計算血漿樣品中的藥物濃度，繪制藥物質量濃度-時間曲線（見圖5）。藥動學參數(shù)使用附加在Exce1中PKSo1ver2.0計算［13］，得到原料藥和脂質體中柚皮素的最大質量濃度（Cmax）分別為（117.910± 0.012），（722.477±0.025）ng/mL，半衰期 （t1/2）分別為（0.028 9±0.002 21）h和（0.103±0.012 7）h，曲線下面積 （AUC0-48）分別為 （928.431± 0.137），（1 850.061±0.348）ng·h/m L，及MRT分別為 （14.650±0.242）h和 （20.721±0.873）h，達峰時間 （tmax）分別為0.140 h和0.102 h。

圖5 柚皮素原料藥混懸劑和脂質體肺部滴注后藥物在大鼠體內的平均藥時曲線Fig.5 Plot of concentration-time（，n=6）for naringenin suspension and naringenin liposome

3 討論

肺部給藥系統(tǒng)是指將藥物傳遞到肺部，用于局部或全身疾病的治療［10］。與其他給藥途徑 （鼻腔、直腸、口腔及透皮等）相比，具有表面積大，泡壁薄，毛細血管豐富，藥物吸收迅速，無肝臟首過效應，能避開胃腸道對藥物的不利影響等優(yōu)點。

本研究采用薄膜分散法制備柚皮素脂質體，由于柚皮素在三氯甲烷中的溶解度低，需要加入大量的三氯甲烷才可以溶解較多量的柚皮素，這使得揮發(fā)成膜時間很長，也不利于水化；而當加入適量無水乙醇時，柚皮素在混合溶劑中的溶解度大大提高，減少了有機相的體積，有利于揮發(fā)和脂質膜的形成。

脂質體和游離藥物的分離是測定包封率的關鍵步驟，本實驗曾考慮采用超速離心法，18 000 r/min離心1 h后仍未見分層，分析原因可能是脂質體粒徑比較小、采用的脂質材料相對密度都低于1；透析法單個樣品在室溫條件下的處理時間約24 h，比較耗時；超濾法和葡聚糖凝膠柱法成本較高；而葡聚糖凝膠層析柱法能將不易進入凝膠內部的脂質體大分子先洗脫下來，易進入凝膠內部的小分子游離藥物后洗脫下來而達到分離，且該法重現(xiàn)性好、快速有效、成本低，故本實驗選擇葡聚糖凝膠層析柱法測定包封率。

體外為模擬制劑在生物體內的釋放，一般選擇pH 7.4的磷酸鹽緩沖液或雙蒸水作為釋放介質。但柚皮素難溶于水，需加入一定量的表面活性劑或助溶劑，故本實驗選擇0.5%十二烷基硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液作為釋放介質以達到漏槽條件。體外釋放結果表明，柚皮素脂質體有很好的緩釋效果。

與柚皮素原料藥相比，柚皮素脂質體的t1/2延長，其原因可能是藥物被包封在磷脂雙分子層中，有效地減緩了藥物釋放；Cmax和AUC0-48值分別為原料藥的6.127倍和1.993倍，表明柚皮素脂質體能夠顯著提高藥物肺部給藥的生物利用度，其原因可能是柚皮素是含有酚羥基的黃酮類化合物，水溶性差，不易透過組織生物膜屏障，肺部的吸收率較低，而柚皮素脂質體將藥物包埋在磷脂雙分子層中，提高了體內的穩(wěn)定性，增強其脂溶性，藥物通過緩慢釋放，與肺泡表面更好融合，有助于脂質體通過肺泡壁進入毛細血管，使其有效的血藥濃度時間延長，有利于提高肺部給藥藥物的生物利用度。

柚皮素脂質體體外釋放較柚皮素慢其原因可能是脂質體磷脂雙分子層發(fā)揮了藥物貯庫作用，使柚皮素在釋放介質中緩慢釋放；而體內吸收卻較柚皮素快的原因一方面可能是脂質體表面吸附的藥物在體內能迅速釋放，另一方面可能是脂質體膜的磷脂雙分子層與肺部內源性物質具有較好的相容性，且藥物在脂質體和細胞間發(fā)生膜間轉運，脂質體與細胞相鄰磷脂雙分子層間的脂質成分發(fā)生相互交換作用，使藥物不必從內水相中釋放而直接進入細胞內部，因此脂質體內部未釋放的藥物可能會通過膜的融合而被肺深部吸收［14］。

至今國內外仍無成熟的柚皮素制劑用于臨床，納米載藥系統(tǒng)具有很好的應用前景，脂質體具有良好的肺部耐受性，但不穩(wěn)定、藥物易泄漏，如果將其制備成凍干粉吸入劑，不僅可以提高其穩(wěn)定性，而且使用方便。本實驗為柚皮素脂質體肺部給藥系統(tǒng)的進一步研究提供了理論依據(jù)和實驗基礎。

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Preparation optim ization of naringenin liposome based on its pharmacokinetics after pulmonary delivery in rats

JIPeng， ZHAOWen-ming*
（Pharmacy School，Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China）

naringenin；1iposome；pu1monary de1ivery；pharmacokinetics

R944.1+5

A

1001-1528（2015）08-1699-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.014

2015-01-23

季 鵬（1990—），男，碩士，研究方向為藥物新劑型。E-mai1：jipeng0213@163.com

*通信作者：趙文明（1957—），男，教授，研究方向為藥物新劑型。E-mai1：zhaowenming1957@163.com