果蔬中食源性致病微生物的研究進展

錢程 馬晨 湯永嬌 李建國

摘 要 全球食源性疾病的發(fā)生呈增長態(tài)勢，由果蔬中食源性致病微生物引發(fā)的疾病也在逐年增加。因此，各國對于果蔬中食源性致病微生物的檢測也越來越重視。目前，食源性致病微生物的快速檢測和相關(guān)的防控技術(shù)成為研究的熱點，本文綜述果蔬中常見大腸桿菌、李斯特菌和沙門氏菌的種類、特性、病癥、檢測方法及防控技術(shù)，為保障食品安全提供參考。

關(guān)鍵詞 果蔬 ；食源性致病微生物 ；耐藥性 ；檢測方法 ；防控技術(shù)

分類號 TS207.4

在全球范圍內(nèi)，食源性疾病廣泛地威脅公眾安全。2000年6月，日本雪印乳業(yè)生產(chǎn)的牛奶感染金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），導(dǎo)致1.4萬人在飲用后出現(xiàn)嘔吐腹瀉等中毒癥狀；2005～2006年間，北美地區(qū)發(fā)生4起沙門氏菌（Salmonella）感染事件，共累及北美21個州；2010年，Newell DG調(diào)查研究表明，歐盟每年有1.3億人患食源性疾病[1]；2013年，Jane M. Van Doren等[2-3]調(diào)查表明，美國每年有近5千萬人感染食源性疾病。其中由食源性致病菌引起的食源性疾病所占比例最大[4]。

在這些案例中，動物源性食物攜帶致病微生物引起疾病的情況占大多數(shù)。而由果蔬攜帶致病微生物引發(fā)疾病的現(xiàn)象也呈逐年增多的趨勢。

2011年5月，德國北部某公司生產(chǎn)的豆芽中帶有腸出血性大腸桿菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli），造成歐美等國68人死亡，數(shù)千人感病，導(dǎo)致西班牙農(nóng)民平均每周損失2億歐元；2013年10月，墨西哥產(chǎn)的新鮮香菜帶有環(huán)孢子蟲卵，導(dǎo)致美國爆發(fā)了大規(guī)模環(huán)孢子蟲病，25個州共643人感染。

生食蔬菜，特別是綠葉蔬菜不僅可以傳播致病菌，還可以傳播病毒[5-7]；近幾十年來，許多發(fā)達國家公眾越來越注重健康的生活方式，對新鮮農(nóng)產(chǎn)品的需求日益增長[8]；另外，果蔬被致病菌污染后，很難通過常規(guī)方法清洗掉[9]，這些都引起了各國對即食果蔬是否含有致病菌的高度重視。

中國在食源性致病微生物的監(jiān)測方面存在很大漏洞。毛雪丹等[10]分析2003～2008年中國細菌性食源性疾病監(jiān)測結(jié)果，推算出當時監(jiān)測漏報率為99.992%。目前，中國對食源性致病微生物的檢測重點主要集中在肉類食品和水產(chǎn)品中，沙門氏菌、單增李斯特菌和大腸桿菌O157這些常見致病菌，對果蔬中的致病微生物研究較少[11-15]。

由于貿(mào)易全球化，食品在全球范圍內(nèi)流通，導(dǎo)致食源性致病菌的全球性傳播[16]。中國生產(chǎn)出口的果蔬中常因含有致病菌，致使出口到發(fā)達國家的途徑受阻。

由此可見，食源性致病微生物不僅威脅公眾健康，也給貿(mào)易帶來了挑戰(zhàn)。我國需要進行深入的研究以應(yīng)對未來可能存在的風(fēng)險。因此，筆者主要對近年在果蔬中存在的主要人類致病菌種類及特性、當前致病微生物的檢測技術(shù)和防控技術(shù)等3個方面的研究進行總結(jié)，了解當前的研究熱點和尋找未來的研究趨勢。

1 果蔬中主要人類致病菌種類及特性

1.1 主要致病菌種類

據(jù)美國CDC 2013年的報告顯示，美國1998～2008年11年共計爆發(fā)食源性疾病事件273 120次，其中71%與食源性致病微生物相關(guān)。最常見的致病微生物為諾瓦克病毒（Noroviruses， NVs）、沙門氏菌、產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli， STEC）等，而導(dǎo)致住院率最高的則是產(chǎn)志賀氏毒素的大腸桿菌，致死率最高的是單增李斯特菌。沙門氏菌、產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌以及單增李斯特菌（Listeria Monocytogenes）是造成美國每年多次爆發(fā)的主要病原物。而導(dǎo)致染病發(fā)病的相關(guān)食品分別為家禽（17%）、葉類蔬菜（13%）、牛肉（12%）、水果/堅果（11%），其中諾瓦克病毒常見于葉類蔬菜，水果和根莖類蔬菜上的沙門氏菌以及牛肉和葉菜類蔬菜上的大腸桿菌導(dǎo)致最高的染病住院率；家禽上攜帶的李斯特菌、水果上的沙門氏菌和葉菜類蔬菜上的大腸桿菌都具有最高的致死率[20-21]。

據(jù)《中國衛(wèi)生部辦公廳關(guān)于2012年全國食物中毒事件情況的通報》，全年共發(fā)生6 685起食品中毒事件，由微生物引起的中毒事件共計3 749起，占56.1%，死亡16人。微生物性食物中毒事件報道中，主要是由沙門氏菌、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、大腸桿菌等引起的細菌性食物中毒。

由此可見，沙門氏菌和大腸桿菌引發(fā)的食源性疾病較為常見。然而由于中國與西方國家飲食習(xí)慣的差異，我國在果蔬上發(fā)生的食源性疾病所見不多而不夠重視，從而導(dǎo)致致病微生物對即食果蔬的污染直接影響到我國農(nóng)產(chǎn)品的對外出口，應(yīng)引起足夠重視。李斯特菌多見于禽肉類食品，但蔬菜也可作為其媒介進而導(dǎo)致人類發(fā)病[22-24]。值得注意的是，李斯特菌可在低溫環(huán)境下存活以及其高致死率的特性，使得李斯特菌也備受關(guān)注[25]。

1.2 主要致病菌的特性

不同致病菌具有不同的特性，本文主要總結(jié)沙門氏菌、大腸桿菌和李斯特菌的臨床表現(xiàn)以及耐藥性。

1.2.1 主要致病菌的臨床表現(xiàn)

主要致病菌的臨床表現(xiàn)見表1[6]。

1.2.2 致病菌的耐藥性

抗生素的濫用以及生態(tài)環(huán)境改變等影響，導(dǎo)致耐藥性菌株（本文指耐抗生素）的出現(xiàn)[26]。世界各地相繼發(fā)現(xiàn)報道耐藥菌株。

20世紀90年代，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種非傷寒沙門氏菌出現(xiàn)耐藥性[27]。21世紀初，鼠傷寒沙門氏菌被發(fā)現(xiàn)可以同時對5種抗生素（氨芐青霉素、氯霉素、鏈霉素、磺胺類和四環(huán)素）產(chǎn)生抗性[28]，為有效防治沙門氏菌引起的疾病，氟喹諾酮類藥物和頭孢菌素類藥物開始被使用[29]，但很快在一些樣品中發(fā)現(xiàn)了對這2種抗生素有抗性的菌株[30]。2014年，有研究結(jié)果表明，在200份牛肉樣品中發(fā)現(xiàn)100份樣品存在耐藥的沙門氏菌株，并且所有耐藥菌株均對3種及以上的抗生素表現(xiàn)出耐藥性[31]。

大腸桿菌更容易獲得抗藥性[32]，1988年就有耐藥性的大腸桿菌（E. Coli. O157）報道，1996年又發(fā)現(xiàn)其他的大腸桿菌血清型（O111，O26）具有耐藥性[33]。2010年，美國的一項研究表明，從不同年齡的健康乳牛腸道中分離到的大腸桿菌，大多數(shù)具有耐藥性，并有15%表現(xiàn)出高抗性[34]。

1981年，第一例由李斯特菌引起的食源性疾病被報道[35]。1988年，第一例從一個腦膜炎患者體內(nèi)分離得到的具有抗藥性的單增李斯特菌被發(fā)現(xiàn)，李斯特菌能夠抗氯霉素、紅霉素、鏈霉素和四環(huán)素[36]，可以在短時間內(nèi)進化出抗藥的菌株，這與李斯特菌可以在低溫、低pH值和高鹽環(huán)境中的生長特性有關(guān)[37]。李斯特菌通常被認為不易獲得抗性，但有研究者發(fā)現(xiàn)其抗性基因存在于移動質(zhì)粒上，可以傳播到其他的致病菌體內(nèi)（包括李斯特菌、金黃色葡萄球菌等）[38]。近年來，對氟喹諾酮類藥物和季胺類藥物具有抗性的菌株被相繼分離得到[39-41]。對工業(yè)消毒劑（如次氯酸鹽等）產(chǎn)生抗性的李斯特菌也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)[42]。

這些耐藥性的菌株通常從動物糞便、動物體內(nèi)和人體內(nèi)分離得到，在植物中很少分離出耐藥菌株。這與抗生素并不會直接噴灑在植物上有關(guān)，但在果蔬表面是否具有耐受其他有機物（農(nóng)藥、抑菌劑等）的菌株尚未見報道。應(yīng)加強對此類致病菌的檢測，防范潛在的風(fēng)險。

耐藥菌株的出現(xiàn)，給生產(chǎn)企業(yè)和醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)帶來了巨大挑戰(zhàn)。致病菌對越來越多的抗生素產(chǎn)生抗性，應(yīng)引起人們的重視和思考。未來，對于致病菌的防控不能僅僅依賴抗生素，需要尋找更多的方法綜合防控致病菌，減緩其過快產(chǎn)生耐藥性的菌株。

2 食源性致病菌檢測技術(shù)

目前，實際用于食源性致病菌檢測的方法主要有：分離培養(yǎng)、生化鑒定、酶聯(lián)免疫吸附、聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）以及環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)（LAMP）等。傳統(tǒng)的檢測方法耗時繁瑣，靈敏度低的特點不能滿足快速檢測的需求[17-19]。

2.1 傳統(tǒng)檢測方法

傳統(tǒng)的致病微生物檢測鑒定的主要依據(jù)形態(tài)學(xué)特征、生理生化反應(yīng)特征以及血清學(xué)反應(yīng)。

2.1.1 形態(tài)學(xué)特征鑒定

主要方法：在顯微鏡下觀察細胞外形大小、形狀等，革蘭氏染色反應(yīng)，能否運動、鞭毛著生部位和數(shù)目，有無芽孢和莢膜、芽孢的大小和位置；在一定的固體培養(yǎng)基上生長的菌落特征，包括外形、大小、光澤等；在一定的斜面培養(yǎng)基上生長的菌落特征，包括生長程度、形狀、顏色等；在半固體培養(yǎng)基上經(jīng)穿刺接種后的生長情況；在液體培養(yǎng)基中生長情況，包括是否產(chǎn)生菌膜，均勻渾濁還是發(fā)生沉淀，有無氣泡，培養(yǎng)基的顏色等進行鑒定。

2.1.2 生理生化反應(yīng)特征鑒定

物質(zhì)利用方面，對各種碳源（CO2、糖類等）、氮源（硝酸鹽、銨鹽等）、能源（光能、化學(xué)能等）和生長因子的要求進行鑒定；

利用生化試驗，通過三塘鐵瓊脂試驗、賴氨酸脫羧酶試驗、靛基質(zhì)試驗、尿素瓊脂試驗、氰化鉀試驗等進行鑒定；

通過對氧氣的要求，好氧、厭氧、兼性厭氧等進行鑒定。

2.1.3 血清學(xué)分型

很多細菌具有十分相似的表面結(jié)構(gòu)或有作用相同的酶，在普通的技術(shù)（如電子顯微鏡）下仍無法判斷。利用抗原與抗體的高度敏感特異性反應(yīng)，可鑒別相似的菌種，或?qū)νN微生物分型。

傳統(tǒng)的微生物檢驗方法靈敏度高，費用低，能檢測出食品中的微生物群落數(shù)量和特性等方面的定性和定量結(jié)果。然而傳統(tǒng)檢測方法費時費力，獲得最終的結(jié)果通常需要數(shù)天時間，這增加了企業(yè)對于果蔬的儲藏成本和質(zhì)量控制成本，也加大了政府對于食品安全的監(jiān)管難度。因此，需要快速的食源性致病微生物的檢測方法。

2.2 快速檢測方法

在食源性致病微生物檢測領(lǐng)域所用快速檢測方法有基于抗原—抗體相互作用的酶聯(lián)免疫法、PCR（包括多重PCR、實時定量PCR等）等。還有研究者采用一些特殊材料的物理特性應(yīng)用于致病微生物的檢測。

2.2.1 酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫法的基本原理是抗原與抗體的特異性結(jié)合。J. A Durant等[43]將小鼠單克隆抗體應(yīng)用于酶聯(lián)免疫法，該方法被證明可以用于定量分析混合菌群中的單一目標菌，這對于快速分析一個樣品中是否含有致病菌具有借鑒意義。雖然酶聯(lián)免疫法可以提高檢測的速度（比傳統(tǒng)方法快2～3 d），但酶聯(lián)免疫法常出現(xiàn)假陰性結(jié)果，這可能與所用單克隆抗體的專一性有關(guān)，因此在試驗過程中需要設(shè)置陽性和陰性對照試驗。且還有所用的材料不能重復(fù)使用、不能分辨受損細胞、花費較貴等缺點。

2.2.2 聚合酶鏈式反應(yīng)

聚合酶鏈式反應(yīng)的原理是根據(jù)堿基互補配對原則，在體外對目標菌的基因進行擴增。進而對基因測序，通過序列比對判斷目標菌的種類。

聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）具有更高的靈敏度，Si Hong Park等[44-46]研究稱，對同一批樣品的檢測，PCR的靈敏度可達92%，而傳統(tǒng)方法僅有50%。在聚合酶鏈式反應(yīng)中，通過濃縮的步驟可以提高PCR法的靈敏度。但PCR需要進行繁瑣的前處理步驟，且該方法不能區(qū)分活細胞和死細胞，很容易造成對樣品的誤判導(dǎo)致經(jīng)濟損失[47]。

但是，在運用傳統(tǒng)方法之前采用PCR方法對樣品進行快速檢測，可以提高檢測的方向性和目的性。

為提高PCR方法的效率，2000年，日本榮研化學(xué)株式會社開發(fā)了一種恒溫的體外核酸擴增方法，即環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)（LAMP）。其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件（63℃左右）保溫30～60 min即可完成核酸擴增反應(yīng)。由美國Diagenetix公司開發(fā)的Smart-DARTTM采用了該技術(shù)，省卻了熱循環(huán)儀，使得成本降低，并且根據(jù)其恒溫擴增的特點大大提升了檢測效率。Smart-DARTTM體積小巧，可以隨身攜帶。它還采用Android系統(tǒng)控制儀器，使得數(shù)據(jù)傳輸和管理都更加簡便。

2.2.3 其他檢測方法

Jaya Sundaram等[48]用聚乙烯醇封裝銀納米粒子用于致病微生物的檢測，可以同時在一塊基質(zhì)上區(qū)別多種致病菌。Yigang Xu等[49]采用多重PCR與高效液相色譜相結(jié)合的方式同時分析多種致病菌的16S rRNA，但是同樣無法區(qū)分活細胞和死細胞。

由于傳統(tǒng)檢測方法的弊端，新的快速檢測方法在食源性安全領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。然而，快速檢測的方法并未被我國國家標準所采用，加之現(xiàn)行國家標準混亂的局面，增加檢測人員的工作量，同時也影響了檢測的效率。而在美國、歐盟等發(fā)達國家和地區(qū)，快速檢測方法正在應(yīng)用，這也凸顯了我國食品安全領(lǐng)域與發(fā)達國家之間的差距。必須加速發(fā)展我國食品安全檢測手段，才能適應(yīng)經(jīng)濟的快速發(fā)展和縮短與發(fā)達國家的差距。

3 食源性致病微生物防控技術(shù)

在實際生產(chǎn)過程中，果蔬暴露在致病微生物的可能性存在于生產(chǎn)的每個環(huán)節(jié)，包括田間的栽培采收、工廠中的加工包裝以及運輸?shù)冗^程。因此，致病微生物的防控需要對生產(chǎn)的每個過程進行防控，以確保果蔬最終的安全性。

在栽培過程中，受致病微生物污染的灌溉水是威脅果蔬質(zhì)量的最重要因素[50-51]，然而，控制灌溉水的質(zhì)量難度很大，因此目前的研究大多集中在評估灌溉水受污染的程度和灌溉水中致病微生物的檢測監(jiān)督。從灌溉水方面通過生物防治的方法防控致病微生物或許可以降低其危害程度。

在果蔬加工過程中，食源性致病菌通常會在加工材料的表面形成菌膜[52]，并具有高效的抗逆性。對于加工材料上致病菌的防控多采用殺菌劑等方法。目前，很多研究者通過提取天然產(chǎn)物中生物活性成分用于開發(fā)抗菌劑。Mélanie Turgis等[53]從月桂、肉桂、甘蘭菊、百里香和香茅等植物中提取到的天然活性成分對大腸桿菌等7種致病菌具有不同程度的抗性。并且發(fā)現(xiàn)與乳酸鏈球菌素、片球菌素和2種從腸球菌中分離到的細菌素聯(lián)合使用可增強抑菌效果，同時還可增加食物的感官效果。還有一些研究者通過在食物表面包覆一層具有抑菌效果的可食用膜，向其中混入天然活性成分，可以同時達到異菌和改善食物品質(zhì)的效果。如Kyung W. Kim等[54]使用的殼聚糖涂層，Emrah Torlak等[55]發(fā)明的殼聚糖混合蜂膠的涂層，Mehdi Alboofetileh等[56]采用藻酸鹽混合植物精油的納米涂層等，都對常見的致病菌（如大腸桿菌、單增李斯特菌、沙門氏菌等）具有較好的抑菌效果。

在果蔬的運輸過程中，導(dǎo)致致病微生物污染果蔬的情況多是由于工作人員的不規(guī)范操作、工作人員自身生病等原因攜帶致病微生物等情況造成。因此，在生產(chǎn)運輸過程中，規(guī)范工作人員的操作、對患傳染病的工作人員采取休假或加強防護等措施，可以有效防控致病微生物在運輸過程中的傳播。

對于已經(jīng)受到致病微生物污染的果蔬，也有研究者采用一些方法來進行挽救，希望能在最大限度上挽回企業(yè)和個人的損失。Sung-Youn Kim等[57]通過震動的方法來減少生菜和菠菜表面的致病菌。在20 Hz的條件下震動20 s，可將蔬菜表面的大腸桿菌、單增李斯特菌和沙門氏菌分別減少776、5 370、177 CFU/g。并且證明該項技術(shù)適用于不同的蔬菜種類，但對于細菌對蔬菜表面的依附和脫離的機理尚待研究。Karine Trudeau等[58]發(fā)現(xiàn)使用γ射線輻照金黃色葡萄球菌24 h，可改變其表達的不同分子量蛋白的比例，這或許可應(yīng)用于降低金黃色葡萄球菌的致病性。

Isabel Alegre等[59]發(fā)現(xiàn)假單胞菌CPA-7與沙門氏菌和單增李斯特菌有拮抗作用，可用于果蔬儲運過程，避免其受到致病菌的污染。Wen-Hsuan Wu等[60]的研究表明，植物體本身可以產(chǎn)生一種氨基酸（IB-AMP1）用于抵御致病菌（包括金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌和大腸桿菌O157）的侵染。而IB-AMP1與致病菌的親和性要高于人細胞的親和性。通過提高植物自身抵抗食源性致病菌的活性，可以極大提高果蔬類食品的安全性。還有研究者稱低濃度的電解水可以作為有效的抑菌劑，抑制蔬菜、家禽和肉類中所含的致病菌[61]。

目前，通過物理方法和利用天然產(chǎn)物的方法被認為是安全可行的防控方法，因此也是防控研究的熱點。通過提高果蔬本身的防御能力可以更好踐行環(huán)保的原則。

在果蔬已經(jīng)受到污染的既定事實后，對食源性致病微生物的防控實際上進一步增加了農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)成本，造成一定的資源浪費。所以，從源頭上按照良好的規(guī)范進行果蔬產(chǎn)品的生產(chǎn)、加工是既安全又經(jīng)濟的生產(chǎn)模式。

4 結(jié)語

從全球范圍來看，食源性致病微生物帶來的食品安全問題在發(fā)達國家已經(jīng)成為威脅公眾安全的最大安全隱患。在我國，食源性致病微生物所引發(fā)的安全問題也在逐年增加，政府和公眾的關(guān)注也在不斷改善。

由于食源性致病微生物導(dǎo)致我國果蔬在出口時屢屢受阻的事實也提醒我們，必須提升我國果蔬產(chǎn)品的質(zhì)量，拓寬我國果蔬產(chǎn)品的銷售渠道。

在我國，果蔬中常見的食源性致病微生物種類需要全面地調(diào)查，并向相關(guān)科研人員和公眾公開，加強公眾對其危害的防范意識。對于新發(fā)現(xiàn)的耐藥菌株，需要盡量避免污染到果蔬產(chǎn)品以防引起大范圍的傳播。對致病菌耐藥機理的研究可以為合理的防控致病微生物提供科學(xué)的數(shù)據(jù)支撐。

對食源性致病微生物的及時檢測鑒定，是降低其引發(fā)危害的有力措施之一。傳統(tǒng)和現(xiàn)代的檢測鑒定方法分別具有不同的優(yōu)勢和不足，可以充分結(jié)合，取長補短，提高檢測效率，及時通報致病微生物的污染情況，將危害程度降至最低。

對食源性致病微生物的有效防控，可以極大地降低其帶來的危害。防控手段需要作用于果蔬生產(chǎn)的全過程，包括從田間生產(chǎn)到消費者食用。防控技術(shù)的研究除具有有效地控制致病微生物的效果外，還需要具有環(huán)境友好的特點。加強相關(guān)生產(chǎn)人員的防范意識，可以杜絕由于不規(guī)范的操作和管理造成的偶然污染，提高果蔬產(chǎn)品的品質(zhì)。

鑒于許多國家已發(fā)生大規(guī)模食源性致病微生物的案例，我國需要建立相關(guān)監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)，保證我國公民食用果蔬產(chǎn)品的安全性，確保我國出口果蔬產(chǎn)品的質(zhì)量，提升我國農(nóng)產(chǎn)品在國際市場上的貿(mào)易地位。

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