華蟾素抑制人胃癌BGC-823細胞體外侵襲、遷移的機理

喬翠霞， 張新峰， 蔡小平*， 程旭鋒

（1.河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院腫瘤科，河南鄭州450004；2.河南省腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)科，河南鄭州450000；3.河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院乳腺科，河南鄭州450000）

華蟾素抑制人胃癌BGC-823細胞體外侵襲、遷移的機理

喬翠霞1， 張新峰2， 蔡小平1*， 程旭鋒3

（1.河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院腫瘤科，河南鄭州450004；2.河南省腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)科，河南鄭州450000；3.河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院乳腺科，河南鄭州450000）

目的探討華蟾素（Cinobufacin）體外抑制人胃癌BGC-823細胞侵襲的作用及其機制。方法以0.156 mg/L和0.313 mg/L華蟾素體外作用人胃癌BGC-823細胞，采用MTT法檢測華蟾素對BCG-823細胞生長的抑制效果，Transwe11小室法檢測細胞的遷移和侵襲能力，Western b1ot法檢測BGC-823細胞中NF-κB p56、MMP-9蛋白的表達量。結(jié)果華蟾素可濃度依賴性抑制體外BGC-823細胞增殖、遷移和侵襲，同時下調(diào)BGC-823細胞中NF-κB和MMP-9蛋白表達。結(jié)論華蟾素體外可抑制胃癌的轉(zhuǎn)移，該作用可能通過下調(diào)NF-κB、MMP-9的表達相關(guān)。

人胃癌BGC-823細胞；華蟾素；NF-κB；MMP-9；侵襲；遷移

華蟾素注射液（Cinobutacini injection，CINO）是采用中華大蟾蜍的外皮提取的中成藥制劑，有化瘀、解毒散結(jié)等作用，為國家級中藥保護品種。華蟾素具有多種抗腫瘤活性，可用于原發(fā)性肝癌、肺癌、食管癌、胃癌、白血病、胰腺癌、皮膚癌等多種晚期惡性腫瘤的防治，相關(guān)臨床及基礎(chǔ)研究結(jié)果已見報道［1-3］。但這些研究主要集中在華蟾素抑制腫瘤細胞增殖、誘導癌細胞凋亡和改善患者生存質(zhì)量、延長生存時間等方面，而在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移方面的研究尚未見文獻報道。本研究旨在探究華蟾素對人胃癌細胞轉(zhuǎn)移的影響及其機理研究，從而為本課題進一步深入研究華蟾素注射液抑制腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品和主要試劑 華蟾素注射液購自湖北諾得勝制藥有限公司。Matrige1基底膜基質(zhì)膠由Becton，Dickinson and Company（美國）提供；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、L-谷氨酰胺均為美國Invitrogn公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白、二甲基亞砜 （DMSO）均為生物工程 （上海）有限公司產(chǎn)品；噻唑藍（MTT）由Sigma公司（美國）提供；核因子κB p65（NF-κB p65）抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶9（Matrixmeta11oproteinases 9，MMP-9）抗體和β肌動蛋白（β-actin）抗體均為美國Epitomics公司產(chǎn)品；實驗所用的所有Transwe11小室均由CORNINGCompany（美國康寧公司）提供；RIPA裂解液購自北京索萊寶科技有限公司；上海碧云天公司提供結(jié)晶紫染色試劑盒。

1.2 細胞培養(yǎng) 人胃癌BGC-823細胞（美國模式菌種收集中心ATCC）。將細胞接種于培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)基（葡萄糖4.5 g/L），其中含10%胎牛血清，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中，細胞按5×104個/cm2接種于24孔培養(yǎng)板。

1.3 MTT法 BGC-823細胞在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。取對數(shù)生長期BGC-823細胞，制備密度為1×105個/mL的細胞懸液；取96孔板，每孔加入200μL細胞懸液［11］，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，加入用不含血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋的受試華蟾素溶液，其中華蟾素終質(zhì)量濃度分別為 0.156、0.313、0.625、1.25、2.5、5 mg/L，均分別培養(yǎng)24、48、72 h，各質(zhì)量濃度、時間點均設(shè)3個復(fù)孔 （n=3）。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔中加入2 mg/mLMTT溶液50μL，然后將以上溶液再培養(yǎng)4 h；接著放棄各個培養(yǎng)孔內(nèi)液體，均加入150μL DMSO溶劑，持續(xù)進行振蕩共10 min，最后將酶標儀設(shè)置在570 nm波長處測定吸光度（OD）值，計算細胞存活率，每組實驗均重復(fù)3次。

注：細胞存活率 =［（OD實驗組-OD背景組）/（OD對照組-OD背景組）］×100%。

1.4 細胞侵襲實驗 將50μL人工基質(zhì)膠分別涂敷于Transwe11插入式的培養(yǎng)皿濾膜的24孔表面，然后將其放在37℃的培養(yǎng)箱中孵育6 h，最后形成凝膠狀物質(zhì)。取對數(shù)生長期的、用無血清DMEM處理24 h的BGC-823細胞，分別加不同濃度的、無血清DMEM稀釋的華蟾素（0.156和0.313 mg/L），并設(shè)不含華蟾素的無血清DMEM作為對照，預(yù)處理細胞2 h，消化、離心。然后將細胞懸液制備成密度達到5×105個/mL，用移液器取出200μL含華蟾素或不含華蟾素處理過的細胞懸液，分別將其加到插入式Transwe11培養(yǎng)皿的24孔上室，然后在24孔Transwe11培養(yǎng)皿板的各個下室均添加600μL含10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液，下層培養(yǎng)液和Transwe11培養(yǎng)皿間避免存在氣泡，以上各個實驗組均設(shè)置5個復(fù)孔。將其培養(yǎng)24 h之后，取出濾膜，將以上各小室內(nèi)表面沒有穿透濾膜的細胞均擦掉，用甲醇溶液進行15 min的固定，隨后用 PBS緩沖液漂洗3次，接著用0.1%結(jié)晶紫在室溫下進行30 min染色，再次用PBS緩沖液漂洗3次，最后將其在倒置顯微鏡下對膜背面的細胞數(shù) （N）進行計數(shù)，采用隨機計數(shù)共10個視野，計算出其中的平均數(shù)值。以上每一組均要反復(fù)進行3次，侵襲抑制率=（1-N實驗組/ N對照組）×100%。

1.5 BGC-823細胞的體外遷移實驗 本研究中BGC-823細胞的遷移實驗方法與侵襲實驗流程相同，區(qū)別在于遷移實驗的24孔Transwe11培養(yǎng)皿濾膜的內(nèi)部表層上沒有使用Matrige1基底膜基質(zhì)［4］。

1.6 Western b1ot法 將對數(shù)生長期的BGC-823細胞按5×105個/孔的密度加入6孔板中，待細胞覆蓋皿底80%～90%去除舊培液，加入不含或含不同質(zhì)量濃度（0.156和0.313 mg/L）華蟾素的細胞培液作用48 h后，RIPA裂解細胞10 min，18 000×g離心15 min（4℃），提取上清液，樣品用Bio-Rad protein assay進行總蛋白含量的測定。然后取等量蛋白質(zhì)的樣品 （30μg/孔），接著采用8% SDS-PAGE進行電泳分析實驗，使用半干轉(zhuǎn)膜儀進行轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉將其封閉后，分別滴加相應(yīng)的兔抗人抗體使之成為第一抗體，用HRP標記過的羊抗兔IgG標成第二抗體，隨后進行ECL顯色，最后將X線各個膠片均曝光。各顯色條帶吸光度值測定使用Quantity One（BIO-RAD公司）軟件分析，第一步測定各個蛋白印跡密度與內(nèi)參β-actin印跡比值，接著將各個華蟾素處理過的組分別與同對照組對比，最終測得蛋白的相對表達量。

2 統(tǒng)計方法

3 結(jié)果

3.1 華蟾素對BGC-823細胞增殖的影響 如圖1所示，華蟾素對BGC-823細胞存活率的抑制作用呈時間和質(zhì)量濃度依賴性。較低質(zhì)量濃度的華蟾素（0.156和0.313 mg/L）作用BGC-823細胞24、48、72 h，細胞存活率無明顯下降；較高質(zhì)量濃度的華蟾素（2.5、5 mg/L）作用BGC-823細胞48 h后，細胞存活率明顯下降，其細胞生長抑制率分別為69.25%和86.01%，而當5 mg/L的華蟾素作用BGC-823細胞24 h后，抑制率即達到78.35%。該結(jié)果提示，高質(zhì)量濃度的華蟾素對BGC-823細胞增殖具有明顯的抑制作用，但也有因BGC-823細胞活力受到抑制的因素影響。本研究進一步選用質(zhì)量濃度為0.156 mg/L和0.313 mg/L華蟾素，分別作用于BGC-823細胞24 h。

圖1 華蟾素對BGC-823細胞增殖的抑制作用Fig.1 G row th inhibitory effects of Cinobufacin on BGC-823 cells

3.2 華蟾素對BGC-823細胞體外侵襲能力的影響

華蟾素可顯著抑制體外BGC-823細胞侵襲能力，且呈質(zhì)量濃度依賴性 （表1）。與對照組比較，華蟾素（0.156 mg/L和0.313 mg/L）組侵襲細胞數(shù)均顯著減少（P＜0.01）；與華蟾素（0.156 mg/L）組比較，華蟾素（0.313 mg/L）組侵襲細胞數(shù)顯著減少 （P＜0.05）。

表1 華蟾素對BGC-823細胞侵襲能力的影響（，n=5）Tab.1 Effect of Cinobufacin on the invasion ability of BGC-823 cells in vitro（，n=5）

表1 華蟾素對BGC-823細胞侵襲能力的影響（，n=5）Tab.1 Effect of Cinobufacin on the invasion ability of BGC-823 cells in vitro（，n=5）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與華蟾素 （0.156 mg/L）組比較，△P＜0.05

組別 質(zhì)量濃度/（mg·L-1）細胞數(shù)/（個/視野） 抑制率/%對照組 — 168.92±19.47—49.02華蟾素組 0.156 113.96±14.64** 32.36華蟾素組 0.313 85.92±11.13**△

3.3 華蟾素對BGC-823細胞體外遷移能力的影響

華蟾素能顯著抑制BGC-823細胞體外遷移，并呈質(zhì)量濃度依賴性 （表2）。與對照組比較，華蟾素（0.156 mg/L和0.313 mg/L）組遷移細胞數(shù)均顯著減少 （P＜0.01）；與華蟾素（0.156 mg/L）組比較，華蟾素 （0.313 mg/L）組遷移細胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）。

表2 華蟾素對BGC-823細胞遷移能力的影響 （，n=5）Tab.2 Effect of Cinobufacin on the m igratory ability of BGC-823 cells in vitro（，n=5）

表2 華蟾素對BGC-823細胞遷移能力的影響 （，n=5）Tab.2 Effect of Cinobufacin on the m igratory ability of BGC-823 cells in vitro（，n=5）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與華蟾素 （0.156 mg/L）組比較，△P＜0.05

組別 質(zhì)量濃度/（mg·L-1）細胞數(shù)/（個/視野） 抑制率/%對照組 — 383.28±33.84—45.64華蟾素組 0.156 254.56±27.90** 33.58華蟾素組 0.313 208.36±19.56**△

3.4 華蟾素對BGC-823細胞中NF-κB p65和MMP-9表達的影響 根據(jù)Western b1ot檢測結(jié)果，作用BGC-823細胞24 h后，與對照組比較，華蟾素（0.156 mg/L和0.313 mg/L）可明顯下調(diào)BGC-823細胞中NF-κB p65、MMP-9蛋白表達（P＜0.05，P＜0.01）；與華蟾素 （0.156 mg/L）比較，華蟾素（0.313 mg/L）組NF-κB p65、MMP-9蛋白表達顯著降低 （P＜0.05），見表3。

表3 華蟾素對NF-κB p65和MM P-9表達的影響（n=3）Tab.3 E ffect of Cinobufacin on the expressions of NF-κB p65 and MMP-9 in BGC-823 cells（n=3）

4 討論

多項研究表明，華蟾素具有抑制胃癌細胞增殖、促進其凋亡作用［5-9］；本研究體外實驗也發(fā)現(xiàn)，華蟾素提取物可抑制胃癌BGC-823細胞的增殖，并且華蟾素的抑制效果具有濃度依賴性和時間依賴性。但華蟾素對胃癌轉(zhuǎn)移的影響尚未見報道；為此，在本研究中采用Transwe11小室進行細胞遷移、侵襲實驗，觀察胃癌對結(jié)胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響，并探討其作用機理。

腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程非常復(fù)雜，其關(guān)鍵是穿透生物學屏障［10］。目前研究發(fā)現(xiàn)細胞外基質(zhì) （Extrace11u1armatrixc，ECM）是惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要屏障，而基質(zhì)金屬蛋白酶家族 （MMPs）是通過阻斷ECM降解而切斷轉(zhuǎn)移通路的［11-12］；MMP-9是通過降解ECM中明膠和Ⅳ型基底膜膠原抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的［13］。本實驗中，華蟾素可明顯抑制BGC-823細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，并可明顯下調(diào)MMP-9蛋白在人胃癌BGC-823細胞中表達；表明華蟾素可能是通過抑制MMP-9在胃癌中的表達從而抑制胃癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

核因子-κB（NF-κB）通過調(diào)控MMP-9基因［14］，從而影響MMP-9蛋白的表達，達到抑制腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移［15］。P50和ReIA（P65）二異聚體是NF-κB的兩種主要存在形式，因此實驗中往往以P65來反映NF-κB的表達情況。研究表明［16］，百里醌等能通過抑制腫瘤細胞中NF-κB的表達從而有效抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。本實驗也發(fā)現(xiàn)華蟾素可抑制NF-κB p65在人胃癌BGC-823細胞中的表達，同時抑制BGC-823細胞的遷移和侵襲。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)華蟾素不但具有抑制人胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲作用，而且能抑制BGC-823細胞中NF-κB、調(diào)控MMP-9的表達。由此本課題將進一步研究華蟾素是否可能通過抑制NF-κB及其調(diào)控蛋白MMP-9的表達的機理，而達到抑制BGC-823細胞侵襲轉(zhuǎn)移的。

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Inhibitory effect of Cinobufacin on the invasion and m igration of hum an gastric carcinom a BCG-823 cells and itsmechanism in vitro

QIAO Cui-xia1， ZHANG Xin-feng2， CAIXiao-pin1*， CHENG Xu-feng3

（1.Tumor Department，Henan Academy of Traditional ChineseMedicine，Zhengzhou 450008，China；2.Integrated TCM&Western Medicine Department，Henan Provincial Cancer Hospital，Zhengzhou 450008，China；3.The First Hospital Affiliated to Henan TCM University，Zhengzhou 450008，China）

AIMTo investigate the anti-invasive effect of Cinobufacin on the human gastric carcinoma BCG-823 ce11s and its mechanism in vitro.M ETHODSBCG-823 ce11s were treated by 0.156 mg/L and 0.313 mg/LCinobufacin.Their inhibitory action wasmeasured by MTTassay.Themigration and invasive abi1ity of BCG-823 ce11sweremeasured by Transwe11assay.Western b1otana1ysiswas performed on NF-κB p56，MMP-9 in BCG-823 ce11s.RESULTSCinobufacin significant1y inhibited the growth，migration and invasive abi1ity of BCG-823 ce11s in a dose-dependentmanner.The expressions of NF-κB and MMP-9 were suppressed and the MMP-9/TIMP-1 ratio reduced after the treatment with Cinobufacin.CONCLUSIONSCinobufacin can inhibit themigration and invasion of BCG-823 ce11s probab1y by down-regu1ating the expression of NF-κB and MMP-9.

human gastric carcinoma BCG-823 ce11s；Cinobufacin；NF-κB；MMP-9；invasion；migration

R966

A

1001-1528（2015）08-1655-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.005

2014-10-12

河南省中醫(yī)藥管理局課題 （2013ZY02026）

喬翠霞 （1982—），女，博士，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治腫瘤的研究。Te1：13937160118，E-mai1：zhangxinfeng125@126.com

*通信作者：蔡小平（1964—），男，主任醫(yī)師，碩士生導師，主要從事中醫(yī)藥防治惡性腫瘤的研究。E-mai1：qiaocuixia@126.com