一株多氯聯(lián)苯降解菌的分離鑒定及其生長條件優(yōu)化

羅筱梟， 彭書傳， 王 進(jìn)， 方 麗， 岳正波， 吳 克

（1.合肥工業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.合肥學(xué)院 應(yīng)用酶學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230022）

一株多氯聯(lián)苯降解菌的分離鑒定及其生長條件優(yōu)化

羅筱梟1， 彭書傳1， 王 進(jìn)1， 方 麗1， 岳正波1， 吳 克2

（1.合肥工業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.合肥學(xué)院 應(yīng)用酶學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230022）

文章從垃圾滲濾液中分離得到一株具有降解多氯聯(lián)苯能力的菌株，對其進(jìn)行16s r DNA序列分析，確定為枯草桿菌（Bacillus subtilis），編號(hào)為WF1。實(shí)驗(yàn)考查了該菌的生長和降解特性，分別研究p H值、溫度、裝液量等因素對菌株降解能力的影響；并通過正交試驗(yàn)對其生長條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明菌株適宜生長條件與降解條件基本一致。其中p H值為最主要影響因素，溫度和搖床轉(zhuǎn)速為次要因素，裝液量為不重要因素。p H值7.0、溫度35℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r／min為菌株的適宜生長條件。

多氯聯(lián)苯；枯草桿菌WF1；正交試驗(yàn)

多氯聯(lián)苯（polychlorinated biphenyls，PCBs）作為電容器和變壓器內(nèi)的絕緣介質(zhì)、潤滑劑、增塑劑、殺蟲劑、黏合劑、復(fù)寫紙、有機(jī)稀釋劑以及阻燃劑等［1］的主要成分，由于其持久性、生物蓄積性、遠(yuǎn)距離遷移性和高毒性，對人類的生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)產(chǎn)生巨大的危害。國家規(guī)定對含多氯聯(lián)苯廢物要進(jìn)行單獨(dú)處理處置，但目前由于垃圾分類沒有很好地實(shí)施，導(dǎo)致只針對含有害多氯聯(lián)苯廢物的電容器、變壓器等進(jìn)行了單獨(dú)封存或焚燒，而一部分含多氯聯(lián)苯廢棄物與普通垃圾混合堆放在垃圾填埋場。因此，廢棄物中的PCBs成分直接經(jīng)過雨水的沖刷或者間接通過降塵等進(jìn)入到垃圾滲濾液中［2－5］。目前關(guān)于PCBs的處理方式主要有封存填埋、催化降解、高溫焚燒、熱處理和微生物降解等［6－8］。其中封存法使封存點(diǎn)的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)逐年增加，填埋法只適用于處置含量少的PCBs的固體廢棄物，也存在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，且目前被封存的PCBs大部分都已到期，對封存點(diǎn)的土壤和地下水造成污染隱患［9］。高溫焚燒法分解效率高但設(shè)備昂貴，操作管理過程存在困難，另外灰燼中含有未分解的PCBs，容易造成二次污染，當(dāng)處理溫度過低時(shí)，二惡英生成的危險(xiǎn)性也隨之增加。相比較而言，微生物降解法具有廉價(jià)、無二次污染和原位修復(fù)等特點(diǎn)，因此最具潛力［10］。

對多氯聯(lián)苯的好氧微生物降解的研究一直是多氯聯(lián)苯污染環(huán)境生物修復(fù)的熱點(diǎn)問題。到目前為止，已經(jīng)有幾十種好氧降解菌株從PCBs污染源中被篩選出來，大多數(shù)為革蘭氏陰性菌［11－13］，如Sphingomonas、Burkhoderia、Pesudomonas、Comamonas等。但是，由于垃圾滲濾液成分極其復(fù)雜，直接從垃圾滲濾液中分離純化得到多氯聯(lián)苯降解菌的報(bào)道較少，因此，本文利用聯(lián)苯為底物馴化其降解PCBs的能力，采用富集分離的培養(yǎng)方式從垃圾滲濾液中獲得一株能以PCBs為唯一碳源生長的菌株，并對其生長和降解特性進(jìn)行了初步分析，以期為其在生物修復(fù)中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 微生物的來源與培養(yǎng)基

微生物的來源為合肥龍泉山垃圾填埋場垃圾滲濾液。

富集培養(yǎng)基成分為蛋白胨10 g／L、牛肉膏5 g／L、NaCl 5 g／L。

無機(jī) 鹽 培 養(yǎng) 基 成 分 為 KH2PO40.5 g／L、K2HPO40.5 g／L、MgSO40.2 g／L、CaCl20.1 g／L、NaCl 0.2g／L、（NH4）2SO41.0 g／L，聯(lián)苯0.5 g／L。固體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂。

降 解 培 養(yǎng) 基 成 分 為 KH2PO40.5 g／L、K2HPO40.5 g／L、MgSO40.2 g／L、CaCl20.1 g／L、NaCl 0.2 g／L、（NH4）2SO41.0 g／L、PCB70（2，3’，4’，5－四氯聯(lián)苯）－正己烷溶液0.5 g／L。

培養(yǎng)基（不加聯(lián)苯）均調(diào)節(jié)p H值至7.0，并在121℃、0.1 MPa下滅菌20 min后使用，聯(lián)苯經(jīng)過紫外滅菌后再加入到培養(yǎng)基中。

1.2 PCBs降解菌株篩選

將采取的水樣按照10%接種量接種至富集培養(yǎng)基中，在35℃、150 r／min的搖床中培養(yǎng)，得到富集培養(yǎng)對象占優(yōu)勢的微生物混養(yǎng)物。取1 m L富集菌液加入到100 m L以聯(lián)苯（采用滅菌的聯(lián)苯－乙酸乙酯溶液噴灑于表面）作為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，每5～7 d按10%接種量轉(zhuǎn)移至新鮮的無機(jī)培養(yǎng)基中［14］。最后取培養(yǎng)液按照10－1、10－2、10－3逐級(jí)梯度稀釋菌液，無菌操作下分別吸取0.2 m L不同梯度的稀釋菌液涂布于固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上，倒置培養(yǎng)于35℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)至平板長出肉眼可見的菌落。

選取平板上生長的典型單一菌落，至富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)后再經(jīng)多次平板劃線，直至分離得到純的單菌落。

1.3 菌株鑒定

1.3.1 細(xì)胞觀察

樣品經(jīng)過固定化處理和革蘭氏染色后進(jìn)行油鏡觀察［15］。用戊二醛固定乙醇脫水，真空干燥和表面噴金后用S－4800掃描式電子顯微鏡進(jìn)行形態(tài)觀察及電鏡攝影。

1.3.2 細(xì)菌16S r DNA測序和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

利用分子生物學(xué)手段對菌株進(jìn)行鑒定。以基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增16S r DNA，擴(kuò)增引物采 用 細(xì) 菌 通 用 引 物 F27 （5’－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3’）和 R1492 （5’－GGTTACCTTGTTACGACTT－3’）。

PCR反應(yīng)體系選用50μL反應(yīng)體系：引物1μL；引物2μL；d NTP 1μL，Pfu Buffer 5μL，Pfu酶0.25μL，加水至50μL。

PCR擴(kuò)增條件：98℃5 min；95℃35 s，55℃35 s，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)，延伸4 min。

擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在17%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，經(jīng) UNIQ－10PCR Product Purification Kit（Sang on and NSBC）純化。將純化的PCR產(chǎn)物連接到載體p UCm－T上，提取有16S r DNA插入的質(zhì)粒并測序，序列測定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。將測序結(jié)果用Blast軟件與GenBank中已登錄的16S r DNA序列進(jìn)行同源性比較。

1.4 菌株的優(yōu)化培養(yǎng)

1.4.1 菌珠生長曲線測定

將菌株接入富集培養(yǎng)基內(nèi)，置于搖床內(nèi)在35℃、150 r／min條件下，富集培養(yǎng)3 d。再取1 m L富集菌液分別接種于8個(gè)含100 m L降解培養(yǎng)基的250 m L錐形瓶中，并置于搖床中35℃、150 r／min培養(yǎng)；于無菌操作條件下定期取5 m L菌液測定菌體干質(zhì)量。

1.4.2 PCB70降解率的影響因素分析

（1）p H值對PCB70降解率的影響。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基p H 值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，分別接入5%新鮮菌液，35℃、150 r／min下培養(yǎng)，測定降解率，確定最佳p H值。

（2）溫度對PCB70降解率的影響。向降解培養(yǎng)基中接入5%新鮮菌液，分別置于15、25、35、45℃下150 r／min培養(yǎng)，測定降解率，確定最佳溫度。

（3）裝液量對PCB70降解率的影響。在250 m L三角瓶中分別加入50、75、100、125 m L降解培養(yǎng)基，接入5%新鮮菌液，35℃、150 r／min下培養(yǎng)，測定降解率，確定最佳裝液量。

（4）底物質(zhì)量濃度對PCB70降解率的影響。以PCB70（2，3’，4’，5－四氯聯(lián)苯）為降解底物，配制 PCB70質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg／L的降解培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)p H 值為7.0，分別接入5%新鮮菌液，35℃、150 r／min下培養(yǎng)，測定降解率，確定最佳底物質(zhì)量濃度。

1.4.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取影響 WF1生長的4個(gè)因素——溫度、p H值、裝液量及搖床轉(zhuǎn)速，將菌株按不同因素不同水平條件培養(yǎng)，48 h后測定其在600 nm處的吸光度，平行測定3次，取平均值，考察菌株在不同條件下的生長狀況，探究其適宜的生長條件。

1.4.4 PCB70降解率測定

取樣加入（NH4）2SO4破乳，加入正己烷萃取，搖床震蕩10 min，靜置30 min后以5 000 r／min離心5 min，取上層正己烷相上機(jī)分析。

氣相色譜分析條件：色譜柱為 Wonda CAP 0.25 mm×0.25μm×30 m；載氣為高純氮?dú)猓M(jìn)樣口溫度為150℃；檢測器溫度為260℃；進(jìn)樣體積為1μL，無分流進(jìn)樣；柱箱升溫程序如下：初始溫度為150℃，保持4 min，以10℃／min升至320 ℃，保持10 min［16－18］。

比較空白組和降解組相同保留時(shí)間的峰面積比值，計(jì)算降解率。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株鑒定與菌株WF1生長曲線的測定

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)富集、分離純化得到一株降解聯(lián)苯的純菌株WF1，菌株在固體培養(yǎng)基上為乳白色，菌落為圓形，表面光滑，不透明，菌體為桿狀，細(xì)胞長度約1.2～2.6μm。革蘭氏染色為陽性，掃描電鏡如圖1所示。

菌株WF1生長曲線如圖2所示。多氯聯(lián)苯降解菌株WF1的生長經(jīng)過1 d多的遲滯期后進(jìn)入對數(shù)生長期，經(jīng)過6 d的培養(yǎng)后由于培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)不斷地被消耗掉以及菌株WF1新陳代謝產(chǎn)生的毒性物質(zhì)的積累等因素的影響，WF1的生長進(jìn)入衰亡期。

圖1 菌株WF1的掃描電鏡照片

圖2 菌株WF1生長曲線

將16S r DNA測序結(jié)果，與已有的Blast數(shù)據(jù)進(jìn)行序列分析和同源性比較，找出了與該菌株有較好同源性的基因，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示。

從圖3可以看出，分離得到的菌株WF1與枯草桿菌（Bacillus subtilis）多個(gè)菌株的同源性高達(dá)99%以上，綜合菌株的生理生化以及分子鑒定結(jié)果，該菌株屬于枯草桿菌（Bacillus subtilis）。

目前研究報(bào)道有多種微生物能夠降解PCBs［13，19－26］。其中 Acinetobacter sp.P6在聯(lián)苯為碳源的生長體系中可以降解Aroclor 1254中40個(gè)大峰中的25個(gè)［27］；Alcaligenes eutrophus.H850能利用聯(lián)苯和2－氯聯(lián)苯為唯一碳源生長，并且在休眠細(xì)胞體系中可以降解4氯、5氯和部分6氯取代的多氯聯(lián)苯［28］；Alcaligenes sp.JB1在好氧恒化反應(yīng)器可降解4～6氯取代的PCBs，而休眠細(xì)胞只能降解最多4氯的PCBs［29］；Burkholderia xenovorans LB400降解底物范圍寬，在休眠體系中對不同類型的2～6氯的PCBs都能 降解［30］。

圖3 以16S rDNA同源性為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 對PCB70降解率的影響因素分析

p H值、溫度、裝液量對PCB降解率的影響分析曲線如圖4所示。

2.2.1 p H值對PCB70降解率的影響

由圖4a可見，p H 值為7.0時(shí)，菌株對PCB70降解率最高，最高達(dá)82.65%。p H值為6.5和7.5時(shí)，PCB70降解率比p H 值為7.0時(shí)低，在第9天降解率分別為65.75%和62.56%。而當(dāng)p H值為5.5和8.0時(shí)，PCB70降解率最低。因?yàn)槿芤撼仕嵝曰驂A性時(shí)，菌株生長均受到抑制，影響降解速率。因此。p H值為6.5～7.5時(shí)，降解效果好。

圖4 p H值、溫度和裝液量對PCB70降解率的影響

每種微生物都有其生長繁殖的最適p H值和一定的p H范圍。在最適范圍內(nèi)酶活性最高，如果其他條件適合，微生物的生長速率也最高。如果p H值不合適，不但影響菌體的正常生長，而且還會(huì)改變微生物產(chǎn)酶的活力和種類。過酸或過堿可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這主要與蛋白質(zhì)的變性和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)受損有關(guān)［31］。

2.2.2 溫度對PCB70降解率的影響

由圖4b可知，在15～35℃時(shí)，隨著溫度的升高，WF1菌株對PCB70的降解率也隨之升高，當(dāng)溫度升高到35℃時(shí)，降解率達(dá)到最大，第5天達(dá)到69.37%，第6天達(dá)到82.43%。當(dāng)溫度達(dá)到45℃時(shí)降解率顯著下降，這是因?yàn)榫暝诔^45℃時(shí)活性很低或不能生長。因此確定該菌株在25～35℃時(shí)PCB70降解率最佳。

溫度是影響微生物生長與存活的最重要的因素之一。它對機(jī)體的影響主要表現(xiàn)在2個(gè)方面：一方面隨著溫度的上升，細(xì)胞中生物化學(xué)反應(yīng)速度和生長速度加快；另一方面，機(jī)體的重要組成成分如蛋白質(zhì)和核酸等對溫度都很敏感，隨著溫度的升高而可能造成不可逆的破壞。因而只有在一定溫度范圍內(nèi)，機(jī)體的代謝活動(dòng)與生長繁殖才能隨著溫度的升高而增加，當(dāng)溫度上升到一定程度，便開始對機(jī)體產(chǎn)生不利影響，如繼續(xù)升高，則細(xì)胞功能急劇下降以致死亡［31］。

2.2.3 裝液量對PCB70降解率的影響

如圖4c所示，PCB70降解率隨著裝液量的增加而成降低的趨勢。裝液量為50、75、100 m L時(shí)，PCB70降解率最高分別達(dá)89.63%、83.82%和69.71%。這是因?yàn)閃F1為好氧型菌，在降解PCB70過程中對溶解氧量的要求較高，裝液量少、溶氧量高有利于其生長及對PCB70的降解［32］。裝液量為125 m L時(shí)，PCB70降解率最高只有46.06%。因?yàn)檠b液量為125 m L時(shí)三角瓶培養(yǎng)基上空的氧氣含量減少，再加上三角瓶本身的質(zhì)量過大，固定搖床轉(zhuǎn)速為150 r／min，液體培養(yǎng)基在振蕩器中不易被搖晃均勻，導(dǎo)致菌體不能完全利用液體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，使得降解率降低。

反應(yīng)器的體積和搖床轉(zhuǎn)速一定時(shí)，裝液量越大，營養(yǎng)物質(zhì)總量越大，所能供養(yǎng)的菌種總量越大，降解率也越高；但裝液量越大，單位溶液中的溶氧量越少，從而不利于好氧微生物的生長，降解率也隨之降低［33］。因此，菌株 WF1的裝液量選擇100 m L／250 m L三角瓶以下為最佳。

2.2.4 底物質(zhì)量濃度對PCB70降解率的影響

PCB70是本實(shí)驗(yàn)菌株 WF1的碳源，在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，PCB70作為營養(yǎng)物質(zhì)被分解，能夠促進(jìn)微生物的生長和繁殖，另一方面，PCB70又可以作為菌株產(chǎn)PCB70降解酶的底物，誘導(dǎo)菌株產(chǎn)PCB70降解酶，因而提高了降解率。而PCB70質(zhì)量濃度過高產(chǎn)生的大量有毒物質(zhì)會(huì)對菌株產(chǎn)生毒害作用，影響其降解率［34］。

底物質(zhì)量濃度對PCB70降解率的影響如圖5所示。WF1在PCB70質(zhì)量濃度為0.1～0.8 mg／L范圍內(nèi)均能生長。在0.2 mg／L 時(shí)，WF1的降解效果最好，為72.73%。在底物質(zhì)量濃度為0.1、0.4 mg／L時(shí)，降解率均為64.82%。隨著PCB70質(zhì)量濃度由0.4 mg／L逐漸提高到1.0 mg／L時(shí)，其降解率也逐漸降低。特別地，當(dāng)PCB70質(zhì)量濃度高達(dá)1.0 mg／L時(shí)，降解率僅為43.48%。因?yàn)镻CB70質(zhì)量濃度過高，超過了菌株的忍受極限，對微生物的毒害作用增大，甚至有致死作用，導(dǎo)致菌體數(shù)量下降，從而造成了降解率的降低。因此確定在底物質(zhì)量濃度為0.1～0.2 mg／L時(shí)WF1對PCB70的降解率最好。

圖5 底物質(zhì)量濃度對PCB70降解率的影響

2.3 菌株WF1的生長條件優(yōu)化

正交試驗(yàn)的結(jié)果及分析見表1所列。由p H值、溫度、裝液量、搖床轉(zhuǎn)速4個(gè)因素的極差，可得知這4個(gè)影響因素對菌株生長的重要性依次為：p H值＞溫度＞轉(zhuǎn)速＞裝液量。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

由表1中極差R可以看出，p H值為最主要因素，溫度和搖床轉(zhuǎn)速為次要因素，裝液量為不重要因素。在p H值為7.0的條件下，菌株WF1生長得最好。溫度是影響微生物酶活性的重要因素，也是微生物生長條件的關(guān)鍵因素，由試驗(yàn)結(jié)果可知，WF1的生長狀況在30℃和35℃時(shí)較好，并且在35℃時(shí)，OD600平均值最高，達(dá)到0.71。轉(zhuǎn)速主要決定了培養(yǎng)基中碳源的利用率以及菌株與空氣的充分接觸，但是轉(zhuǎn)速不宜過高，過高使得聯(lián)苯無法吸附在錐形瓶瓶壁上，微生物也就無法附著在聯(lián)苯上，這就可能導(dǎo)致菌株的生長狀況反而較差。轉(zhuǎn)速為150 r／min的4組試驗(yàn)結(jié)果的OD600平均值最高為0.67，其次是轉(zhuǎn)速為100 r／min的4組，OD600平均值為0.64，而轉(zhuǎn)速為0、50 r／min的8組試驗(yàn)OD600平均值明顯變小，可見該菌的生長需要通過攪拌與空氣充分接觸。裝液量影響供微生物生長的氧氣含量，從正交試驗(yàn)的結(jié)果來看，在裝液量分別為30、50、100、150 m L時(shí)，WF1生長情況差別很小。綜上所述，適宜菌株 WF1生長的優(yōu)化條件為：p H值7.0、溫度35℃和搖床轉(zhuǎn)速150 r／min。

3 結(jié) 論

（1）本研究從垃圾滲濾液中篩選出一株以聯(lián)苯為唯一碳源生長的純菌株WF1，此菌株經(jīng)革蘭氏染色，為Gram＋，經(jīng)SEM掃描，細(xì)胞呈桿狀（長1.2～2.6μm）；將16Sr DNA 測序結(jié)果與已有的Blast數(shù)據(jù)進(jìn)行了序列分析和同源性比較，找出了與該菌株有較好同源性的基因，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，最終將其鑒定為枯草桿菌。

（2）純菌株WF1對PCB70的降解過程受環(huán)境條件的影響，在35℃、p H 值為6.5～7.5、裝液量100 m L／250 m L以下、PCB70質(zhì)量濃度為0.1～0.2 mg／L、轉(zhuǎn)速為150 r／min的條件下，降解率較高；通過正交試驗(yàn)優(yōu)化得到菌株 WF1的適宜生長條件如下：p H值為7.0，溫度為35℃，轉(zhuǎn)速為150 r／min。研究表明菌株的良好降解條件與適宜生長條件基本一致。

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Isolation，identification and growth optimization of a PCBs－degrading strain

LUO Xiao－xiao1， PENG Shu－chuan1， WANG Jin1，F(xiàn)ANG Li1， YUE Zheng－bo1， WU Ke2

（1.School of Resources and Environmental Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China；2.Key Laboratory of Applied Enzymology and Engineering，Hefei University，Hefei 230022，China）

A polychlorinated biphenyls（PCBs）－degrading bacterium was isolated from landfill leachate.The strain，named as WF1，belongs to Bacillus subtilis based on 16s r DNA sequence analysis.In order to investigate the growth and degradation characteristics of the bacterium，the factors such as p H value，temperature and liquid volume which affected PCBs－degrading ability of the strain were studied.The growth condition was optimized by the orthogonal tests.It was showed that the suitable growth situation for strain WF1 was coincident with the optimal degradation condition of PCB70.The p H value was the most important factor，temperature and rotation speed were second，while liquid volume was not important.The optimal growth condition for the strain was p H value of 7.0，temperature of 35℃and rotation speed of 150 r／min.

polychlorinated biphenyls（PCBs）；Bacillus subtilis WF1；orthogonal test

X172

A

1003－5060（2015）02－0232－07

10.3969／j.issn.1003－5060.2015.02.020

2014－02－17；

2014－03－31

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（41372347）；安徽省科技攻關(guān)計(jì)劃資助項(xiàng)目（12010402100）

羅筱梟（1991－），女，浙江臺(tái)州人，合肥工業(yè)大學(xué)碩士生；

彭書傳（1964－），男，安徽六安人，合肥工業(yè)大學(xué)教授，碩士生導(dǎo)師.

（責(zé)任編輯 張淑艷）