楓香脂揮發(fā)油對(duì)大鼠離體胸主動(dòng)脈的舒張作用

李建明， 王 政，陳 川*， 宋清宏

（1.上海市中醫(yī)老年醫(yī)學(xué)研究所，上海200031；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海201203）

楓香脂揮發(fā)油對(duì)大鼠離體胸主動(dòng)脈的舒張作用

李建明1， 王 政2，陳 川1*， 宋清宏1

（1.上海市中醫(yī)老年醫(yī)學(xué)研究所，上海200031；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海201203）

目的研究水蒸汽蒸餾法提取楓香脂揮發(fā)油對(duì)大鼠離體胸主動(dòng)脈的舒張作用，并探討其可能機(jī)制。方法楓香脂揮發(fā)油成分分析在氣相-質(zhì)譜上進(jìn)行，分離SD大鼠胸主動(dòng)脈進(jìn)行離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)，觀察楓香脂揮發(fā)油對(duì)苯腎上腺素預(yù)收縮引起的舒縮功能的反應(yīng)，并結(jié)合一氧化氮合酶抑制劑左旋硝基精氨酸甲酯和環(huán)氧合酶抑制劑吲哚美辛，觀測(cè)楓香脂揮發(fā)油對(duì)血管環(huán)的作用。結(jié)果氣相-質(zhì)譜結(jié)果顯示主要成分是三甲基肼、3-蒈烯、（1R）-2，6，6-三甲基二環(huán)［3.1.1］庚-2-烯、2-亞甲基-4，8，8-三甲基-4-乙烯基-二環(huán) ［5.2.0］壬烷；累計(jì)體積分?jǐn)?shù)的楓香脂揮發(fā)油對(duì)苯腎上腺素預(yù)收縮的血管環(huán)在內(nèi)皮完整最大舒張率可達(dá)32.67%；結(jié)合左旋硝基精氨酸甲酯和吲哚美辛孵育0.5 h后，均顯示有明顯抑制血管舒張的作用。結(jié)論楓香脂揮發(fā)油對(duì)大鼠離體血管確實(shí)有舒張血管的作用，其機(jī)制可能跟一氧化氮合酶和環(huán)氧合酶的合成有關(guān)。

楓香脂；揮發(fā)油；氣相-質(zhì)譜；血管環(huán)實(shí)驗(yàn)；左旋硝基精氨酸甲酯；吲哚美辛

楓香脂為金縷梅科植物楓香［1-3］Liquidambar formosana Hance的干燥樹(shù)脂，楓香脂［4］性辛、微苦，平，歸肺、脾經(jīng)，具有活血止痛、解毒、生肌的功效，用于跌撲損傷、癰疽腫痛、吐血、衄血等。關(guān)于楓香脂揮發(fā)性成分的研究已有一些報(bào)道，多用水蒸氣蒸餾法［5-6］提取其揮發(fā)性成分，對(duì)樣品的處理采取液-液萃取 （如用石油醚萃取蒸餾出的油等）。雖揮發(fā)油提取已有研究，但是其成分和藥理活性很少有報(bào)道。血管內(nèi)皮功能［7］包括血管收縮舒張功能和內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能。血管的收縮舒張功能［8-10］是通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌許多血管活性物質(zhì) （如內(nèi)皮衍生舒張因子、內(nèi)皮素等）實(shí)現(xiàn)的。針對(duì)此種情況，本研究主要結(jié)合舒張血管的不同抑制劑，研究楓香脂揮發(fā)油舒張血管的可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 試劑與儀器 新鮮楓香脂購(gòu)自云南省文山州。乙酰膽堿（ACh）（批號(hào)A2661-25G，Sigma）；苯腎上腺素（pheny1ephrine，PE）（批號(hào)P6126-5G）；五羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）（批號(hào)H9523-25MG，Sigma）；左旋硝基精氨酸甲酯 （LNAME）（批號(hào)561334A；Sigma）；吲哚美辛（indomethacin）（批號(hào)51298-62-5，Adamas Reagent）。PawerLab血管功能測(cè)定系統(tǒng)（澳大利亞AD INSTRUMENTS）；4通道（6 m L水浴槽）多功能生理記錄儀（澳大利亞AD INSTRUMENTS）；氣相色譜儀（Agi1ent，GC6890N）；色譜柱（Agi1ent，HP-5）；二苯基聚硅氧烷共聚物色譜柱，頂空進(jìn)樣皿（Agi1ent，7694E）；美國(guó)Agi1ent 7890A、5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。

1.2 動(dòng)物 SD大鼠，普通級(jí)，（200±20）g，雄性，合格證號(hào)SCXK 2012-0002，購(gòu)買(mǎi)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 楓香脂揮發(fā)油的提取 取一定量新鮮楓香脂，加5倍量水，水蒸汽提取8 h，將收集得到的楓香脂揮發(fā)油離心去水，量取體積，精確到0.1 mL，氣相-質(zhì)譜測(cè)定成分。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，揮發(fā)油使用二甲亞砜（DMSO）溶解。

1.4 血管環(huán)的制備 大鼠麻醉處死，迅速取出整體胸主動(dòng)脈部位，置于4℃、含95%O2和5%CO2混合氣體預(yù)飽和的K-H液中，分離胸動(dòng)脈剔除周?chē)窘M織制成3～5 mm血管環(huán)，將血管環(huán)固定于6 mL K-H液的浴槽內(nèi)，37℃恒溫，并持續(xù)通入95%O2+5%CO2的混合氣體。每個(gè)血管環(huán)給予2.0 g拉力，每20 min更換K-H液1次，平衡80 min，以60 mmo1/L的KC1預(yù)收縮兩次，以誘發(fā)最大收縮度，用K-H液洗脫拉力穩(wěn)定后，第一次加入五羥色胺20μmo1/L，待拉力達(dá)到坪值后加入10μmo1/L ACh，若血管舒張達(dá)80%以上，可認(rèn)為內(nèi)皮完整。內(nèi)皮檢查完整度后，使用K-H液洗脫拉力穩(wěn)定，第二次使用10μmo1/L苯腎上腺素PE，待拉力穩(wěn)定后加入目標(biāo)藥物，檢測(cè)藥物對(duì)血管環(huán)的作用（楓香脂揮發(fā)油體積分?jǐn)?shù)均為0.75 mL/m L）。

1.5 觀察累計(jì)劑量的楓香脂揮發(fā)油對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)血管環(huán)的影響 將內(nèi)皮完整的SD大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)隨機(jī)分為楓香脂揮發(fā)油組、對(duì)照組。以不同累計(jì)劑量作用于基礎(chǔ)狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)組 （n=6）與對(duì)照組（n=6）采用累計(jì)劑量使其終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到2.5× 10-7、5×10-7、1.0×10-6、2.0×10-6mL/mL，每一分鐘加一次，對(duì)照組以相應(yīng)的DMSO溶解的K-H液代替揮發(fā)油加入量。

1.6 累計(jì)劑量楓香脂揮發(fā)油對(duì)PE預(yù)收縮內(nèi)皮完整的影響 分組及加藥方法同 “1.5”項(xiàng)，實(shí)驗(yàn)組（n=6）以不同累計(jì)劑量楓香脂揮發(fā)油作用于10 μmo1/L苯腎上腺素PE預(yù)收縮的血管環(huán)，觀察楓香脂揮發(fā)油對(duì)血管環(huán)的影響；對(duì)照組加入DMSO溶解的K-H液代替揮發(fā)油。

1.7 楓香脂揮發(fā)油對(duì)無(wú)鈣液預(yù)處理的的去內(nèi)皮血管環(huán)的作用 實(shí)驗(yàn)組 （n=6）將血管使用機(jī)械力取出血管內(nèi)皮細(xì)胞，然后在無(wú)鈣液中穩(wěn)定40 min，加入楓香脂揮發(fā)油終體積分?jǐn)?shù)為 2.0×10-6m L/mL，共孵育30 min，加入10μmo1/L苯腎上腺素PE預(yù)收縮的血管環(huán)，觀察楓香脂揮發(fā)油的作用；對(duì)照組加入含有DMSO溶解的K-H液代替揮發(fā)油。

1.8 觀察楓香脂揮發(fā)油對(duì)一氧化氮合酶抑制劑LNAME預(yù)處理的PE預(yù)收縮的影響 實(shí)驗(yàn)組（n= 6）用L-ANME（濃度為0.1 mmo1/L）孵育內(nèi)皮完整的血管環(huán)20 min，以PE預(yù)收縮，觀察楓香脂揮發(fā)油的作用；對(duì)照組加入含有DMSO溶解的K-H液代替揮發(fā)油。

1.9 觀察楓香脂揮發(fā)油對(duì)環(huán)氧合酶抑制劑吲哚美辛預(yù)處理的PE預(yù)收縮的影響 實(shí)驗(yàn)組 （n=6）用吲哚美辛（濃度為0.1 mmo1/L）孵育內(nèi)皮完整的血管環(huán)20 min，以PE預(yù)收縮，觀察楓香脂揮發(fā)油的作用；對(duì)照組加入含有DMSO溶解的K-H液代替揮發(fā)油。

2 結(jié)果

2.1 楓香脂揮發(fā)油氣相-質(zhì)譜（GC-MS）分析 根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)研究和文獻(xiàn)［2-3］調(diào)查確定，氣相色譜條件為HP-5MS毛細(xì)管柱（30 m×250μm×0.25 μm）；柱溫，起始柱溫100℃，然后以6℃/min升溫，至160℃時(shí)保留2 min，以2℃/min升溫，至190℃時(shí)保留3 min，以8℃/min升溫至240℃；進(jìn)樣器溫度，310℃；載氣，He；分流比，2∶1；進(jìn)樣量，1μL。質(zhì)譜條件EI離子源；溫度280℃；電離電壓70 eV；掃描質(zhì)量范圍，50.0～500 amu（m/z）；NIST05a譜庫(kù)，如圖1和表1。

圖1 楓香脂揮發(fā)油氣相-質(zhì)譜離子峰Fig.1 GC-M S of volatile oil from Liquidambaris Resina

表1 楓香脂揮發(fā)油主要成分Tab.1 M ain components of volatile oil from Liquidambaris Resina

2.2 累計(jì)劑量的楓香脂揮發(fā)油對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)血管環(huán)的影響 以不同累計(jì)劑量作用于基礎(chǔ)狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)組（n=6）與對(duì)照組 （n=6）采用累計(jì)劑量使其終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到 2.5×10-7、5×10-7、1.0×10-6、2.0×10-6mL/mL。最終結(jié)果顯示，累計(jì)劑量的楓香脂對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)的血管環(huán)無(wú)影響。

2.3 累計(jì)劑量楓香脂揮發(fā)油對(duì)PE預(yù)收縮內(nèi)皮完整的影響 實(shí)驗(yàn)組 （n=6）以不同累計(jì)劑量楓香脂揮發(fā)油作用于10μmo1/L苯腎上腺素PE預(yù)收縮的血管環(huán)，以PE最大收縮度作為100%對(duì)照參考。結(jié)果顯示，不同累計(jì)體積分?jǐn)?shù)的楓香脂揮發(fā)油對(duì)血管環(huán)有舒張作用，并且有體積分?jǐn)?shù)依耐性舒張，在終劑量達(dá)到2.0×10-6m L/mL時(shí)，舒張最大，達(dá)到32.67%，如圖2。

圖2 累計(jì)劑量楓香脂揮發(fā)油對(duì)PE預(yù)收縮內(nèi)皮完整的影響Fig.2 Effect of cumulative dose of Liquidambaris Resina volatile oil on PE pre-contracted artery rings

2.4 楓香脂揮發(fā)油對(duì)無(wú)鈣液預(yù)處理的的去內(nèi)皮血管環(huán)的作用 無(wú)鈣液中穩(wěn)定40min，加入楓香脂揮發(fā)油終體積分?jǐn)?shù)為2.0×10-6m L/mL，共孵育30 min，孵育前用PE預(yù)收縮一次，孵育后PE預(yù)收縮一次，比較前后兩次收縮程度，以第二次收縮占第一次收縮程度百分率判斷。與空白組比較發(fā)現(xiàn)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明楓香脂揮發(fā)油舒張血管與血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放鈣離子無(wú)關(guān)，如圖3。

2.5 楓香脂揮發(fā)油對(duì)一氧化氮合酶抑制劑LNAME預(yù)處理的PE預(yù)收縮的影響 實(shí)驗(yàn)組（n= 6）用L-ANME（濃度為0.1 mmo1/L）孵育內(nèi)皮完整的血管環(huán)20 min，PE預(yù)收縮，以PE最大收縮度作為100%對(duì)照參考。觀察發(fā)現(xiàn)楓香脂揮發(fā)油相比于不加一氧化氮合酶抑制劑L-NAME，有明顯的抑制舒張的作用，如圖4。

2.6 楓香脂揮發(fā)油對(duì)環(huán)氧合酶抑制劑吲哚美辛預(yù)處理的PE預(yù)收縮的影響 實(shí)驗(yàn)組（n=6）用環(huán)氧合酶抑制劑吲哚美辛（濃度為0.1 mmo1/L）孵育內(nèi)皮完整的血管環(huán)20 min，PE預(yù)收縮，以PE最大收縮度作為100%對(duì)照參考。觀察發(fā)現(xiàn)楓香脂揮發(fā)油相比于不加環(huán)氧合酶抑制劑吲哚美辛，有明顯的抑制舒張的作用，如圖5。

3 結(jié)論

圖3 楓香脂揮發(fā)油對(duì)無(wú)鈣液預(yù)處理的的去內(nèi)皮血管環(huán)的作用Fig.3 Effect of Liquidambaris Resina volatile oil on vascular ringsw ithout endothelium pretreated by calcium-free solution.

圖4 楓香脂揮發(fā)油對(duì)一氧化氮合酶抑制劑L-NAME預(yù)處理的PE預(yù)收縮的影響Fig.4 E ffect of Liquidambaris Resina volatile oil on PE p re-contraction pretreated by L-NAM E

經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)工藝［3］，本課題組得到楓香脂揮發(fā)油得油率超過(guò)20%，楓香脂現(xiàn)在研究比較少，可以獲得的數(shù)據(jù)有限。楓香脂GC-MS結(jié)果顯示楓香脂揮發(fā)油主要成分是由 三甲基肼，3-蒈烯，（1R）-2，6，6-三甲基二環(huán) ［3.1.1］庚-2-烯，2-亞甲基-4，8，8-三甲基-4-乙烯基-二環(huán) ［5.2.0］壬烷組成，含有量超過(guò)80%，其各自藥理學(xué)研究還有待于進(jìn)一步詳細(xì)研究。

圖5 楓香脂揮發(fā)油對(duì)環(huán)氧合酶抑制劑吲哚美辛預(yù)處理的PE預(yù)收縮的影響Fig.5 L.Resina volatile oil on PE pre-con traction pretreated by indomethacin

舒張血管作用途徑總的來(lái)說(shuō)［11-13］，主要通過(guò)內(nèi)皮依耐性增加舒血管活性物質(zhì)NO及前列腺素的釋放，抑制縮血管物質(zhì)如內(nèi)皮素等的產(chǎn)生，非內(nèi)皮途徑阻滯鈣離子通道、開(kāi)放鉀離子通道等途徑發(fā)揮舒張血管的作用。楓香脂揮發(fā)油與水不溶，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們使用DMSO與揮發(fā)油溶解，快速加入血管水浴槽，只有極少部分揮發(fā)油接觸到血管環(huán)產(chǎn)生作用，大部分與水分層，所以進(jìn)一步與水充分接觸是我們進(jìn)一步研究的保證。文章研究表明楓香脂揮發(fā)油具有明顯的舒張血管的作用，在其加入終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到2.0×10-6mL/mL，最大舒張率可達(dá)32.67%。經(jīng)過(guò)無(wú)鈣液培育，發(fā)現(xiàn)其血管舒張基本是由于血管內(nèi)皮細(xì)胞引起的，結(jié)合一氧化氮合酶抑制劑L-NAME研究我們發(fā)現(xiàn)，楓香脂揮發(fā)油舒張血管跟一氧化氮合酶合成有關(guān)，其有抑制合酶合成作用，結(jié)合環(huán)氧合酶抑制劑吲哚美辛我們也發(fā)現(xiàn)其舒張血管跟環(huán)氧合酶也有關(guān)。楓香脂揮發(fā)油舒張血管詳細(xì)機(jī)制還在進(jìn)一步研究中。

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Vasodilatory effect of Liquidambaris Resina volatile oil on rats aorta in vitro

LIJian-ming1， WANG Zheng2， CHEN Chuan1*， SONG Qing-hong1
（1.ShanghaiGeriatric Institute of ChineseMedicine，Shanghai200031，China；2.College of Pharmacy，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai201203，China）

AIMTo investigate the vasodi1atory effect of Liquidambaris Resina steam-vo1ati1e oi1on the iso1ated thoracica aorta and exp1ore its possib1emechanism.METHODSThe ana1ysis of Liquidambaris Resina vo1ati1e oi1was performed on gas chromatography-mass spectrometry.Iso1ated SD rataortic vascu1ar was used in vitro to the vascu1ar ring experiment，observing the pre-contraction effect caused by pheny1ephrine，aswe11as by nitric oxide synthase inhibitor L-NAME and cyc1ooxygenase inhibitor indomethacin on vascu1ar ring.RESULTSGC-MS data showed that themain constituents of vo1ati1e oi1were trimethy1-hydrazine，3-carene，（1R）-2，6，6-trimethy1bi-cyc1o［3.1.1］hept-2-ene，2-methy1ene-4，8，8-trimethy1-4-viny1-bicyc1o-［5.2.0］nonane.Vo1ati1e oi1 had a significant pre-contracted effect caused by PE，and the va1ue ofmaximum re1axation was32.67%.After L-NAME and indomethacin incubating with vascu1ar ring for 0.5 h，they cou1d marked1y inhibit vasodi1ation.CONCLUSIONLiquidambaris Resina vo1ati1e oi1has significant vasodi1ation for SD rats，and ismain1y re1ated to the activation of nitric oxide synthase and cyc1ooxygenase pathway.

Liquidambaris Resina；vo1ati1e oi1；GC-MS；vascu1ar ring experiment；L-NAME；indomethacin

R285.5

A

1001-1528（2015）08-1659-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.006

2014-08-19

李建明 （1967—），男，博士，研究員，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)老年醫(yī)學(xué)理論與技術(shù)、中醫(yī)藥防治老年病新技術(shù)和新產(chǎn)品研發(fā)。Te1：（021）6470010，18817395027，E-mai1：1ijianmingg@vip.sina.com

*通信作者：陳 川 （1963—），男，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治老年性癡呆、動(dòng)脈粥樣硬化及延緩衰老。Te1：（021）64720010，E-mai1：shagetcm@126.com