降逆護膜湯對DCA誘導食管黏膜上皮細胞凋亡中p38MARK信號通路的影響

黃啟婷，董 筠

(南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，南京210029)

胃食管反流病(GERD)是指因食管胃連接處防反流機制障礙而導致胃或腸內(nèi)容物反流入食管，從而引起食管炎癥的疾?。?］。近幾年研究［2-3］發(fā)現(xiàn)，膽鹽被認為是胃食管反流病中造成食管損害的主要物質(zhì)之一，脫氧膽酸(Deoxycholic acid，DCA)作為膽汁的重要成分，長時間的作用可引起凋亡改變。p38MAPK是細胞內(nèi)重要的信號轉導分子，調(diào)控多種基因的表達，參與細胞的增殖、分化、凋亡以及介導炎癥、應激等多種生理、病理過程［4］。本課題組前期研究［5-6］發(fā)現(xiàn)，降逆護膜湯對胃食管反流病有良好的防治作用。本研究旨在探討降逆護膜湯治療胃食管反流病的機制。

1 實驗材料

1.1 實驗藥物 降逆護膜湯(黃連3 g，吳茱萸2 g，黨參10 g，旋覆花5 g，赭石20 g，黃芩6 g，烏賊骨20 g，大貝母 10 g，仙鶴草 15 g，白及6 g，炒枳殼 10 g，厚樸10 g)共117 g，用1170 mL蒸餾水加熱回流提取2次，每次60 min，合并提取的藥液，用三蒸水稀釋成濃度為100 mg/mL，滅菌備用。

1.2 試劑與設備 RPMI-1640培養(yǎng)液(凱基生物);胎牛血清(杭州四季青);胰蛋白酶(Gibco公司);SB203580(selleck公司);脫氧膽酸(DCA)(sigma公司);鼠抗人β-actin單抗(sigma公司);兔抗人P38單抗(Cell Signalin g公司);兔抗人p-P38單抗(Cell Signaling公司);兔抗人 Bax單抗(Cell Signaling公司);鼠抗人Bcl-2單抗(santa cruz公司);山羊抗鼠多克隆抗體(北京中杉生物技術公司)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) 人正常食管黏膜上皮細胞HEEC(購自上海雷蒂生物科技發(fā)展有限公司)。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、完全飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞實驗。

2.2 MTT法測定細胞生存率 觀察DCA誘導HEEC凋亡的變化以及降逆護膜湯對其的影響。實驗分為:空白對照組，DCA組，降逆護膜湯1－5組(5個濃度梯度 2、4、6、8、10 g/L)。以每孔 200 μL 含 1萬個細胞的細胞懸液接種于96孔板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，貼壁后降逆護膜各組同時加入不同濃度的水提液培養(yǎng)24 h，其余2組不予特殊處理。DCA組和降逆護膜湯組加入濃度為500 μmol/L的 DCA處理24 h。根據(jù)MTT常規(guī)方法操作，通過酶標儀測波長490 nm下的吸光度值。

2.3 Western Blot法測定相關蛋白的表達 以50萬個細胞的細胞懸液接種于大皿上，細胞培養(yǎng)及給藥同上，中藥分為小劑量組，中劑量組，大劑量組，濃度分別為4，6，8 g/L進行試驗。新增 SB203580組，于DCA處理前加入10 μmol/L的SB203580預處理1 h，其余步驟同前。DCA處理24 h后棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，加含磷酸化蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，冰上裂解15 min，用細胞刮刮下細胞，4℃下12 000 r/min，離心15 min，取離心后的上清，采用考馬斯亮藍法進行蛋白定量。取20 μg蛋白上樣到12%SDS-PAGE凝膠，電泳。將凝膠上的蛋白電轉移至PVDF膜，用5%BSA封閉1 h，將一抗用5%BSA稀釋(兔抗人P38單抗1∶1 000，兔抗人 p-P38單抗，1∶1 000，鼠抗人β-actin單抗，1∶16 000，兔抗人Bax單抗，1∶1 000，鼠抗人Bcl-2單抗1∶500)，將膜與一抗置于封閉的塑料袋中，4℃冰箱孵化過夜。取出PVDF膜，PBST洗3次，加入1∶2 000配制的二抗(山羊抗鼠多克隆抗體，山羊抗兔多克隆抗體)，室溫搖床上孵化1 h，PBST洗膜3次，配制BeyoECL Plus工作液(A液和B液等比例混合)，使工作液充分覆蓋膜上，放置1～2 min，在X線膠片上曝光、顯影、定影、拍照。

3 結果

3.1 降逆護膜湯對細胞生存率的影響 見表1。

表1 MTT檢測DCA與降逆護膜湯對HEEC生存率的影響(±s，n=3)

表1 MTT檢測DCA與降逆護膜湯對HEEC生存率的影響(±s，n=3)

注:與DCA組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

均值空白組 0 1.088±0.033組 別 劑量/(g/L)OD##DCA組 0 0.769±0.082降逆護膜湯1組 2 0.773±0.111降逆護膜湯2組 4 0.880±0.046#降逆護膜湯3組 6 0.945±0.074##降逆護膜湯4組 8 1.018±0.065##降逆護膜湯5組 10 1.107±0.064##

3.2 降逆護膜湯對P38(40KD)和p-P38(43KD)表達的影響 蛋白表達量檢測結果顯示，DCA組p-P38表達量明顯高于空白對照組(P＜0.05)，而通道抑制劑SB203580組則與空白對照組無明顯差異，結果提示，降逆護膜湯能明顯抑制P38的磷酸化，并且隨著濃度增加，抑制效果越明顯(見圖1)。

3.3 降逆護膜湯對Bax(20KD)和Bcl-2(26KD)表達的影響 蛋白表達量檢測結果顯示，細胞內(nèi)Bcl-2/Bax表達量比值，與空白組比較，DCA組明顯減小(P＜0.05)，表明500 μmol/L的DCA可促使細胞表達凋亡蛋白。通道抑制劑SB203580組無明顯差異，表明阻斷p38MARK通路可有效阻斷DCA誘導凋亡。同時，降逆護膜湯3個濃度組中Bcl-2/Bax比值均現(xiàn)升高趨勢，呈濃度依賴性。與DCA組比較，降逆護膜湯4組(8 g/L)明顯升高(P＜0.05)。由此提示降逆護膜湯能促進凋亡蛋白Bcl-2表達，抑制促凋亡蛋白Bax表達，進而抑制DCA引起的細胞凋亡(見圖2)。

圖1 各組食管上皮細胞中P38和p-P38的蛋白表達情況

圖2 各組食管上皮細胞中Bax和Bcl-2的蛋白表達情況

4 討論

降逆護膜湯是董筠老師對于胃食管反流病證屬肝胃郁熱者所擬定的經(jīng)驗方，具有修復食管破損黏膜，預防Barrett食管、食管腺癌的發(fā)生，有效緩解癥狀，提高患者生活質(zhì)量等作用［7］。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，膽鹽在反流性食管病中造成食管損害不可忽視。膽鹽能不同程度的引起培養(yǎng)的食管上皮細胞凋亡［8］。膽酸短時間刺激可產(chǎn)生增殖效應，而長時間作用可引起凋亡改變，DCA較其他膽酸對細胞的毒性作用更大［3］。細胞凋亡是胃腸道黏膜細胞丟失的重要途徑，胃腸道黏膜細胞凋亡異常導致了胃腸道疾病的發(fā)生與發(fā)展［9］。p38MARK是一條重要的信號通路，是一組細胞內(nèi)信號轉導分子，在炎癥、細胞生長、凋亡等過程中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用，能被多種細胞外的刺激因素激活。p38MARK通過TGY位點中蘇氨酸和絡氨酸的磷酸化而活化，活化的p38MARK進一步活化下游的蛋白激酶和轉錄因子，調(diào)控多種基因的表達［10］。韋金英等［11］研究發(fā)現(xiàn)，用SB203580阻斷p38MARK通路能夠抑制細胞凋亡和提高Bcl-2/Bax的比例。

本實驗研究結果顯示，用p38MARK特異性抑制劑SB203580阻斷信號通路可明顯抑制DCA引起的凋亡相關蛋白的表達，說明p38MARK是DCA誘導凋亡的機制之一。

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