淡豆豉和黑豆乙醇提取物的促成骨細(xì)胞增殖活性及HPLC-MS分析

馮 薇， 孫佳明， 李 琛， 牛麗穎， 劉 姣， 張 凱， 王鑫國*

（1.河北中醫(yī)學(xué)院中藥藥理實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊050200；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，吉林長春130117）

淡豆豉和黑豆乙醇提取物的促成骨細(xì)胞增殖活性及HPLC-MS分析

馮 薇1， 孫佳明2， 李 琛1， 牛麗穎1， 劉 姣1， 張 凱1， 王鑫國1*

（1.河北中醫(yī)學(xué)院中藥藥理實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊050200；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，吉林長春130117）

目的比較分析淡豆豉和黑豆乙醇提取物促大鼠顱骨成骨細(xì)胞增殖活性及二者的化學(xué)成分。方法采用MTT法對淡豆豉和黑豆的乙醇提取物進(jìn)行促大鼠顱骨成骨細(xì)胞增殖活性的研究，并通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對二者化學(xué)成分進(jìn)行比較分析。結(jié)果淡豆豉和黑豆的乙醇提取物對大鼠成骨細(xì)胞的促增殖率分別可達(dá)到36.5%和28.2%，其主要有效成分為異黃酮類化合物，經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用分析共鑒定出15個黃酮類成分。結(jié)論黑豆發(fā)酵成淡豆豉后的成分變化主要體現(xiàn)在由苷類成分脫糖轉(zhuǎn)化為苷元，含有量顯著增加的大豆苷元和染料木素兩種苷元主要由丙二酰大豆苷 （大豆苷元-G-M）和丙二酰染料木苷 （染料木素-G-M）脫丙二酰基和葡萄糖轉(zhuǎn)化而來。

淡豆豉；黑豆；黃酮類成分；大鼠顱骨成骨細(xì)胞；液質(zhì)聯(lián)用

淡豆豉（Sojae Semen Praeparatum）是由豆科植物大豆［Glycinemax（L.）Merr.］的成熟種子和青蒿、桑葉等中藥經(jīng)發(fā)酵加工而成的制品，是我國特有的經(jīng)固態(tài)發(fā)酵制備的中藥之一，具有解表除煩，宣發(fā)郁熱等功效［1］。作為發(fā)酵淡豆豉的主要原料，黑豆（Sojae Semen Nigrum）［2］也是一味應(yīng)用廣泛的藥食兩用中藥，其性味甘平，可益精明目，養(yǎng)血祛風(fēng)，用于陰虛煩渴，手足麻木等癥［1］324。發(fā)酵炮制過程使黑豆和淡豆豉具備了不同的藥性藥效。

課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，淡豆豉能夠糾正骨質(zhì)疏松大鼠骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)的異常，改善骨微細(xì)結(jié)構(gòu)及骨生物力學(xué)性能，提高骨質(zhì)量［3-4］，但未對淡豆豉和原料黑豆的促成骨細(xì)胞增殖活性及其化學(xué)成分進(jìn)行深入分析研究。為進(jìn)一步研究淡豆豉乙醇提取物改善骨質(zhì)疏松的物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究以黑豆及其發(fā)酵制備的淡豆豉乙醇提取物為研究對象，以體外大鼠成骨細(xì)胞增殖率為指標(biāo)，研究其體外促成骨細(xì)胞增殖活性。再應(yīng)用HPLC-DAD-ESI-MS/MS比較分析淡豆豉和原料黑豆乙醇提取物成分，明確發(fā)酵后藥性變化的物質(zhì)基礎(chǔ)以及淡豆豉和黑豆乙醇提取物促成骨細(xì)胞增殖的活性成分。

1 材料

1.1 材料 淡豆豉為實(shí)驗(yàn)室參照文獻(xiàn)［2］發(fā)酵制備，原料黑豆、青蒿和桑葉等均購于河北安國。

1.2 動物 出生24 h以內(nèi)SD大鼠，購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK（冀）2008-1-003，合格證號1112001。

1.3 試劑與儀器 Agi1ent 1100 series LC-MSD液質(zhì)聯(lián)用儀，包括Agi1ent SL型多級離子阱質(zhì)譜儀、低壓四元梯度泵、二極管陣列檢測器（DAD）、自動進(jìn)樣、柱溫箱、Chemistation化學(xué)工作站等；BP211D型十萬分之一電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；KHB ST-360酶標(biāo)分析儀（上海科華生物工程股份有限公司）；MCO-15AC CO2培養(yǎng)箱（日本三洋）；Motic AE倒置顯微鏡（麥克奧迪）；96微孔板，培養(yǎng)瓶，各型號移液槍及槍頭等。染料木苷對照品 （中國食品藥品檢定研究院，批號111709-200501，純度≥98%）、大豆苷對照品 （中國食品藥品檢定研究院，批號111738-200501，純度≥98%）、染料木素對照品 （中國食品藥品檢定研究院，批號111704-200501，純度≥98%）、大豆苷元對照品 （成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST-10110301，純度≥98%）、黃豆黃素對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST-10092501，純度≥98%）、黃豆黃苷對照品 （中國食品藥品檢定研究院，批號111756-200501，純度≥98%）。低糖DMEM（Gibco）；胎牛血清（Hyc1one）；胰蛋白酶；MTT（Am resco）；膠原酶Ⅱ（Invitrogen）；其余試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 淡豆豉和黑豆提取物的制備 取實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵制備的淡豆豉樣品，粉碎 （過20目篩），取粗粉500 g，先用石油醚浸泡后滲濾提取至提取液顏色淺，回收石油醚，殘?jiān)鼡]去石油醚，用70%乙醇浸泡滲濾提取至顏色淺，合并提取液，減壓蒸干，即為淡豆豉乙醇提取物。取發(fā)酵制備淡豆豉的同批原料黑豆，依同法制備，即得黑豆乙醇提取物。

2.2 淡豆豉和黑豆乙醇提取物促成骨細(xì)胞增殖活性的測定

2.2.1 大鼠成骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 參照文獻(xiàn)［5］，采用改良組織塊法分離培養(yǎng)新生SD大鼠顱骨成骨細(xì)胞。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液 （青霉素1×105U/L、鏈霉素1×105U/L，pH 7.2～7.4）進(jìn)行傳代，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞傳至第5代，通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及堿性磷酸酶染色鑒定，5～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 成骨細(xì)胞增殖能力測定（MTT） 實(shí)驗(yàn)分為空白對照組及6個不同濃度提取物組。細(xì)胞傳至第5代，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107/L，接種至96孔培養(yǎng)板，藥物干預(yù)，于72 h吸除培養(yǎng)液，每孔加入100μL無血清DMEM培養(yǎng)液，20μL MTT（5 g/L），繼續(xù)孵育4 h，吸棄培養(yǎng)基上清，每孔加入150μL DMSO，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在492 nm處檢測OD值。細(xì)胞增殖率計(jì)算公式如下。

細(xì)胞增殖率=［（干預(yù)組OD值-對照組OD值）/對照組OD值］×100%

與空白對照組相比，淡豆豉提取物在質(zhì)量濃度為1×10-8～1×10-3g/L時處理72 h，均顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖 （P＜0.01或P＜0.05）；黑豆提取物在質(zhì)量濃度為1×10-8g/L時處理72 h，與空白對照組細(xì)胞增殖情況無顯著性差異 （P＞0.05），其他質(zhì)量濃度顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖 （P＜0.01）（見表1）。

表1 不同質(zhì)量濃度淡豆豉和黑豆乙醇提取物對大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響 （，n=6）Tab.1 Effects of different concentrations of ethanolic extracts of black and ferm ented soybean on the proliferation of rat osteoblasts（，n=6）

表1 不同質(zhì)量濃度淡豆豉和黑豆乙醇提取物對大鼠成骨細(xì)胞增殖的影響 （，n=6）Tab.1 Effects of different concentrations of ethanolic extracts of black and ferm ented soybean on the proliferation of rat osteoblasts（，n=6）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

0.300±0.010 0.300±0.010 1×10-8g/L 0.318±0.011* 0.317±0.010 1×10-7g/L 0.330±0.010** 0.332±0.009**1×10-6g/L 0.375±0.013** 0.354±0.016**1×10-5g/L 0.394±0.021** 0.385±0.016**1×10-4g/L 0.409±0.015** 0.383±0.018**1×10-3g/L 0.394±0.009** 0.375±0.020淡豆豉 黑豆空白對照組組別 OD值**

實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （見圖1～2）表明，黑豆和淡豆豉乙醇提取物具有較明顯的促成骨細(xì)胞增殖作用，且其會隨著提取物質(zhì)量濃度的增大而增大，當(dāng)達(dá)到一定質(zhì)量濃度時，樣品對成骨細(xì)胞的增殖作用有所下降，其中以淡豆豉乙醇提取物促增殖效果最為明顯，當(dāng)提取物為1×10-4g/L時效果最佳，增殖率達(dá)36.5%。在同等質(zhì)量濃度下，淡豆豉乙醇提取物對成骨細(xì)胞促增殖作用略高于黑豆，黑豆則在1 ×10-5g/L時增殖率可達(dá)到28.2%。

圖1 黑豆乙醇提取物對成骨細(xì)胞促增殖作用Fig.1 Proliferation of ethanolic extract from black soybean

2.3 淡豆豉和黑豆乙醇提取物成分分析

2.3.1 HPLC-MS實(shí)驗(yàn)條件 Agi1ent Ec1ipse P1us-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；流動相為乙腈-0.5%甲酸水溶液，二元線性梯度洗脫，流動相梯度為0～10 min，13%A，87%B；10～40 min，25%A，75%B；40～55 min，30%A，70% B；55～80 min，80%A，20%B；體積流量0.6 mL/min；檢測波長261 nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量30μL；電離源為電噴霧離子源 （ESI）；正離子方式檢測；掃描范圍為m/z50～1 400；干燥氣溫度350℃；干燥氣體積流量9.0 L/min；霧化氣壓強(qiáng)為0.24 MPa（35.0 psi）；毛細(xì)管電壓4 kV。

圖2 淡豆豉乙醇提取物對成骨細(xì)胞促增殖作用Fig.2 Proliferation of ethanolic extract from fermented soybean

2.3.2 乙醇提取物成分分析 取 “2.1”項(xiàng)中淡豆豉和黑豆乙醇提取物各0.5 mg，分別溶解于10.0 m L甲醇，過0.45μm微孔濾膜，經(jīng)HPLCESI-MS/MS分析，得質(zhì)譜總離子流圖（見圖3）。

圖3 淡豆豉提取物的總離子流圖 （A）和液相色譜圖（B）；黑豆乙醇提取物的總離子流圖 （C）和液相色譜圖 （D）Fig.3 Total ion chromatogram s and HPLC chromatograms of fermented soybean（A and B）and black soybean extract（C and D）

依據(jù)各色譜峰的分子離子峰及主要碎片峰的解析，與文獻(xiàn)［6-8］和對照品對比，確定了淡豆豉和黑豆乙醇提取物中15個黃酮類成分，其中化合物1、4首次在淡豆豉中發(fā)現(xiàn)，結(jié)果見表2。

3 討論

淡豆豉乙醇提取物的促成骨細(xì)胞增殖率較黑豆乙醇提取物有一定程度的提高，二者在一定質(zhì)量濃度范圍隨劑量增加表現(xiàn)出對大鼠顱骨成骨細(xì)胞的促生殖作用增強(qiáng)，達(dá)到一定質(zhì)量濃度后，增殖率有所下降。從液質(zhì)成分分析結(jié)果 （見表3）可以看出，黑豆發(fā)酵為淡豆豉后成分變化主要體現(xiàn)在由苷類成分脫糖轉(zhuǎn)化為苷元，提示異黃酮苷元的促成骨細(xì)胞增殖活性可能強(qiáng)于苷。

表2 淡豆豉和黑豆提取物的LC-MS/MS分析Tab.2 LC-MS/MS analysis of the extract from fermented soybean and black soybean

對黑豆和淡豆豉提取物中峰面積大于色譜峰總峰面積10%的主要成分峰面積進(jìn)行分析 （見表3），淡豆豉提取物中含有量較高的成分分別為大豆苷元、染料木素2種異黃酮苷元及其及苷類成分，由此可見其主要有效成分為異黃酮類化合物。4種含有量較高的苷中，大豆苷和染料木苷發(fā)酵后峰面積變化不大，稍有降低趨勢，而丙二酰大豆苷（大豆苷元-G-M）和丙二酰染料木苷 （染料木素-G-M）均在發(fā)酵后色譜峰面積減少為發(fā)酵前的1/40左右，相應(yīng)的兩種苷元大豆苷元和染料木素均在發(fā)酵后色譜峰面積增加為發(fā)酵前的30倍左右 （見表3）。因此含有量顯著增加的大豆苷元和染料木素兩種苷元主要由丙二酰大豆苷 （大豆苷元-G-M）和丙二酰染料木苷 （染料木素-G-M）脫丙二酰基和葡萄糖轉(zhuǎn)化而來。

表3 黑豆和淡豆豉提取物中色譜峰峰面積Tab.3 Peak areas of black and fermented soybean extracts

化合物1、4在黑豆中未檢出，可能由丙二酰黃豆黃苷 （黃豆黃素-G-M）、丙二酰染料木苷 （染料木素-G-M）或乙酰染料木苷（染料木素-G-A）發(fā)酵過程中脫丙二?；蛞阴；玫?。化合物5、7、11在淡豆豉中未檢出，可能由于3個化合物在黑豆中含有量不高，發(fā)酵過程使其脫掉一定基團(tuán)而使含有量進(jìn)一步降低而未檢出。

準(zhǔn)分子離子 ［M+H］+碰撞裂解時丟失所含糖基和其他配基 （乙?；虮；┑乃槠约败赵獪?zhǔn)分子離子都具有較高豐度，可獲得被測黃酮苷的相對分子質(zhì)量、苷元、配糖基等化學(xué)結(jié)構(gòu)信息。但是分析結(jié)果中存在4對同分異構(gòu)體，1號與6號、3號與4號可以借助染料木苷和黃豆黃苷對照品進(jìn)行區(qū)分。5號與8號、9號與11號化合物不能區(qū)分，區(qū)分黃酮苷同分異構(gòu)體還需要借助相應(yīng)對照品或色譜分離工作。

在淡豆豉成分分析中并未檢出青蒿和桑葉中的相應(yīng)成分，可能由于傳統(tǒng)的淡豆豉自然發(fā)酵工藝中，作為輔料的青蒿和桑葉用量少 （黑豆 ∶青蒿∶桑葉=10∶1∶1）。同時，在黑豆吸脹過程中能滲入黑豆種皮的青蒿桑葉成分極為有限，大部分輔料水煎提取物及藥渣在二次發(fā)酵前的凈制工序中被洗凈除去［1］。因此我們認(rèn)為青蒿桑葉轉(zhuǎn)移入淡豆豉中的成分較少，導(dǎo)致淡豆豉中相關(guān)輔料成分含量過低未能檢出。

目前國內(nèi)外對治療骨質(zhì)疏松植物藥的研究發(fā)現(xiàn)，異黃酮類成分能夠通過不同的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)成骨細(xì)胞生成，抑制破骨細(xì)胞分化，從而減少骨質(zhì)丟失，提高骨密度。其中染料木素可有效改善疏松骨質(zhì)的骨密度，阻止甲狀旁腺誘導(dǎo)的骨吸收。而大豆苷元對于松骨質(zhì)和密骨質(zhì)的骨密度提高均有作用［9-12］。本研究顯示淡豆豉和黑豆中的異黃酮類成分是促成骨細(xì)胞增殖活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，黑豆、淡豆豉化學(xué)成分含有量存在差異可能是其功效差異的主要原因，淡豆豉和黑豆的成分與活性上的差異也為闡釋淡豆豉的發(fā)酵機(jī)制和進(jìn)一步研究兩者的藥效差異提供參考。

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Proliferative activity of ethanolic extract from black and fermented soybean on rat osteoblasts and HPLC-MS analysis

FENGWei1， SUN Jia-ming2， LIChen1， NIU Li-ying1， LIU Jiao1， ZHANG Kai1，WANG Xin-guo1*

（1.Pharmacology Laboratory of Chinese Medicine，Hebei University of Chinese Medicine，Shijiazhuang 050200，China；2.Development Center of Traditional Chinese Medicine and Bioengineering，Changchun University of ChineseMedicine，Changchun 130117，China）

AIMTo investigate the pro1iferative activity of ethano1ic extract from b1ack soybean（Sojae Semen Nigrum）and fermented soybean（Sojae Semen Praeparatum）on rat osteob1asts and HPLC-DAD-ESI-MS/MS ana1ysis.METHODSThe pro1iferation test was performed by using rat osteob1asts with MTT assays in vitro. Qua1itative ana1ysiswas performed by HPLC-DAD-MS to ana1yze and comparemajor active components in both a1-coho1ic extracts.RESULTSEthano1ic extracts of b1ack and fermented soybean were demonstrated to show pro1iferative activity.Fifteen f1avonoids were tentative1y characterized based on UV and mass spectra1 ana1ysis.CONCLUSIONThe experimenta1data show thatwhen b1ack soybean ferments into fermented soybean，heterosides un-dergoes the desugarization and converts into ag1ycon，which increases the contents of daidein and genistein by means of the dema1ony and deg1ucose ofma1ony1daidzin and ma1ony1genistin.

fermented soybean（Semen Sojae Praeparatum）；b1ack soybean（Sojae Semen Nigrum）；f1avonoid；rat osteob1asts；HPLC-MS

R285.5

A

1001-1528（2015）08-1651-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.004

2014-11-25

河北省自然基金面上項(xiàng)目 （H2012206019，H2014206302）；河北省教育廳青年基金 （2011178）

馮 薇 （1982—），女，博士，講師，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)研究。Te1：（0311）85216828，E-mai1：rainbow10571@ 126.com

*通信作者：王鑫國，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量評價(jià)與新藥開發(fā)。Te1：（0311）89926208，E-mai1：wangxinguozy@ 126.com