響應(yīng)面法優(yōu)化野菊花中綠原酸的提取工藝

張明明+黃芳+張長(zhǎng)麗

摘要：以野菊花為原料，研究綠原酸最佳提取工藝條件。在乙醇濃度、液固比、提取時(shí)間等單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，應(yīng)用響應(yīng)面分析法對(duì)野菊花中綠原酸提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，超聲波輔助提取野菊花中綠原酸的最佳工藝條件為：乙醇濃度80%、液固比26mL∶1g、提取時(shí)間35min。在該條件下，綠原酸實(shí)際提取率達(dá)2.32%，與模型預(yù)測(cè)值（2.35%）接近。

關(guān)鍵詞：野菊花；綠原酸；超聲波提??；響應(yīng)曲面法

中圖分類號(hào)：R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）11-0327-03

野菊花（Chrysanthemumindicum）別稱山菊花、甘菊花，為菊科多年生草本植物，外形與菊花相似，野生于山坡草地、田邊路旁，具有疏風(fēng)清熱、消腫散熱、抗菌消炎、降血壓等多種藥理作用[1-2]。綠原酸是菊花中的一種重要成分，屬酚類化合物，具有抗菌、降壓、降脂、抗病毒、抗腫瘤、保肝利膽、促進(jìn)腸道蠕動(dòng)、清除自由基、興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種生物活性，是菊科植物中的主要藥理成分之一[3-6]。目前，綠原酸提取工藝主要有水浴提取法、乙醇回流法、超聲提取法、微波提取法、超臨界流體萃取法等[7-10]。本試驗(yàn)采用超聲波輔助提取野菊花中綠原酸，并用響應(yīng)面試驗(yàn)法對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為工業(yè)化提取野菊花中綠原酸提供了參考。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

AUY120電子天平（日本島津）；UV2450紫外分光光度計(jì)（日本島津）；KQ-200KDB高功率速控超聲清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器設(shè)備有限公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（河南鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）。

野菊花購(gòu)于南京中藥材市場(chǎng)，去除苞片后35℃干燥，粉碎，過(guò)40目篩，備用。綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所），無(wú)水乙醇（分析純），試驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1綠原酸的提取工藝

準(zhǔn)確稱取2g干燥的野菊花粉末于燒杯中，加入80%乙醇溶液，在超聲清洗器中超聲提取，設(shè)置一定的超聲溫度、超聲功率、超聲時(shí)間，提取一定次數(shù)后過(guò)濾。濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，定容至50mL，得到綠原酸提取液，測(cè)定其吸光度，分析綠原酸含量，計(jì)算綠原酸提取率。

1.2.2綠原酸含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，用乙醇配制成濃度為0.1mg/mL的儲(chǔ)備液。分別吸取上述溶液0.10、0.30、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50mL于10mL容量瓶中，定容搖勻。以乙醇為參照，在綠原酸的最大吸收波長(zhǎng)327nm下依次測(cè)定吸光度。以綠原酸濃度C為橫坐標(biāo)、吸光度D為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為D=41.757C+0.0387，相關(guān)系數(shù)r=0.9991，可見(jiàn)綠原酸濃度在0.001～0.025mg/mL范圍內(nèi)與吸光度D呈良好的線性關(guān)系。將提取的綠原酸稀釋一定倍數(shù)，再在327nm下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及公式（1）計(jì)算綠原酸的提取率（y）：

式中：C表示綠原酸濃度，mg/mL；V表示體積，L；n表示稀釋倍數(shù)；m表示野菊花粉末的質(zhì)量，g。

1.2.3單因素試驗(yàn)分別以乙醇濃度、液固比、超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率等為因素，考察各因素對(duì)綠原酸提取率的影響。

1.2.4響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度、液固比、提取時(shí)間3個(gè)因素作為考察對(duì)象，以綠原酸提取率為響應(yīng)值，采用DsignExpert7.0統(tǒng)計(jì)分析軟件中的Box-behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。具體試驗(yàn)因素水平及編碼見(jiàn)表1。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1乙醇濃度對(duì)綠原酸提取率的影響

由圖1可知，隨乙醇濃度的增加，綠原酸提取率先迅速增加后降低。當(dāng)乙醇濃

度為80%時(shí)，提取率最高，達(dá)1.66%；此后乙醇濃度再增加，提取率降低。說(shuō)明野菊花中綠原酸在濃度為80%的乙醇中溶解度最大，因此乙醇濃度選擇80%。

2.1.2液固比對(duì)綠原酸提取率的影響

由圖2可知，綠原酸提取率隨液固比的增加而上升。當(dāng)液固比為26mL∶1g時(shí)，提取率最高，為2.31%；此后再增加液固比，提取率反而下降，也會(huì)給后序工藝帶來(lái)困難，因此最終確定液固比為26mL∶1g。

2.1.3超聲時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響

由圖3所示，超聲10～30min時(shí)，隨著超聲時(shí)間的增加，綠原酸提取率呈上升趨勢(shì)，至超聲30min時(shí)，提取率最高；當(dāng)超聲時(shí)間在30～50min時(shí)，提取率趨于穩(wěn)定不再發(fā)生變化；此后，超聲時(shí)間增加到60min，因提取時(shí)間太長(zhǎng)，綠原酸分解，提取率反而減小。所以提取時(shí)間宜選擇30min。

2.1.4提取溫度對(duì)綠原酸提取率的影響

從圖4可以看出，隨著提取溫度的增加，綠原酸提取率增加。當(dāng)提取溫度達(dá)35℃時(shí)，提取率最高，為2.47%；此后再提高超聲溫度，提取率反而下降，可能是由于溫度過(guò)高導(dǎo)致綠原酸發(fā)生分解[11]。因此，提取溫度宜選擇35℃。

2.1.5超聲功率對(duì)綠原酸提取率的影響

由圖5可知，綠原酸的提取率隨著超聲功率的增加顯著上升，當(dāng)超聲功率達(dá)200W時(shí)，提取率最高，為1.35%。由此可見(jiàn)，超聲功率越高，綠原酸析出越充分，因此超聲功率選擇200W。

2.1.6提取次數(shù)對(duì)綠原酸提取率的影響

由圖6可知，隨著提取次數(shù)的增加，綠原酸提取率逐漸減小。當(dāng)提取1次時(shí)，提取率最高，為2.99%；另外從提取成本考慮，宜選擇提取1次。

2.2響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化綠原酸提取工藝endprint

2.2.1綠原酸提取試驗(yàn)方案及方差分析

根據(jù)Box-behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇濃度、液固比和超聲時(shí)間3個(gè)對(duì)綠原酸提取率影響較大的因素，對(duì)提取工藝條件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，回歸模型的方差分析見(jiàn)表3。

3個(gè)因素經(jīng)擬合得到綠原酸提取率回歸方程：y=2.34+0.021A+0.023B+0.086C+0.095AB+0.022AC+0.025BC-0.25A2-0.25B2-0.25C2。表3顯示，方程的R2為0.9986，說(shuō)明該模型達(dá)極顯著水平（P<0.0001），失擬項(xiàng)在0.10水平上不顯著（P>0.10）。R2Adj為0.9967，說(shuō)明建立的模型能夠解釋99.67%響應(yīng)值的變化，可見(jiàn)回歸方程擬合度和可信度均很高，試驗(yàn)誤差較小。

根據(jù)回歸方程作響應(yīng)面圖，考察所擬合的響應(yīng)面形狀，分析各提取條件對(duì)綠原酸提取率的影響，響應(yīng)面圖如圖7所示，3組圖直觀地反映了乙醇濃度、液固比、超聲時(shí)間3個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響。結(jié)合回歸方程及圖7可以看出，各試驗(yàn)因素對(duì)提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線性影響。各因素對(duì)提取率影響

程度從強(qiáng)到弱依次為提取時(shí)間>液固比>乙醇濃度，其中提取時(shí)間對(duì)提取率的影響極顯著（P<0.0001）。

2.2.2模型的優(yōu)化和驗(yàn)證

為檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，進(jìn)一步確定最佳工藝條件，通過(guò)軟件求解方程得最佳提取工藝條件為：乙醇濃度80.317%，液固比26.26mL∶1g，超聲時(shí)間35.80min，此時(shí)綠原酸提取率可達(dá)2.35%。為檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，考慮到實(shí)際操作的便利，將最佳工藝條件修正為：乙醇濃度80%、液固比26mL∶1g、超聲時(shí)間35min進(jìn)行提取試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得綠原酸提取率為2.32%，與預(yù)測(cè)值基本接近，證明響應(yīng)曲面法優(yōu)化菊花中綠原酸提取工藝參數(shù)的可行性。

3結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用DesignExpert7.0設(shè)計(jì)軟件優(yōu)化野菊花中綠原酸的提取工藝。根據(jù)回歸方程得到綠原酸的最佳提取工藝為：乙醇濃度80%，液固比26mL∶1g，提取時(shí)間35min。在此條件下，綠原酸的的提取率為2.32%，與理論值（2.35%）基本一致，說(shuō)明該模型能很好地預(yù)測(cè)綠原酸提取條件與提取率之間的關(guān)系。

參考文獻(xiàn)：[HJ1.45mm]

[1]周虹云，吳長(zhǎng)順，程存歸.野菊花化學(xué)成分研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2013，30（1）：31-35.

[2]黃芳，周宏，李健.響應(yīng)曲面法優(yōu)化野菊花中黃色素提取工藝[J].食品工業(yè)，2012，33（12）：1-4.

[3]吳江濤.綠原酸的生物活性及其應(yīng)用[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009（19）：349-350.

[4]郭秋娟，金邦荃，陳和平.綠原酸生物活性與提取方法的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2009，30（8）：346-348.

[5]王輝，田呈瑞，馬守磊，等.綠原酸的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2009，30（5）：341-345.

[6]褚福紅，陸寧，于新，等.響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取野菊花抗氧化物質(zhì)[J].食品科學(xué)，2010，31（24）：90-94.

[7]烏蘭，張澤生.金銀花中綠原酸的提取及檢測(cè)[J].食品科學(xué)，2005，26（6）：130-134.

[8]杜延兵，裘愛(ài)泳.綠原酸生物活性、資源及其提取純化[J].現(xiàn)代食品科技，2006，22（2）：250-252.

[9]凌佇怡，王娟，沈平孃.野菊花中綠原酸的微波輔助萃取研究[J].中草藥，2008，39（1）：60-62.

[10]王雪梅，蔣麗，袁紅江，等.金銀花中綠原酸提取濃縮工藝[J].重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，25（3）：47-50.

[11]李繼睿，禹練英，楊孝輝，等.超臨界流體萃取野菊花中綠原酸提取工藝[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2012，33（9）：30-32.endprint

2.2.1綠原酸提取試驗(yàn)方案及方差分析

根據(jù)Box-behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇濃度、液固比和超聲時(shí)間3個(gè)對(duì)綠原酸提取率影響較大的因素，對(duì)提取工藝條件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，回歸模型的方差分析見(jiàn)表3。

3個(gè)因素經(jīng)擬合得到綠原酸提取率回歸方程：y=2.34+0.021A+0.023B+0.086C+0.095AB+0.022AC+0.025BC-0.25A2-0.25B2-0.25C2。表3顯示，方程的R2為0.9986，說(shuō)明該模型達(dá)極顯著水平（P<0.0001），失擬項(xiàng)在0.10水平上不顯著（P>0.10）。R2Adj為0.9967，說(shuō)明建立的模型能夠解釋99.67%響應(yīng)值的變化，可見(jiàn)回歸方程擬合度和可信度均很高，試驗(yàn)誤差較小。

根據(jù)回歸方程作響應(yīng)面圖，考察所擬合的響應(yīng)面形狀，分析各提取條件對(duì)綠原酸提取率的影響，響應(yīng)面圖如圖7所示，3組圖直觀地反映了乙醇濃度、液固比、超聲時(shí)間3個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響。結(jié)合回歸方程及圖7可以看出，各試驗(yàn)因素對(duì)提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線性影響。各因素對(duì)提取率影響

程度從強(qiáng)到弱依次為提取時(shí)間>液固比>乙醇濃度，其中提取時(shí)間對(duì)提取率的影響極顯著（P<0.0001）。

2.2.2模型的優(yōu)化和驗(yàn)證

為檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，進(jìn)一步確定最佳工藝條件，通過(guò)軟件求解方程得最佳提取工藝條件為：乙醇濃度80.317%，液固比26.26mL∶1g，超聲時(shí)間35.80min，此時(shí)綠原酸提取率可達(dá)2.35%。為檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，考慮到實(shí)際操作的便利，將最佳工藝條件修正為：乙醇濃度80%、液固比26mL∶1g、超聲時(shí)間35min進(jìn)行提取試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得綠原酸提取率為2.32%，與預(yù)測(cè)值基本接近，證明響應(yīng)曲面法優(yōu)化菊花中綠原酸提取工藝參數(shù)的可行性。

3結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用DesignExpert7.0設(shè)計(jì)軟件優(yōu)化野菊花中綠原酸的提取工藝。根據(jù)回歸方程得到綠原酸的最佳提取工藝為：乙醇濃度80%，液固比26mL∶1g，提取時(shí)間35min。在此條件下，綠原酸的的提取率為2.32%，與理論值（2.35%）基本一致，說(shuō)明該模型能很好地預(yù)測(cè)綠原酸提取條件與提取率之間的關(guān)系。

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[11]李繼睿，禹練英，楊孝輝，等.超臨界流體萃取野菊花中綠原酸提取工藝[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2012，33（9）：30-32.endprint

2.2.1綠原酸提取試驗(yàn)方案及方差分析

根據(jù)Box-behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇濃度、液固比和超聲時(shí)間3個(gè)對(duì)綠原酸提取率影響較大的因素，對(duì)提取工藝條件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，回歸模型的方差分析見(jiàn)表3。

3個(gè)因素經(jīng)擬合得到綠原酸提取率回歸方程：y=2.34+0.021A+0.023B+0.086C+0.095AB+0.022AC+0.025BC-0.25A2-0.25B2-0.25C2。表3顯示，方程的R2為0.9986，說(shuō)明該模型達(dá)極顯著水平（P<0.0001），失擬項(xiàng)在0.10水平上不顯著（P>0.10）。R2Adj為0.9967，說(shuō)明建立的模型能夠解釋99.67%響應(yīng)值的變化，可見(jiàn)回歸方程擬合度和可信度均很高，試驗(yàn)誤差較小。

根據(jù)回歸方程作響應(yīng)面圖，考察所擬合的響應(yīng)面形狀，分析各提取條件對(duì)綠原酸提取率的影響，響應(yīng)面圖如圖7所示，3組圖直觀地反映了乙醇濃度、液固比、超聲時(shí)間3個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響。結(jié)合回歸方程及圖7可以看出，各試驗(yàn)因素對(duì)提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線性影響。各因素對(duì)提取率影響

程度從強(qiáng)到弱依次為提取時(shí)間>液固比>乙醇濃度，其中提取時(shí)間對(duì)提取率的影響極顯著（P<0.0001）。

2.2.2模型的優(yōu)化和驗(yàn)證

為檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，進(jìn)一步確定最佳工藝條件，通過(guò)軟件求解方程得最佳提取工藝條件為：乙醇濃度80.317%，液固比26.26mL∶1g，超聲時(shí)間35.80min，此時(shí)綠原酸提取率可達(dá)2.35%。為檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，考慮到實(shí)際操作的便利，將最佳工藝條件修正為：乙醇濃度80%、液固比26mL∶1g、超聲時(shí)間35min進(jìn)行提取試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得綠原酸提取率為2.32%，與預(yù)測(cè)值基本接近，證明響應(yīng)曲面法優(yōu)化菊花中綠原酸提取工藝參數(shù)的可行性。

3結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用DesignExpert7.0設(shè)計(jì)軟件優(yōu)化野菊花中綠原酸的提取工藝。根據(jù)回歸方程得到綠原酸的最佳提取工藝為：乙醇濃度80%，液固比26mL∶1g，提取時(shí)間35min。在此條件下，綠原酸的的提取率為2.32%，與理論值（2.35%）基本一致，說(shuō)明該模型能很好地預(yù)測(cè)綠原酸提取條件與提取率之間的關(guān)系。

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