獼猴桃AcGLK2a基因過表達(dá)載體的構(gòu)建及在番茄中的遺傳轉(zhuǎn)化

周 昂， 牛向麗， 劉永勝

（合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

葉綠體是植株進(jìn)行光合作用的重要細(xì)胞器， 葉綠體中含有的葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的重要元素。番茄的未成熟時期綠色主要來源于葉綠素，葉綠素決定了產(chǎn)品的品質(zhì)特征［1］。番茄進(jìn)入成熟期后，葉綠體逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩w，葉綠素逐漸被降解，類胡蘿卜素的質(zhì)量比開始增加［2］，果實的綠色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，最后轉(zhuǎn)變?yōu)榉殉墒鞎r期的深紅色。在人類所需的營養(yǎng)中，類胡蘿卜素扮演重要角色［3］。成熟番茄果實是人類攝取天然類胡蘿卜素和番茄紅素的重要來源［4］。

陸生植物葉綠體正常發(fā)育過程中需要GLK轉(zhuǎn)錄因子［5］。在玉米中ZmGLK2和ZmGLK1分別在維管束鞘細(xì)胞和葉肉細(xì)胞中特異性調(diào)控質(zhì)體和葉綠體的發(fā)育［6－8］。擬南芥的 AtGLK1 和AtGLK2已被證實與葉綠體的發(fā)育相關(guān)［9－10］。AtGLK以細(xì)胞自主性方式協(xié)調(diào)和維持光合系統(tǒng)［11］。番茄SlGLK的過表達(dá)增加了光合成基因的表達(dá)和葉綠體的發(fā)育，導(dǎo)致碳水化合物和類胡蘿卜素在成熟果實中質(zhì)量比升高［12］。

本文利用植物過表達(dá)載體pBI121，在番茄植株中過表達(dá)獼猴桃GLK2基因AcGLK2a。半定量逆轉(zhuǎn)錄 PCR（reverse transcription－PCR，RT－PCR）分析顯示，轉(zhuǎn)基因番茄植株內(nèi)AcGLK2a的表達(dá)量顯著升高，而在野生型植株中則沒有表達(dá)。與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株的未成熟果實和葉片中積累的葉綠素質(zhì)量比明顯提高。

1 材料與方法

番茄（Solanum lycopersicum）、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α菌株、農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105及植物表達(dá)載體pBI121均為本實驗室保存。

反轉(zhuǎn)錄酶、高保真、Taq DNA 聚合酶、pEASY－Blunt載體、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自TI天根生化科技（北京）有限公司。

1.1 獼猴桃AcGLK2目的基因的克隆

按照GenBank中獼猴桃AcGLK2a基因序列（登錄號 Achn385381）設(shè)計引物AcGLK2a－F，AcGLK2a－R，見表1所列，利用上述引物構(gòu)建pBI121－35S－AcGLK2a過表達(dá)載體。

表1 用于PCR擴(kuò)增寡核苷酸引物

提取野生型獼猴桃幼苗總RNA，通過RTPCR擴(kuò)增AcGLK2a基因。PCR條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃30s；57℃30s；72℃60s，32個循環(huán)；72 ℃10min。將PCR產(chǎn)物與pEASY－Blunt載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對重組子進(jìn)行快提和PCR驗證，陽性克隆送南京金斯瑞生物技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2 番茄的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

將重組質(zhì)粒pBI121－35S－AcGLK2a通過液氮法導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，在含有利福平和卡那霉素（50mg／L）的培養(yǎng)基上28℃ 培養(yǎng)2d，陽性菌用以轉(zhuǎn)化野生型番茄。番茄種子用蒸餾水浸泡12h后，15%次氯酸鈉溶液浸泡消毒15min，再以無菌水漂洗5次后播種至1／2MS培養(yǎng)基。25℃生長4d，露白后轉(zhuǎn)至光照下培養(yǎng)。待子葉完全舒展時，將子葉剪下置于預(yù)培養(yǎng)基（MS＋1mg／L 6－BA＋0.04mg／L IAA）上培養(yǎng)2d；將帶有pBI121－35SAlGLK2a載體的農(nóng)桿菌28℃過夜培養(yǎng)，室溫下5000r／min離心5min收集菌。

用稀釋后的農(nóng)桿菌浸染預(yù)培養(yǎng)子葉10min；吸去子葉上多余菌液后，將子葉轉(zhuǎn)至共培養(yǎng)基（MS＋1mg／L KT＋1mg／L 2，4－D＋10mg／L ACE）上培養(yǎng)2d；然后轉(zhuǎn)至再生培養(yǎng)基（MS＋500mg／L SB＋2mg／L 6－BA＋50mg／L KANA＋0.2mg／L IAA），26℃光照培養(yǎng)（16h 光照，8h黑暗），每21d更換1次培養(yǎng)基；待愈傷組織上長出的不定芽長至2cm左右時，將芽切下移至生根培養(yǎng)基（MS＋500mg／L SB＋2mg／L IAA＋50mg／L KANA）上生根；最后將再生植株移入營養(yǎng)土，放于溫室中栽培。

提取野生型、轉(zhuǎn)基因番茄基因組DNA。以pBI121－35S質(zhì)粒為陽性對照，野生型番茄DNA為陰性對照，利用pBI121載體篩選標(biāo)記基因新霉素磷酶基因（NPTⅡ）（登錄號AF485783）序列引物NPTⅡ－F和NPTⅡ－R，對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸40s，30個循環(huán)；最后72℃延伸5min。

1.3 半定量 RT－PCR

分別提取野生型和轉(zhuǎn)基因T0代葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄合cDNA，以此為模板進(jìn)行半定量RT－PCR。AcGLKa 基因使用的引物為GLK2BDL－F、GLK2BDL－R。以番茄ACTIN 為內(nèi)參基因（登錄號BT013707），其PCR擴(kuò)增引物為 ACTIN－F、ACTIN－R。95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，27個循環(huán)；72℃延伸5min。

1.4 葉綠素質(zhì)量比的測定

剪取番茄成熟葉片0.5～1.0g，液氮充分研磨后，以1mL 80%丙酮充分萃?。?3］。萃取液離心后分光光度計檢測，讀取645nm和663nm下光吸收值A(chǔ)645和A663。按照MacKinney常數(shù)計算葉綠素a和葉綠素b的質(zhì)量比，計算公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 AcGLK2a基因擴(kuò)增與測序

以獼猴桃cDNA為模板，分別以AcGLK2a－F和AcGLK2a－R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物為一條特異條帶，如圖1所示，與預(yù)期獼猴桃AcGLK2a基因片段大小（1146bp）一致。測序結(jié)果表明與獼猴桃AcGLK2a基因預(yù)測序列一致。

圖1 AcGLK2a基因PCR擴(kuò)增

2.2 pBI121－35S－AcGLK2a表達(dá)載體鑒定

利用SacⅠ和BamHⅠ雙酶切pBI121－35S－AcGLK2a表達(dá)載體，得到預(yù)期大小AcGLK2a片段，如圖2所示。

由圖2可知，AcGLK2a已經(jīng)連接到植物表達(dá)載體pBI121。

圖2 pBI121－35S－AcGLK2a載體酶切鑒定

2.3 轉(zhuǎn)基因陽性植株鑒定

通過植物組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因番茄植株后，提取轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA，利用植物表達(dá)載體pBI121攜帶的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ（NPTⅡ）篩選基因?qū)χ仓赀M(jìn)行陽性鑒定，預(yù)期擴(kuò)增片段長度為857bp。所獲得5株轉(zhuǎn)基因植株檢測結(jié)果如圖3所示，其中4株經(jīng)鑒定為轉(zhuǎn)基因番茄苗。即對照野生型植株未能擴(kuò)增出857bp條帶，而轉(zhuǎn)基因陽性株及陽性對照擴(kuò)增出857bp條帶，說明攜帶NPTⅡ基因的載體片段已整合于受體植株核染色體組中。

圖3 轉(zhuǎn)基因番茄植株的PCR鑒定

2.4 轉(zhuǎn)基因植株中AcGLK2a表達(dá)情況

利用半定量RT－PCR方法，分析轉(zhuǎn)基因植株果實中過表達(dá)AcGLK2a的表達(dá)水平。提取野生型和3株獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因陽性番茄的綠色果實中的RNA，以RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，半定量RT－PCR分析，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，轉(zhuǎn)基因植株AcGLK2a基因的表達(dá)水平較高，說明轉(zhuǎn)入pBI121－35S－AcGLK2a載體后，獼猴桃AcGLK2a基因得到了過量表達(dá)。

圖4 轉(zhuǎn)基因番茄AcGLK2a表達(dá)半定量分析

2.5 轉(zhuǎn)基因植株表型分析

AcGLK2a轉(zhuǎn)基因植株與野生型相比，具有明顯差異。轉(zhuǎn)基因植株的葉片和果實任一生長發(fā)育期顏色均比野生型植株的要深。每植株取綠熟期番茄果實各6個、相同位置葉片各6片，每組3次重復(fù)測定果實、葉片葉綠素質(zhì)量比結(jié)果如圖5所示，轉(zhuǎn)基因植株果實的總?cè)~綠素和葉綠素a質(zhì)量比比野生型分別提高544.35% 和632.01%。轉(zhuǎn)基因植株葉片的總?cè)~綠素和葉綠素a質(zhì)量比比野生型分別提高148.17% 和316.03%。

圖5 野生型和轉(zhuǎn)基因番茄成熟綠果、葉片的葉綠素a及葉綠素質(zhì)量比測定

3 討 論

在植物體內(nèi)，SlGLK2基因與葉綠體的發(fā)育相關(guān)［12］。本文將獼猴桃中SlGLK2的同源基因AcGLK2a通過在番茄中過表達(dá)，半定量RT－PCR檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株中AcGLK2a基因在番茄植株得到了表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出果實、葉片顏色變深，葉綠素質(zhì)量比顯著增加的表型。實驗結(jié)果表明，過表達(dá)AcGLK2a的轉(zhuǎn)基因植株果實葉綠素a質(zhì)量比比同期野生型果實提高約632.01%。根據(jù)文獻(xiàn)［14］可知，類胡蘿卜素的質(zhì)量比與葉綠素a呈顯著正相關(guān)，可利用前期果實內(nèi)葉綠素質(zhì)量比估計果實成熟后期類胡蘿卜素的質(zhì)量比。由此可知過表達(dá)AcGLK2a的轉(zhuǎn)基因植株成熟番茄紅果的類胡蘿卜素的質(zhì)量比。

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