消渴安糖方對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠NO、ET的影響

姜俊玲，林壽寧，劉 鵬，張振鋒

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011）

糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿?。―M）最常見慢性并發(fā)癥之一，導(dǎo)致患者致殘率高、致死率高，但其發(fā)病機制較為復(fù)雜，中醫(yī)藥治療DPN具有明顯的優(yōu)勢?，F(xiàn)代研究顯示［1］：代謝異常及血管內(nèi)皮損害對糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生具有重要作用，內(nèi)皮素（endothelin，ET）與 一氧化氮（nitrogen monoxide，NO）參與了 DPN的發(fā)生發(fā)展。本研究通過實驗觀察消渴安糖方對DPN大鼠ET、NO的影響，探討ET、NO在DPN發(fā)生發(fā)展過程中的意義，同時探討消渴安糖方防治DPN的機制，為治療提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 藥物 消渴安糖方由黃芪、黨參、枸杞、山茱萸、黃連、沙參、牡丹皮、當歸、桃仁、紅花等藥物配伍組成，運用現(xiàn)代工藝加工研制成免煎顆粒劑。

1.2 動物 健康清潔級Wistar大鼠，雄性，體重214～300 g，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供（許可證號：桂醫(yī)動字11003號）。

2 實驗方法

2.1 造模方法 大鼠喂養(yǎng)高糖高脂飼料配方［2］（組成：10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇、1.0%膽酸鹽、66.5%常規(guī)飼料，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)動物實驗中心按要求制備）4周，禁食12 h后，將鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）用 0.1 mol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液（pH4.4、4℃）避光條件下配成1%濃度溶液，按40 mg/kg劑量單次注射于大鼠左下腹腔內(nèi)。72 h后尾靜脈取血，用血糖儀測量血糖，血糖≥16.7 mmol/L者確定為DM模型大鼠［3-4］。空白對照組進行左下腹腔注射等量的檸檬酸緩沖液（假造模），并在假造模后2周、4周測定血糖，以排除DM。DM造模成功后繼續(xù)予高糖高脂飼養(yǎng)4周，制成DPN模型。

2.2 分組及給藥 造模成功后，將50只DM大鼠隨機分為5組，分別為：正常組、模型組、消渴安糖方預(yù)防組（預(yù)防組）、消渴安糖方治療組（治療組）、維生素E組（VitE組），每組動物各10只。預(yù)防組大鼠于造成DM模型后立即給予藥物進行干預(yù)治療；治療組及VitE組大鼠造成DPN模型后，開始給藥。預(yù)防組及治療組灌服消渴安糖方顆粒，根據(jù)《中藥藥理實驗方法學(xué)》［5］中人與大鼠體表面積換算方法（相當于60 kg成人劑量的3倍）換算消渴安糖方給藥劑量為5 g/（kg·d），VitE組灌服VitE，給藥劑量為40 mg/（kg·d）。模型組、正常組給予相同體積純凈水灌胃。各組動物連續(xù)給藥6周后，麻醉、采血及取組織，測定各項指標。

2.3 指標檢測與方法

2.3.1 血液制備 將大鼠用0.7%戊巴比妥鈉溶液麻醉，心臟采血，3 000r/min離心10 min，分離血清，置4℃低溫冰箱保存待用，測定NO水平。另取2 ml血液注入含7.5%EDTA二鈉30 μl和抑肽酶 40 μl的試管中，混勻，4 ℃下 3 000 r/min 離心10 min，分離血漿于-20℃保存，測定前將樣本置于室溫復(fù)融，再次于4℃下3 000 r/min離心5 min，取上清測定ET水平。血清NO（南京聚力生物醫(yī)學(xué)工程研究所提供）用硝酸還原酶法測定。ET（北京科美東雅生物技術(shù)有限公司提供）用放射免疫法測定。

2.3.2 組織制備 取出腓腸肌組織，吸去血跡，稱重，盡快放入0.2 mol/L HAC 1 ml略做碾磨，然后在100℃水浴中煮沸10 min，勻漿。4℃下3 000 r/min離心15 min，取上清-20℃保存，測定時用5倍以上PBS稀釋，以調(diào)節(jié)pH值。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（AVOVA）和兩兩比較（LSD）法。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠血清NO水平比較 模型組和各用藥組的血清NO水平明顯低于正常組（P<0.01）；經(jīng)治療后，預(yù)防組與治療組的血清NO水平顯著高于模型組（P<0.01）；預(yù)防組與治療組的血清NO水平比較，差異顯著（P<0.01），由此可見，消渴安糖方可提高血清NO水平，且預(yù)防性給藥療效優(yōu)于治療性給藥。見表1。

表1 各組大鼠血清NO水平比較 （μmol/L，±s）

表1 各組大鼠血清NO水平比較 （μmol/L，±s）

注：與正常組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01；與治療組比較，③P<0.01

組 別 n 血清NO正常組 10 100.13±1.30模型組 10 74.13±5.79①預(yù)防組 10 97.44±8.29①②③治療組 10 85.44±6.71①②VitE 組 10 76.83±5.03①

3.2 各組大鼠血漿、肌肉組織ET水平比較 與正常組相比，模型組血漿及肌肉組織的ET水平明顯升高（P<0.01），但經(jīng)過治療后，預(yù)防組與治療組ET水平比模型組明顯降低（P<0.01），且預(yù)防組的ET水平與治療組比較，差異顯著（P<0.05）。說明消渴安糖方可降低血漿及組織的ET水平，且預(yù)防性給藥療效優(yōu)于治療性給藥。見表2。

表2 各組大鼠血漿、肌肉組織ET水平比較（pg/ml，±s）

表2 各組大鼠血漿、肌肉組織ET水平比較（pg/ml，±s）

注：與正常組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01；與治療組比較，③P<0.05

組 別 n 血漿ET 肌肉組織ET正常組 10 16.39±2.39 34.08±3.75模型組 10 35.32±4.11① 73.82±8.96①預(yù)防組 10 23.57±3.95①②③ 42.59±6.11①②③治療組 10 27.52±5.14①② 48.89±5.01①②VitE 組 10 31.51±3.73① 61.81±7.51①

4 討 論

DPN發(fā)生率高，危害性大，發(fā)病機制復(fù)雜。眾多研究認為DPN的發(fā)生是多種因素共同作用的結(jié)果，且大量臨床和實驗研究顯示血管損害對DPN的發(fā)生具有重要作用。

ET和NO是血管內(nèi)皮細胞合成和釋放的血管活性物質(zhì)。ET是目前為止發(fā)現(xiàn)的最強的內(nèi)源性縮血管物質(zhì)，在微循環(huán)障礙、組織缺氧等條件下，血管內(nèi)皮細胞受損，導(dǎo)致ET釋放增加；NO可通過血管內(nèi)皮細胞釋放血管舒張因子，使血管平滑肌松弛和血管舒張［6-7］。糖尿病時血管內(nèi)皮損傷，ET、NO二者失衡引起血管內(nèi)皮功能障礙，并最終導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生［8-9］。

中醫(yī)認為DPN屬中醫(yī)“痹證”范疇，是在消渴病氣陰兩虛基本病機的基礎(chǔ)上出現(xiàn)的本虛標實之證。病機關(guān)鍵為氣陰兩虛瘀血阻絡(luò)，以本虛標實、夾痰夾瘀為特點。血瘀在DPN的發(fā)生、發(fā)展中所起的關(guān)鍵作用已被眾多醫(yī)家認可［10］?，F(xiàn)代研究表明，活血化瘀類中藥能改善血液高凝狀態(tài)和微循環(huán)，提高神經(jīng)細胞血氧供應(yīng)，可有效改善DNP臨床癥狀［11-12］。消渴安糖方是我院林壽寧教授在繼承全國名老中醫(yī)林沛湘教授治療消渴經(jīng)驗方的基礎(chǔ)上研制而成。該方具有益氣養(yǎng)陰、活血化瘀之功效，基本上由兩組藥組成：一是補益藥，方中黃芪性甘溫，能益氣補虛損，以助活血之品，使氣旺血行，祛瘀而不傷正，助諸藥周行全身，使血行四肢，瘀通榮至，諸癥得解；黨參、沙參益氣健脾生津，與黃芪共為君藥，共奏健脾益氣之功。枸杞補益肝腎，平而不熱，既可添精益髓、健骨強筋，又善止消渴，加強君藥的效力；山茱萸平補肝腎，既補肝腎之陰，又能溫補腎陽，助君藥以達陰陽并補之功，兩藥用以為臣，此為治本之法。二是活血化瘀藥，方中牡丹皮、桃仁、當歸、紅花活血化瘀，用以為佐，體現(xiàn)了治標之法。諸藥合用，攻補兼施，標本兼治，謹守病機，既能恢復(fù)脾胃的運化功能，又可改善氣血瘀滯狀態(tài)。本課題組既往研究提示消渴安糖方聯(lián)合胰島素治療不僅可以降血糖、改善糖尿病患者臨床癥狀［13］，還具有改善微循環(huán)、保護內(nèi)皮的功能［14］。

本實驗研究結(jié)果表明：糖尿病大鼠血清NO含量較正常組明顯下降，而ET則明顯升高，導(dǎo)致兩者間動態(tài)失衡，而體現(xiàn)在營養(yǎng)周圍神經(jīng)的微血管上，可致神經(jīng)內(nèi)膜低氧或缺氧，造成神經(jīng)纖維軸索髓鞘變性。實驗結(jié)果顯示模型組ET水平高于預(yù)防組和治療組，進一步證實了ET在DPN中的作用。本研究還顯示ET水平和NO水平呈負相關(guān)，兩者之間存在著反饋性調(diào)節(jié)作用。消渴安糖方可有效調(diào)節(jié)DPN大鼠的ET、NO間的動態(tài)平衡，從而有效保護血管內(nèi)皮細胞、改善內(nèi)皮細胞的功能，對DPN的發(fā)生、發(fā)展起到預(yù)防和延緩作用。同時也提示消渴安糖方的作用是多途徑、多靶點、多環(huán)節(jié)的，為消渴安糖方臨床治療DPN提供了藥理學(xué)理論依據(jù)。

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