卡尼鄂拉蜂工蜂咽下腺解剖形態(tài)學和超微結(jié)構(gòu)研究

吉挺+沈芳+劉振國

摘要：為了分析卡尼鄂拉蜂（Apismelliferacarnica）工蜂咽下腺發(fā)育的不同階段解剖形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，探討咽下腺在工蜂分泌王漿過程中的細胞學機制，運用掃描電鏡和透射電鏡方法比較分析5個不同日齡內(nèi)勤蜂（3、6、9、12、16日齡）和3個不同階段越冬蜂（越冬階段、春繁階段、淘汰階段）工蜂小囊發(fā)育飽滿程度和細胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，3日齡工蜂咽下腺小囊發(fā)育尚未完全，而線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器已經(jīng)出現(xiàn)；9日齡工蜂咽下腺小囊直徑極顯著大于其他日齡內(nèi)勤蜂工蜂（P<0.01），發(fā)育最為飽滿，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、導管等細胞器成分也最為豐富；春繁階段越冬蜂工蜂咽下腺小囊直徑極顯著大于其他階段越冬蜂（P<0.01），與9日齡工蜂相比差異不顯著（P>0.05），但細胞器數(shù)量較9日齡有所下降；淘汰階段越冬蜂和16日齡工蜂咽下腺細胞出現(xiàn)崩解現(xiàn)象。說明卡蜂咽下腺小囊總體發(fā)育較為遲緩；伴隨蜂王漿分泌，內(nèi)勤蜂和越冬蜂咽下腺小囊發(fā)育均呈現(xiàn)“飽滿—萎縮”的發(fā)育規(guī)律；多個細胞器參與蜂王漿的合成和分泌，細胞器豐富程度反映出工蜂泌漿能力的高低。

關(guān)鍵詞：卡尼鄂拉蜂；咽下腺；掃描電鏡；透射電鏡

中圖分類號：S891+.3文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）11-0247-04

咽下腺位于工蜂頭腔內(nèi)，是1對高度盤繞的長串葡萄狀腺體，每條腺體包括1根分泌導管和數(shù)以百計的囊泡[1]。作為蜜蜂工蜂特有的蜂王漿合成分泌的主要組織[2-3]，承擔著蜂王漿主要營養(yǎng)成分如蛋白質(zhì)、糖類及脂類物質(zhì)的分泌職能。咽下腺自1956年被命名以來，其發(fā)育形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的研究有了長足的發(fā)展。曾志將等比較意蜂與中蜂咽下腺小囊大小、長度和寬度差異，發(fā)現(xiàn)同品種間各日齡內(nèi)勤蜂咽下腺小囊數(shù)量差異不顯著，而意蜂咽下腺小囊平均數(shù)量比中蜂多61.3%，長度長35.7%，寬度差異不顯著，并且意蜂咽下腺小囊細胞的細胞器更豐富[4]。Knecht等通過對蜜蜂咽下腺顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，工蜂羽化出房后，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)迅速增多，8日齡工蜂達到最大；外勤蜂粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少，與咽下腺分泌活性相一致[5]。胡福良等對產(chǎn)漿量不同的3種意蜂不同日齡工蜂咽下腺的超微結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)，高產(chǎn)漿性能的浙農(nóng)大1號意蜂咽下腺小囊數(shù)量較之王漿低產(chǎn)意蜂品種高出14.7%，且細胞線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、分泌顆粒等結(jié)構(gòu)豐富，初步揭示了王漿高產(chǎn)性能和咽下腺細胞超微結(jié)構(gòu)、分泌生理機制之間的關(guān)系[6]。Deseyn等發(fā)現(xiàn)，3日齡的工蜂咽下腺小囊已經(jīng)存在，到6日齡時最為發(fā)達，隨后小囊數(shù)量開始減少，而21日齡采集蜂咽下腺小囊消失，頭部只存在其萎縮退化的結(jié)構(gòu)，不再分泌蜂王漿；越冬蜂咽下腺小囊中有大量的分泌囊泡，其中儲備的分泌物將在春繁時用以飼喂幼蟲[7]。蘇松坤等通過對不同日齡漿蜂咽下腺小囊計數(shù)和顯微形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)4～17日齡的漿蜂咽下腺小囊均有乳白色分泌物產(chǎn)生，泌漿期較原意長7～8d，從形態(tài)學角度闡述了漿蜂王漿高產(chǎn)的原因[8]。杜芝蘭通過對中華蜜蜂工蜂咽下腺的超微結(jié)構(gòu)觀察，描述了粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復合體、線粒體、分泌塊等細胞器的形態(tài)結(jié)構(gòu)和分泌導管，基本闡明中蜂王漿的合成及轉(zhuǎn)運途徑[9]。馬衛(wèi)華等對意蜂咽下腺結(jié)構(gòu)和功能進行了分析，推斷咽下腺具有分泌王漿和消化酶的功能[10]。

咽下腺分泌活性受蜂群結(jié)構(gòu)、氣候、日齡等因素的影響。一般認為在群勢正常、群體結(jié)構(gòu)完整蜂群中，6～12日齡內(nèi)勤蜂咽下腺充分發(fā)育，分泌活性最為活躍，承擔飼喂小幼蟲和蜂王工作。Knecht等通過免疫組化技術(shù)檢測工蜂咽下腺小囊內(nèi)王漿蛋白含量，發(fā)現(xiàn)8日齡蛋白含量最多，表明咽下腺在8日齡前后分泌活性最強。越冬蜂在蜂群越冬期間不承擔哺育與采集任務，其咽下腺分泌活性得到最大程度保留[5]。在越冬蜂咽下腺中檢測到少量王漿蛋白存在，表明越冬蜂咽下腺始終攜帶有王漿蛋白[5]；到春繁階段后因受到幼蟲食物（蜂花粉）和蜂王恢復產(chǎn)卵等外界環(huán)境因素的影響，越冬蜂泌漿行為又將開啟，并表現(xiàn)出足夠的哺育幼蟲能力，直至有新的內(nèi)勤蜂出房加以替代[7]。由此可知在正常蜂群中，西方蜜蜂工蜂咽下腺分泌王漿應在內(nèi)勤蜂6～12日齡與越冬蜂春繁階段。

卡尼鄂拉蜂（簡稱卡蜂，拉丁學名Apismelliferacarnica）是我國除意蜂之外分布最廣的西方蜜蜂地理亞種。作為王漿低產(chǎn)品種，其咽下腺發(fā)育機制被研究者所忽視。通過對卡蜂不同發(fā)育時期咽下腺形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)，對比較不同產(chǎn)漿性能蜂種咽下腺發(fā)育差異更具意義。

基于上述觀點，筆者采集了卡蜂咽下腺泌漿前后5個不同日齡（3、6、9、12、16日齡）的內(nèi)勤蜂及3個不同階段（越冬階段、春繁階段和淘汰階段）的越冬蜂，分別研究其咽下腺發(fā)育形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)，以期闡明咽下腺發(fā)育和應答調(diào)節(jié)機制，為研究咽下腺在蜜蜂社會分工中的作用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

本研究所用的卡蜂單雄授精蜂王由吉林省養(yǎng)蜂科學研究所提供，蜂群由揚州大學實驗蜂場試驗場組織，飼養(yǎng)期間提供充足的糖水和花粉，周邊有零星的油菜蜜源。

對新羽化出房工蜂背部進行標記，在2013年5月采集3、6、9、12、16日齡的內(nèi)勤蜂，2014年1—3月采集越冬階段（winterbee，1月中旬）、春繁階段（springmultiplicationbee，2月中旬）和淘汰階段（retiredbee，2月底）工蜂。每個時間點各取30只，于解剖鏡下迅速解剖咽下腺，置于2.5%戊二醛中，4℃保存。

1.2主要試劑和儀器

1.2.1主要試劑配制0.2mol/L磷酸緩沖液：精確稱量NaH2PO4·H2O5.2g、Na2HPO4·12H2O58g，加雙蒸水定容至1L，pH值調(diào)至7.4。2.5%戊二醛：量取25%戊二醛母液10mL，加入0.2mol/L磷酸緩沖液40mL，加雙蒸水定容到100mL。1%OsO4：將裝有1gOsO4的安瓿瓶洗凈，放入裝有100mL水的棕色試劑瓶中，在通風櫥內(nèi)把安瓿瓶敲破，配制成1%水溶液（提前配制，4℃密封保存）。endprint

1.2.2主要設(shè)備PS48型體視顯微鏡（上海光學儀器廠）；刻蝕鍍膜儀（BAL-TECsputtercoater，SCD500）；HitachiHCP-2型臨界點干燥儀（Hitachi公司）；XL-30ESEM型環(huán)境掃描電子顯微鏡（Philips公司）；Tecnai12型透射電子顯微鏡（Philips公司）；RM2235型徠卡超薄切片機（LeicaBiosystems公司）。

1.3研究方法

1.3.1掃描電鏡（SEM）將剖取的咽下腺（15頭）迅速轉(zhuǎn)移到2.5%戊二醛固定液中（4℃，2h）保存，以盡可能保持細胞原有生活狀態(tài)，減少組織結(jié)構(gòu)變化。經(jīng)PBS清洗3次，15min/次，1%OsO4固定后再用PBS清洗3次，15min/次，再經(jīng)系列濃度乙醇[50%、70%、80%、90%、100%、100%（加無水硫酸鈉）]脫水，每濃度15min，經(jīng)乙酸戊酯∶乙醇=1∶1處理30min后轉(zhuǎn)入純戊酯中處理30min，然后經(jīng)CO2臨界點干燥24h，樣品處理結(jié)束。將樣品粘到載物片上，經(jīng)表面鍍膜處理后電鏡觀察（揚州大學測試中心），腺泡小囊直徑測量和發(fā)育程度評價為形態(tài)學觀察提供依據(jù)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS16.0的t檢驗。

1.3.2透射電鏡（TEM）樣本經(jīng)戊二醛固定液中（4℃，2h），經(jīng)PBS清洗3次，15min/次，1%OsO4固定后再用PBS清洗3次，15min/次，系列濃度乙醇（50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇）逐級脫水，乙醇∶丙酮=1∶1、100%丙酮各15min，包埋劑與丙酮的混合液（體積比1∶1）處理樣品1h，用包埋劑與丙酮的混合液（體積比3∶1）處理樣品3h，純包埋劑處理樣品過夜。將經(jīng)過滲透處理的樣品包埋起來，70℃加熱過夜，即得到包埋好的樣品。樣品在Leica超薄切片機中切片，獲得70～90nm的切片，該切片經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色15min，即可在透射電鏡中觀察。

2結(jié)果與分析

2.1不同日齡工蜂咽下腺形態(tài)學掃描電鏡觀察

掃描電鏡結(jié)果（圖1）表明，隨著日齡的增大，內(nèi)勤蜂咽下腺小囊直徑總體上呈現(xiàn)“飽滿—萎縮”的趨勢。3日齡工蜂咽下腺發(fā)育尚未完全，呈不規(guī)則囊泡狀結(jié)構(gòu)，表面褶皺，無法對其小囊直徑進行測量。隨后咽下腺小囊逐步發(fā)育，6日齡工蜂咽下腺小囊形狀規(guī)則，表面光滑，大小不一，排列稀疏；9日齡工蜂咽下腺小囊排列緊密，發(fā)育最為飽滿，小囊直徑極顯著大于其他日齡內(nèi)勤蜂階段（P<0.01，n≥34）（圖2）。12、16日齡咽下腺小囊直徑下降，6、12、16日齡之間無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。

越冬蜂不同階段咽下腺小囊直徑變化規(guī)律與前者相似，咽下腺小囊直徑在春繁階段達到最大值，與9日齡工蜂差異不顯著（P>0.05），較越冬蜂和淘汰蜂有顯著的統(tǒng)計學意義（P<0.01，n≥34）。越冬階段工蜂咽下腺小囊發(fā)育飽滿，直徑近似于16日齡，但排列松散，且形狀不規(guī)則；春繁階段工蜂咽下腺小囊排列緊密，并相互擠壓成簇，囊泡分支較多；淘汰階段工蜂咽下腺小囊出現(xiàn)脫落和崩解。

2.2不同日齡工蜂咽下腺超微結(jié)構(gòu)透射電鏡觀察

透射電鏡結(jié)果（圖3）顯示，3日齡工蜂咽下腺小囊細胞內(nèi)線粒體較為豐富，并出現(xiàn)分泌顆粒，表明此階段細胞較為活躍，可能已經(jīng)合成王漿蛋白，并以分泌顆粒的形式，存儲在分泌泡中[9]。6日齡出現(xiàn)了粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和胞外管，表明蛋白質(zhì)合成轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)育完善，為后續(xù)王漿分泌高峰期打下基礎(chǔ)。9日齡的線粒體明顯增多，分布較為分散，出現(xiàn)大量的存儲泡和分泌顆粒，大小不一，著色較深，占據(jù)細胞的大部分體積，呈現(xiàn)聚集現(xiàn)象。12日齡小囊細胞體積萎縮，線粒體數(shù)量減少，細胞質(zhì)出現(xiàn)了空泡結(jié)構(gòu)。16日齡中幾乎沒有線粒體出現(xiàn)，核仁增大，溶酶體數(shù)量增多。

越冬蜂在其越冬階段，工蜂咽下腺小囊細胞形態(tài)與16日齡相似，排列緊密，細胞器較少；春繁階段，工蜂咽下腺小囊細胞內(nèi)線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和分泌顆粒增多，胞外導管發(fā)達，但和內(nèi)勤蜂9日齡相比，細胞器排列相對較為稀疏，且細胞器的數(shù)量也較少；越冬蜂在淘汰階段，細胞結(jié)構(gòu)明顯不完整，細胞質(zhì)偏移，出現(xiàn)了崩解現(xiàn)象。

3討論

電鏡技術(shù)越來越多地應用到了生物樣本組織結(jié)構(gòu)變化、超微結(jié)構(gòu)觀察等分析中，為在生理調(diào)節(jié)過程等生物學研究提供形態(tài)依據(jù)，在生命科學研究領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。

掃描電鏡結(jié)果表明，3日齡卡蜂工蜂咽下腺尚未發(fā)育完全，存在很多皺褶，形態(tài)不規(guī)則，無法準確測量小囊直徑和進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。而馮毛在對1日齡的漿蜂和原意工蜂頭部解剖中都發(fā)現(xiàn)了發(fā)育較為完備的咽下腺[11]，表明意蜂內(nèi)勤蜂咽下腺較卡蜂發(fā)育早。和意蜂相比，卡蜂的工蜂泌漿能力較低，可能與其咽下腺發(fā)育遲緩有一定關(guān)系。3日齡的工蜂不承擔王漿分泌工作[12]，但透射電鏡結(jié)果顯示，3日齡卡蜂的咽下腺小囊細胞內(nèi)已出現(xiàn)了數(shù)量較多的線粒體，可能此時小囊內(nèi)已有王漿合成，此結(jié)果與Knecht研究結(jié)果[5]相似；同時透射電鏡未見細胞間的分泌導管結(jié)構(gòu)，表明3日齡工蜂咽下腺小囊內(nèi)有王漿合成，但不能分泌王漿，其現(xiàn)有細胞結(jié)構(gòu)將為后續(xù)日齡工蜂咽下腺大量合成和分泌蛋白質(zhì)提供支持。

在工蜂社會分工中，6～12日齡是其分泌王漿、飼喂小幼蟲的時期。電鏡結(jié)果表明，從6日齡始，工蜂咽下腺小囊漸變飽滿，細胞結(jié)構(gòu)和細胞器出現(xiàn)相應改變，具體表現(xiàn)在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細胞器漸變豐富，存儲泡和轉(zhuǎn)運導管大量出現(xiàn)，其中以9日齡最為顯著。9日齡工蜂咽下腺小囊直徑最大（P<0.01），各種與蛋白合成與分泌相關(guān)的細胞器最為豐富，表明在此日齡王漿蛋白得到充分合成并存儲在細胞內(nèi)的存儲泡，使咽下腺小囊膨大。而到16日齡，咽下腺小囊細胞內(nèi)出現(xiàn)較多的溶酶體，細胞結(jié)構(gòu)的完整性被破壞，細胞崩解，細胞功能喪失，導致王漿蛋白合成和分泌功能喪失，在形態(tài)學上體現(xiàn)為小囊萎縮。由此可見，內(nèi)勤蜂咽下腺小囊細胞器的豐富程度變化與其分泌王漿活性是一致的。endprint

同樣越冬蜂在其越冬階段里，工蜂咽下腺形態(tài)飽滿，但細胞器結(jié)構(gòu)較少，僅有少量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體結(jié)構(gòu)，蜂群內(nèi)囚王限卵的狀態(tài)制約著越冬蜂咽下腺分泌王漿的活性，使其泌漿行為趨于停滯[13]。而春繁階段越冬蜂在幼蟲信號和采食花粉等營養(yǎng)物質(zhì)的刺激下，細胞內(nèi)蛋白合成和分泌相關(guān)細胞器結(jié)構(gòu)豐富，使咽下腺小囊膨大，咽下腺呈現(xiàn)分泌活性。但越冬蜂在春繁階段咽下腺小囊細胞器水平低于9日齡工蜂，表明春繁階段工蜂王漿合成和分泌的能力較9日齡工蜂低，這一點與春繁蜂飼喂養(yǎng)能力不如適齡工蜂強[14]相一致。由此，不同日齡、不同階段工蜂的飼喂能力差異在電鏡分析得到合理解釋。

綜上所述，通過對卡蜂咽下腺小囊外部形態(tài)和細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)電鏡分析表明，卡蜂工蜂咽下腺小囊總體發(fā)育較為遲緩，隨著日齡增加，咽下腺小囊直徑呈現(xiàn)“飽滿—萎縮”的趨勢，細胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)“漸變增多—逐漸減少”的變化。不同日齡內(nèi)勤蜂中，9日齡工蜂咽下腺小囊直徑最大，細胞器水平最高；在越冬蜂中，春繁階段工蜂咽下腺小囊直徑最大，細胞器水平最高，但其細胞器水平均低于9日齡工蜂，表明咽下腺小囊內(nèi)細胞器的水平反映了蜜蜂泌漿能力的高低。

致謝：感謝吉林省養(yǎng)蜂科學研究所薛運波所長、牛慶生研究員為本試驗提供卡尼鄂拉蜂蜂王；感謝揚州大學測試中心老師對本試驗電鏡數(shù)據(jù)采集的指導和幫助。

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同樣越冬蜂在其越冬階段里，工蜂咽下腺形態(tài)飽滿，但細胞器結(jié)構(gòu)較少，僅有少量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體結(jié)構(gòu)，蜂群內(nèi)囚王限卵的狀態(tài)制約著越冬蜂咽下腺分泌王漿的活性，使其泌漿行為趨于停滯[13]。而春繁階段越冬蜂在幼蟲信號和采食花粉等營養(yǎng)物質(zhì)的刺激下，細胞內(nèi)蛋白合成和分泌相關(guān)細胞器結(jié)構(gòu)豐富，使咽下腺小囊膨大，咽下腺呈現(xiàn)分泌活性。但越冬蜂在春繁階段咽下腺小囊細胞器水平低于9日齡工蜂，表明春繁階段工蜂王漿合成和分泌的能力較9日齡工蜂低，這一點與春繁蜂飼喂養(yǎng)能力不如適齡工蜂強[14]相一致。由此，不同日齡、不同階段工蜂的飼喂能力差異在電鏡分析得到合理解釋。

綜上所述，通過對卡蜂咽下腺小囊外部形態(tài)和細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)電鏡分析表明，卡蜂工蜂咽下腺小囊總體發(fā)育較為遲緩，隨著日齡增加，咽下腺小囊直徑呈現(xiàn)“飽滿—萎縮”的趨勢，細胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)“漸變增多—逐漸減少”的變化。不同日齡內(nèi)勤蜂中，9日齡工蜂咽下腺小囊直徑最大，細胞器水平最高；在越冬蜂中，春繁階段工蜂咽下腺小囊直徑最大，細胞器水平最高，但其細胞器水平均低于9日齡工蜂，表明咽下腺小囊內(nèi)細胞器的水平反映了蜜蜂泌漿能力的高低。

致謝：感謝吉林省養(yǎng)蜂科學研究所薛運波所長、牛慶生研究員為本試驗提供卡尼鄂拉蜂蜂王；感謝揚州大學測試中心老師對本試驗電鏡數(shù)據(jù)采集的指導和幫助。

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同樣越冬蜂在其越冬階段里，工蜂咽下腺形態(tài)飽滿，但細胞器結(jié)構(gòu)較少，僅有少量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體結(jié)構(gòu)，蜂群內(nèi)囚王限卵的狀態(tài)制約著越冬蜂咽下腺分泌王漿的活性，使其泌漿行為趨于停滯[13]。而春繁階段越冬蜂在幼蟲信號和采食花粉等營養(yǎng)物質(zhì)的刺激下，細胞內(nèi)蛋白合成和分泌相關(guān)細胞器結(jié)構(gòu)豐富，使咽下腺小囊膨大，咽下腺呈現(xiàn)分泌活性。但越冬蜂在春繁階段咽下腺小囊細胞器水平低于9日齡工蜂，表明春繁階段工蜂王漿合成和分泌的能力較9日齡工蜂低，這一點與春繁蜂飼喂養(yǎng)能力不如適齡工蜂強[14]相一致。由此，不同日齡、不同階段工蜂的飼喂能力差異在電鏡分析得到合理解釋。

綜上所述，通過對卡蜂咽下腺小囊外部形態(tài)和細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)電鏡分析表明，卡蜂工蜂咽下腺小囊總體發(fā)育較為遲緩，隨著日齡增加，咽下腺小囊直徑呈現(xiàn)“飽滿—萎縮”的趨勢，細胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)“漸變增多—逐漸減少”的變化。不同日齡內(nèi)勤蜂中，9日齡工蜂咽下腺小囊直徑最大，細胞器水平最高；在越冬蜂中，春繁階段工蜂咽下腺小囊直徑最大，細胞器水平最高，但其細胞器水平均低于9日齡工蜂，表明咽下腺小囊內(nèi)細胞器的水平反映了蜜蜂泌漿能力的高低。

致謝：感謝吉林省養(yǎng)蜂科學研究所薛運波所長、牛慶生研究員為本試驗提供卡尼鄂拉蜂蜂王；感謝揚州大學測試中心老師對本試驗電鏡數(shù)據(jù)采集的指導和幫助。

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