肥大細(xì)胞在IgA 腎病中的表達(dá)及致病機(jī)制

王思遠(yuǎn) 嚴(yán) 苗 蘇 可 陳 鋮

IgA 腎病( IgA nephropathy，IgAN) 為臨床常見的一種腎臟疾病，15% ～40%患者最終進(jìn)展至終末期腎衰竭［1］。小管間質(zhì)病變是影響IgAN 進(jìn)展和預(yù)后的重要因素之一［2］。目前已有文獻(xiàn)報道IgAN 患者腎間質(zhì)存在肥大細(xì)胞浸潤，且肥大細(xì)胞數(shù)量與腎纖維化程度存在正相關(guān)關(guān)系［3］。但亦有報道發(fā)現(xiàn)，肥大細(xì)胞可以通過調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞浸潤并抑制去分化減輕腎臟纖維化［4］。本研究通過分析肥大細(xì)胞在IgAN 及其合并腎功能不全患者腎組織中的表達(dá)，并對其作用機(jī)制進(jìn)行探討。

材料與方法

1.病例選?。耗I臟標(biāo)本來源包括：外傷或腎腫瘤腎切除患者的正常腎組織12 例( 正常組) ，IgAN 患者20 例( IgAN 組)及IgAN 合并腎功能不全( 血Cr 值＜200μmol/L) 患者8 例( IgARI 組) 。IgAN 組及IgARI 組標(biāo)本來源于根據(jù)臨床指征進(jìn)行的腎活檢術(shù)。對所有腎組織所進(jìn)行的處理和使用均遵循國家倫理準(zhǔn)則。診斷由腎臟病理醫(yī)師根據(jù)班夫分類系統(tǒng)完成。

2.腎組織肥大細(xì)胞染色和計數(shù)：4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片后用0.1%甲苯胺藍(lán)染色。肥大細(xì)胞的計數(shù)由兩名研究者分別獨(dú)立完成，并記錄為“計數(shù)/平方毫米”。

3.細(xì)胞的培養(yǎng)： 人肥大細(xì)胞系( HMC -1) 購買自青島博康生物技術(shù)有限公司，細(xì)胞完全培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清( 美國Gibco 公司) ，50μmol/L 1 -硫代甘油( 美國Sigma 公司，M6145) 的IMDM 培養(yǎng)基( 美國Gibco 公司) ，在37℃，5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)。體外培養(yǎng)的肥大細(xì)胞分為3 組： 正常組，IL-6 刺激組(10ng/ml 美國Peprotech 公司) 及TNF -α 刺激組(20ng/ml 美國Gemini Bio-products 公司) 。HMC-1 細(xì)胞以2 ×105/ml 的密度在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)6h 后添加相應(yīng)刺激，分別在4、8 及24h 3 個時間點(diǎn)收集細(xì)胞，并在24h 收集無刺激因素肥大細(xì)胞設(shè)為正常對照組。

4.實時定量PCR 檢測腎素mRNA 表達(dá)：Trizol 法提取HMC-1 細(xì)胞總RNA，分離出的RNA 樣品通過Nanodrop 檢測RNA 的純度及含量，ExScriptTMRT 試劑盒合成cDNA 后，采用Taqman 探針技術(shù)進(jìn)行實時定量PCR。腎素探針來源美國life technology 公司，商品號Hs00982555_m1。以GAPDH 設(shè)為內(nèi)參照。

5.免疫印跡法檢測腎素蛋白表達(dá)： 用含有Cocktail( 美國Sigma-Aldrich 公司) 的細(xì)胞裂解液(0.5%脫氧膽酸鈉，0.1%十二烷基硫酸鈉，1%Triton X -100，1mmol/L 苯甲磺酰氟，150mmol/L NaCl，20mmol/L Tris，pH 7.5，5mmol/L 依地酸) 裂解細(xì)胞，13000 ×g 4℃離心，取上清，BCA 法測定蛋白濃度，取等量蛋白12%SDS -PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜( 美國GE Heathcare 公司) ，一抗分別為腎素兔來源多克隆抗體(1∶200，美國Santa Cruz 公司) ，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶10000，美國CST 公司) ，ECL( 美國Santa Cruz 公司) 反應(yīng)，Geldoc( 美國Biorad 公司) 掃描硝酸纖維素膜，之后采用蛋白剝離緩沖液孵育硝酸纖維素膜30min，常規(guī)封閉液封閉后，與GAPDH 小鼠單克隆抗體(1∶20000，美國Santa Cruz 公司)常溫孵育2h，相應(yīng)二抗反應(yīng)后再次顯現(xiàn)掃描，應(yīng)用Gel -Pro Analyzer 4.5 軟件進(jìn)行積分吸光度( A) 分析。

結(jié) 果

1.人腎組織肥大細(xì)胞染色計數(shù)： IgAN 組( 1.890±0.578 個/平方毫米) 及IgANRI 組( 5.450 ±1.435個/平方毫米) 較正常組( 0.230 ±0.187 個/平方毫米) 肥大細(xì)胞均增高( P =0.000) ，IgANRI 組較IgAN組肥大細(xì)胞數(shù)亦增高( P =0.000) 。肥大細(xì)胞主要分布于腎間質(zhì)，特別是纖維化區(qū)域。血管球區(qū)域及小管管腔未見肥大細(xì)胞。肥大細(xì)胞計數(shù)與小管萎縮、間質(zhì)纖維化、球性腎小球硬化存在相關(guān)關(guān)系( 圖1) 。

圖1 人腎組織肥大細(xì)胞計數(shù)( 甲苯胺藍(lán)染色，×400)

2.腎素的定量：正常培養(yǎng)的肥大細(xì)胞即可產(chǎn)生腎素mRNA 及蛋白，IL -6 刺激組及TNF -α 刺激組腎素的表達(dá)較正常組腎素的表達(dá)明顯增多，并呈時間依賴性升高( P ＜0.05，圖2) 。

討 論

IgAN 好發(fā)于青少年，男性多見，以腎小球系膜基質(zhì)與系膜細(xì)胞增殖和( 或) 單核細(xì)胞浸潤為特點(diǎn)，包括4 項主要病理指標(biāo)：系膜細(xì)胞增生、內(nèi)皮細(xì)胞增生、節(jié)段性硬化或粘連及腎小管萎縮或腎間質(zhì)纖維化。近年的研究證實，系膜細(xì)胞分泌炎性因子、活化補(bǔ)體在導(dǎo)致IgA 腎病的病理改變和臨床癥狀中起重要作用［5］。但其具體的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，積極尋找IgAN 致病因素及探討可能的干預(yù)因素對指導(dǎo)臨床治療有重要意義。

在IgAN 中，腎小管間質(zhì)病變較小球病變與疾病的進(jìn)展聯(lián)系更加緊密［6，7］。研究發(fā)現(xiàn)小管間質(zhì)浸潤的肥大細(xì)胞數(shù)量可能是判斷IgAN 預(yù)后的指標(biāo)之一［3］。并且肥大細(xì)胞可通過多種機(jī)制參與腎纖維化的過程［8］，如：肥大細(xì)胞分泌的TGF-β1 已被證實可通過誘導(dǎo)上皮細(xì)胞去分化從而促進(jìn)纖維化的發(fā)生［9］。但亦有研究表明，肥大細(xì)胞缺陷小鼠腎臟α-SMA表達(dá)較野生型小鼠明顯增加，提示肥大細(xì)胞抑制腎臟的纖維化［4，6］。本研究收集臨床腎活檢標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)IgAN 及IgAN 腎功能不全患者腎間質(zhì)存在肥大細(xì)胞浸潤，且肥大細(xì)胞的數(shù)量與小管萎縮、間質(zhì)纖維化、球性腎小球硬化等存在相關(guān)關(guān)系。提示干預(yù)肥大細(xì)胞浸潤至腎組織可能延緩IgAN 患者疾病的進(jìn)展，減緩腎功能減退。

圖2 肥大細(xì)胞腎素的定量

腎素-血管緊張素系統(tǒng)( RAS 系統(tǒng)) 尤其是局部RAS 系統(tǒng)的激活在慢性腎臟損傷中發(fā)揮重要作用［10］。有報道發(fā)現(xiàn)，IgAN 中，腎間質(zhì)浸潤的肥大細(xì)胞在血管緊張素Ⅱ陽性細(xì)胞團(tuán)周圍聚集，血管緊張素Ⅱ陽性細(xì)胞計數(shù)與肥大細(xì)胞計數(shù)呈相關(guān)關(guān)系，并同時發(fā)現(xiàn)，肥大細(xì)胞本身并不能表達(dá)血管緊張素Ⅱ［11］。提示肥大細(xì)胞與局部RAS 激活存在一定聯(lián)系。最近研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷中，心肌肥大細(xì)胞分泌腎素，激活RAS 系統(tǒng)，從而引起心率失常的發(fā)生［12，13］。本研究通過體外培養(yǎng)肥大細(xì)胞，采用實時定量PCR及免疫印跡兩種方法證實，肥大細(xì)胞可表達(dá)腎素基因及蛋白，可參與局部RAS 系統(tǒng)的激活。并且，在炎性因子IL-6 和TNF -α 刺激下，肥大細(xì)胞腎素mRNA及蛋白的表達(dá)呈時間梯度增加。提示IgA 腎病中，系膜細(xì)胞分泌的炎性因子可通過增加肥大細(xì)胞腎素的表達(dá)，加重病理改變。對IgAN 的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的闡明。

綜上所述，肥大細(xì)胞在IgAN 的疾病進(jìn)展中起促進(jìn)作用。其中，系膜細(xì)胞分泌炎性因子刺激肥大細(xì)胞表達(dá)腎素，激活RAS 系統(tǒng)，導(dǎo)致進(jìn)一步的病理改變和臨床癥狀。減輕炎性反應(yīng)、干預(yù)肥大細(xì)胞浸潤至腎組織及調(diào)節(jié)局部腎素表達(dá)可能是IgAN 患者治療的新靶標(biāo)。

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