健康志愿者多劑量服用左金丸對(duì)CYP3A4活性的影響

劉松燦， 裘福榮， 繆 萍， 朱蕾蕾， 曾 金， 李秋月， 賀 敏， 蔣 健

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院臨床藥理科，上海201203）

[臨床]

健康志愿者多劑量服用左金丸對(duì)CYP3A4活性的影響

劉松燦， 裘福榮*， 繆 萍， 朱蕾蕾， 曾 金， 李秋月， 賀 敏， 蔣 健*

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院臨床藥理科，上海201203）

目的研究健康受試者口服左金丸對(duì)細(xì)胞色素P450酶3A4（CYP3A4）活性的影響。方法采用隨機(jī)開放兩周期試驗(yàn)設(shè)計(jì)，16名健康受試者 （男女各半）口服左金丸7 d（每天2次，每次3 g）前、后再分別單劑量口服咪達(dá)唑侖15 mg，LC-MS/MS測(cè)定咪達(dá)唑侖及其代謝物1-羥基咪達(dá)唑侖在24 h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度，WinNonlin軟件計(jì)算咪達(dá)唑侖及1-羥基咪達(dá)唑侖的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果服用左金丸前后，受試者血漿中咪達(dá)唑侖的Cmax分別為（138.44±62.55）ng/mL、 （132.99±64.74）ng/m L；AUC0-24分別為 （305.25±112.05）ng·h/mL、（343.68± 149.39）ng·h/mL；tmax分別為 （0.5，0.25-2）h、（0.5，0.25-3）h；t1/2分別為 （3.52±1.06）h、（3.99±1.30）h；清除率 （CL/F）分別為 （54.65±17.65）L/h、（49.74±17.88）L/h；Cmax代謝比分別為（0.60±0.24）、（0.42± 0.18）；AUC0-24代謝比分別為 （0.53±0.18）、（0.41±0.14）。結(jié)論口服左金丸7 d對(duì)CYP3A4有弱抑制作用。

左金丸；細(xì)胞色素P450酶3A4；咪達(dá)唑侖；藥物相互作用

隨著中醫(yī)藥在臨床上的廣泛應(yīng)用，中西藥間的相互作用（herb-drug interaction）日益受到人們的關(guān)注。細(xì)胞色素P450 3A（CYP3A）是CYP主要亞家族，參與50%以上藥物代謝，而左金丸與CYP3A4底物藥聯(lián)用在臨床上十分普遍。左金丸為臨床常用中成藥，具有瀉火疏肝和胃止痛的功效，臨床上用于治療肝火犯胃證［1-2］，現(xiàn)代研究認(rèn)為，左金丸具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗?jié)儯种莆敢?、胃酸、胃泌素分泌和胃蛋白酶活性，目前用于治療各種胃?。?］。左金丸由黃連與吳茱萸質(zhì)量比6∶1組成，其中有效成分為小檗堿、黃連堿、巴馬汀、藥根堿等黃連生物堿和吳茱萸堿、吳茱萸次堿等吳茱萸生物堿組成［1-2］。有報(bào)道黃連生物堿對(duì)人CYP3A4酶有輕度抑制作用［4］，小檗堿具有輕度抑制人體內(nèi)CYP3A4活性［5］。吳茱萸次堿在人肝微粒體中對(duì)CYP3A4有抑制作用［6-7］。Iwata報(bào)道吳茱萸次堿在人肝微粒體中具有機(jī)制性抑制作用［8］。所以選用健康志愿者口服CYP3A4體內(nèi)探藥馬來(lái)酸咪達(dá)唑侖片進(jìn)行左金丸對(duì)人體CYP3A4是否具有抑制作用的研究，該研究結(jié)果對(duì)臨床合理使用左金丸具有指導(dǎo)作用。

1 材料、對(duì)象與方法

1.1 藥品、試劑與儀器 左金丸，規(guī)格為每瓶18 g，批號(hào)120301（湖北諾得勝制藥有限公司）；馬來(lái)酸咪達(dá)唑侖片 （商品名力月西），規(guī)格為每片15 mg，批號(hào)20111201（江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司）；咪達(dá)唑侖對(duì)照品 （純度 ＞98%，批號(hào)171265-201001）、地西泮對(duì)照品 （內(nèi)標(biāo)，純度 ＞98%，批號(hào)115-9302），均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；1′-羥基咪達(dá)唑侖對(duì)照品，純度＞99%，批號(hào)59468858（美國(guó)Sigma公司）。甲醇和乙腈為色譜純 （美國(guó)Tedia公司）；甲酸和乙酸銨為分析純 （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水（美國(guó)Millipore公司超純水系統(tǒng)制備）。

API 4000串聯(lián)質(zhì)譜儀，配置電噴霧離子化源（ESI）、三級(jí)四極桿質(zhì)量分析器和Analyst 1.4.2數(shù)據(jù)處理軟件（美國(guó)ABI/SCIEX公司）；Agilent1200高效液相色譜儀，配置四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱（美國(guó)Agilent公司）；Thermo超低溫冰箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；XS-105電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Millpore-Q純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；Labconco離心濃縮儀（美國(guó)Labconco公司）；Backman Allegra 64R高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Backman Coulter公司）；漩渦混合器 （上海滬西分析儀器廠）；電熱恒溫振蕩水槽 （上海一恒科技有限公司）。

1.2 受試者選擇 16名健康受試者，男、女各半，年齡 （24.38±1.96）歲，體質(zhì)量 （60.6± 8.09）kg。試驗(yàn)前經(jīng)血尿常規(guī)、血生化、胸片、心電圖檢查均未發(fā)現(xiàn)異常；受試者無(wú)藥物過(guò)敏史和藥物依賴史，無(wú)精神病史及其他慢性病史。試驗(yàn)前2周內(nèi)未服任何藥物。受試者均知情同意并簽署知情同意書。

1.3 給藥方案與血樣采集 采用隨機(jī)開放2周期試驗(yàn)設(shè)計(jì)［9-10］，試驗(yàn)方案經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

受試者于試驗(yàn)前晚住院觀察，禁食10 h后，于受試日早晨8點(diǎn)空腹口服馬來(lái)酸咪達(dá)唑侖片15 mg，用溫開水200 mL送服。服藥后2 h自由飲水，4 h后統(tǒng)一進(jìn)餐。試驗(yàn)期間禁煙、酒及含咖啡因的飲料，避免劇烈活動(dòng)。

分別于服藥前 （0 h）及服藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24 h采集上肢靜脈血4 m L，置肝素化離心管中，3 000 r/min離心10 min，分離血漿，-80℃保存，待測(cè)。受試者自第2天起口服左金丸，每次3 g，每天2次，連續(xù)服用7 d，于第7天晚入?、衿诓》?。第8天早晨空腹口服馬來(lái)酸咪達(dá)唑侖片15 mg和左金丸3 g，采血時(shí)間點(diǎn)、分離血漿及保存樣本同前。

1.4 血漿中咪達(dá)唑侖及1-羥基咪達(dá)唑侖測(cè)定方法［11-12］

1.4.1 血漿樣品處理 取血漿樣本300μL，加入地西泮乙腈溶液 （內(nèi)標(biāo)100 ng/mL）10μL及1 mol/L NaOH 30μL，渦旋混勻30 s后，加入乙酸乙酯1.5 mL，渦旋振蕩3 min，12 000 r/min離心10 min。轉(zhuǎn)移上清液置于1.5 mL離心管中，55℃下氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)昧鲃?dòng)相100μL溶解，混勻后，12 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)入LC-MS/ MS分析。

1.4.2 色譜條件 Aglient Eclipse XDB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為4 mmol/L乙酸銨和0.08%甲酸水溶液-甲醇 （30∶70）；柱溫30℃；體積流量0.8 m L/min；進(jìn)樣量10μL。

1.4.3 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源 （ESI）；多反應(yīng)檢測(cè) （MRM）模式掃描；極性正離子 （+）；噴射電壓 （IS）4 500 V，離子化溫度 （TEM）400℃，噴霧氣壓（GS1）50 psi（1 psi=6.895 kPa），輔助氣壓（GS2）50 psi；咪達(dá)唑侖m/z326.4→291.2，去簇電壓（DP）105.14 V，碰撞電壓（CE）35.88 V，碰撞室射出電壓 （CXP）13 V；1-羥基咪達(dá)唑侖m/z342.2→324.0，DP 91.05 V，CE 33V，CXP 17.94 V；內(nèi)標(biāo)地西泮m/z 285.2→193.1，DP 98.06 V，CE 43 V，CXP 12 V。

1.5 方法學(xué)考察 在上述色譜條件下，咪達(dá)唑侖、1-羥基咪達(dá)唑侖和內(nèi)標(biāo) （地西泮）的保留時(shí)間分別為2.63、2.21和3.15 min，峰形良好，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)及其他雜質(zhì)不干擾測(cè)定。血漿中咪達(dá)唑侖及其代謝物1-羥基咪達(dá)唑侖的質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.25～250 ng/mL和0.15～150 ng/mL，定量下限分別為0.25 ng/mL和0.15 ng/mL。線性回歸方程分別為Y=1.66X+0.038 8（r=0.998 0）和Y=1.31X+0.036 8（r=0.996 5）。咪達(dá)唑侖和1′-羥基咪達(dá)唑侖的低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品的日內(nèi)、日間RSD均＜15%，提取回收率＞90%，無(wú)基質(zhì)效應(yīng)。咪達(dá)唑侖和1′-羥基咪達(dá)唑侖儲(chǔ)備液于4℃存放1周、血樣在室溫中存放4 h、血樣處理后在自動(dòng)進(jìn)樣器放置24 h、3次反復(fù)凍融、-80℃長(zhǎng)期保存2月時(shí)皆穩(wěn)定，符合生物樣品分析方法的要求。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用WinNonlin軟件（4.1版，美國(guó)Pharsight公司）計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。達(dá)峰濃度Cmax和達(dá)峰時(shí)間tmax為實(shí)測(cè)值，末段消除斜率 （λ）為對(duì)數(shù)血藥濃度-時(shí)間曲線末端直線部分的斜率，消除半衰期t1/2=0.693/λ，梯形法計(jì)算血藥濃度-時(shí)間曲線下面積AUC0-t值和AUC0-∞值，清除率（CL/F）=D/AUC0-∞，D為服用的藥物劑量。AUC的代謝比（MRAUC）為1-羥基咪達(dá)唑侖的AUC/咪達(dá)唑侖的AUC；Cmax的代謝比（MRCmax）為1-羥基咪達(dá)唑侖Cmax/咪達(dá)唑侖Cmax。

藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)數(shù)據(jù)均用x±s表示，tmax用（中位數(shù)，最小值-最大值）。Cmax、AUC0-t和AUC0-∞在經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，由SAS 9.3軟件中的GLM程序進(jìn)行方差分析，并計(jì)算口服左金丸7 d與基線相比的幾何均值及其90%可信區(qū)間，等效區(qū)間設(shè)定：Cmax為70.00%～143.00%，AUC0-t和AUC0-∞為80.00%～125.00%。tmax采用Willcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)分析，Cmax，AUC0-t，AUC0-∞，t1/2和CL/F采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析，顯著標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 血藥濃度-時(shí)間曲線 16名健康受試者口服左金丸7 d前、后單劑量服用CYP3A4探藥馬來(lái)酸咪達(dá)唑侖片15 mg后，咪達(dá)唑侖及1-羥基咪達(dá)唑侖的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖1。

2.2 藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 16名受試者口服左金丸7 d前、后單劑量服用馬來(lái)酸咪達(dá)唑侖片 （15 mg）的咪達(dá)唑侖及其代謝物1-羥基咪達(dá)唑侖的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表1。

圖1 咪達(dá)唑侖和1-羥基咪達(dá)唑侖的平均血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.1 Plasma concentration-time profiles ofm idazolam (A),and 1-hydroxylm idazolam(B)

表1 咪達(dá)唑侖和1-羥基咪達(dá)唑侖的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.1 Pharmacokinetics parameters ofm idazolam and 1-hyd roxylm idazolam

與服用左金丸前的基線相比，服用左金丸7 d后，咪達(dá)唑侖Cmax、AUC0-24、AUC0-∞、tmax、CL/ F和t1/2經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析差異無(wú)顯著意義 （P＞0.05），Cmax、AUC0-24、AUC0-∞90%可信區(qū)間在等效范圍內(nèi)，AUC0-24和 AUC0-∞的幾何均值分別為110.75%和111.21%。

與服用左金丸前的基線相比，服用左金丸7 d后，1-羥基咪達(dá)唑侖的AUC0-24、AUC0-∞、tmax和t1/2經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，差異無(wú)顯著意義 （P＞0.05），而Cmax明顯低于基線值 （P＜0.05），Cmax90%可信限低值小于70%，AUC0-24和AUC0-∞90%可信區(qū)間在等效范圍內(nèi)。

與服用左金丸前的基線相比，服用左金丸7 d后，AUC0-24代謝比和 Cmax代謝比減少 （P＜0.05）。

3 討論

因咪達(dá)唑侖經(jīng)CYP3A代謝，主要產(chǎn)生1-羥基咪達(dá)唑侖，F(xiàn)DA將咪達(dá)唑侖作為表示體內(nèi)外CYP3A催化活性的探藥。本研究受試者口服左金丸3 g/次，每天2次，連服7 d后，咪達(dá)唑侖AUC0-24、AUC0-∞90%可信區(qū)間在80%～125%范圍內(nèi)，但接近上限，幾何均值高出基線值約11%；1-羥基咪達(dá)唑侖Cmax的90%可信區(qū)間在低限之外，幾何均值為62.58%，AUC0-24和AUC0-∞90%可信區(qū)間在80%～125%范圍內(nèi)，但接近下限，其幾何均值低于基線值11%左右；AUC0-24和Cmax代謝比明顯減少 （P＜0.05）。受試者口服左金丸7 d后，由咪達(dá)唑侖經(jīng)CYP3A代謝生成1-羥基咪達(dá)唑侖量減少，導(dǎo)致1-羥基咪達(dá)唑侖的體內(nèi)暴露量相對(duì)減少，提示CYP3A酶被抑制。CYP3A在腸道和肝臟中有高表達(dá)［11-12］，受試者口服左金丸7 d后，咪達(dá)唑侖吸收增多，其代謝物1-羥基咪達(dá)唑侖吸收相對(duì)減少，說(shuō)明左金丸抑制腸腔CYP3A；但吸收入血咪達(dá)唑侖的消除半衰期 （t1/2）無(wú)明顯變化，說(shuō)明左金丸對(duì)肝臟CYP3A無(wú)抑制作用，對(duì)咪達(dá)唑侖的消除無(wú)影響。可能與左金丸抑制CYP3A的成分在腸腔的濃度較高，吸收進(jìn)入肝臟的量較少有關(guān)［13］。

在前期體外研究發(fā)現(xiàn)，左金丸中的黃連提取物、吳茱萸提取物對(duì)CYP3A有抑制作用，IC50分別為140.8μg/mL和240.4μg/m L（數(shù)據(jù)未發(fā)表）?？诜蠼鹜? g/次，每天2次，腸腔中抑制CYP3A成分可達(dá)到抑制濃度［14］。

臨床所用藥物有50%是CYP3A4底物藥，而左金丸是臨床常用中成藥，與其他藥物聯(lián)用可能性大。當(dāng)左金丸與CYP3A4聯(lián)用時(shí)，可能會(huì)引起代謝性相互作用，雖抑制程度較輕，但也應(yīng)注意不良反應(yīng)發(fā)生。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2010年版一部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：630.

［2］張保國(guó)，劉慶芳.左金丸現(xiàn)代臨床新用［J］.中成藥，2010，32（8）：1408-1411.

［3］楊宏博，肖小河，趙艷玲，等.黃連、吳茱萸藥對(duì)的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥房，2010，21（15）：1432-1434.

［4］Han Y L，Yu H L，LiD，et al.In vitro inhibition of Huanglian［Rhizoma coptidis（L.）］and its six active alkaloids on six cytochrome P450 isoforms in human livermicrosomes［J］.Phytother Res，2011，25（11）：1660-1665.

［5］Guo Y，Chen Y，Tan Z R，et al.Repeated administration of berberine inhibits cytochromes P450 in humans［J］.Fur JClin Pharmacol，2012，68（2）：213-217.

［6］余 奇，郭 澄，程澤能.吳茱萸次堿的研究進(jìn)展［J］.藥學(xué)實(shí)踐雜志，2007，25（6）：353-357.

［7］曹亞杰，曹 偉，余 奇，等.吳茱萸次堿在人肝微粒體中對(duì)細(xì)胞色素P450酶的抑制作用［J］.中南藥學(xué)，2005，3（4）：243-245.

［8］Iwata H，Tezuka Y，Kadota S，et al.Mechanism-based inactivation of human liver microsoma CYP3A4 by rutaecarpine and limonin from Evodia fruit extract［J］.Drug Metab Pharmacokinet，2005，20（1）：34-45.

［9］Food and Drug Administration.Guidance for industry：drug interaction studies-study design，data analysis，implications for dosing and labeling recommendations［EB/OL］.［2012-02］. http：//www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm292362.pdf

［10］Bjomsson TD，Callaghan JT，Einolf H J，etal.The conductof in vitro and in vivo drug-drug interaction studies：a Pharmaceutical Research and Manufacturersof America（PhRMA）perspective［J］.JClin Pharmacol，2003，43（5）：443-469.

［11］Qiu F，Jiang J，Ma Y，etal.Opposite effectsofsingle-doseand multidose administration of the ethanol extract of Danshen on CYP3A in healthy volunteers［J］.Fvid Based Complement Alternat Med，2013，2013：1-8.

［12］Qiu F，Wang G，Zhang R，etal.Effectof Danshen extracton the activity of CYP3A4 in healthy volunteers［J］.Br J Clin Pharmacol，2011，69（6）：656-662.

［13］華雯妍，張全英，丁 黎，等.LC-MS法研究健康人體鹽酸小檗堿片的藥代動(dòng)力學(xué)［J］.藥學(xué)與臨床研究，2009，17（6）：465-468.

［14］張新峰，裘福榮，蔣 健，等.LC-MS/MS同時(shí)測(cè)定左金丸和香連丸中6種生物堿的含量［J］.中成藥，2010，32（4）：597-600.

Activity of CYP3A4 influenced by Zuojin Pills taken in healthy Chinese volunteers

LIU Song-can， QIU Fu-rong*， MIAO Ping， ZHU Lei-lei， ZENG Jin， LIQiu-yue， HE Ming，JIANG Jian*
（Department of Clinical Pharmacology，Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional ChineseMedicine，Shanghai201203，China）

Zuojin Pills；CYP3A4；midazolam；herb-drug interaction

R287

：A

：1001-1528（2015）07-1427-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.008

2014-04-18

國(guó)家科技部新藥重大創(chuàng)制項(xiàng)目 （2012ZX09303009-001）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （81173118）；上海中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目 （C10dZ2220200）。

劉松燦，男，博士，研究方向?yàn)橹兴幣R床藥理學(xué)。

*通信作者：裘福榮 （1966—），男，博士，碩士生導(dǎo)師，主任藥師，研究方向?yàn)榕R床藥代動(dòng)力學(xué)。E-mail：Furong_qiu@126.com蔣 ?。?956—），男，博士，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)橹兴幣R床藥理學(xué)。E-mail：jiangjiansg@126.com