香葉木素－7－O－β－D－葡萄糖苷的抗炎作用研究

白慶云，梁 輝，袁功文，聞?dòng)琅e

(宜春學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春 336000)

香葉木素－7－O－β－D－葡萄糖苷是以橙皮苷為原料通過(guò)脫氫，生成地奧司明，再由地奧司明去除分子中鼠李糖而獲得的新化合物。地奧司明為黃酮類(lèi)衍生物，可以改善微循環(huán)。調(diào)節(jié)淋巴系統(tǒng)功能，降低毛細(xì)血管通透性，改善其彈性和脆性，抑制水腫形成。［1］是臨床上治療痔瘡，慢性靜脈功能不全的常用藥。［2］此外，地奧司明還具有類(lèi)似維他命P (Vitamin P)的作用，可降低血管脆性，使異常增高的通透性降低，所以還用于高血壓的防治及動(dòng)脈硬化的輔助治療。由于地奧司明不易溶于水及常見(jiàn)的有機(jī)溶劑，導(dǎo)致其生物利用度較低。將其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造成為香葉木素－7－O－β－D－葡萄糖苷后，在溶解性、吸收、分布及代謝等方面均優(yōu)于地奧司明，生物利用度大大提高。為探明結(jié)構(gòu)改造對(duì)地奧司明的作用是否有影響，本實(shí)驗(yàn)就地奧司明和香葉木素－7－O－β－D－葡萄糖苷兩者的抗炎作用進(jìn)行了對(duì)比研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物:KM (KunMing)小鼠(由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供)60 只，雌雄不拘，體重20 ±2g。

1.2 器材:0.25mL 注射器，4 號(hào)針頭，紫外分光光度計(jì)(型號(hào)，T6S 型，編號(hào)5－1650－01－0904)，精密電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，精密度0.0000g)，直徑8mm 打孔器，剪刀。

1.3 藥品及試劑:地奧司明片劑(南京正大天晴制藥有限公司，0.45g/片，含有黃酮類(lèi)化合物500mg，其中地奧司明450mg)，香葉木素－7－O－β－D－葡萄糖苷(由宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院藥化研究室提供，經(jīng)鑒定純度為95%)，伊文思藍(lán)(上海晶純?cè)噭┯邢薰荆?hào)20100802)，生理鹽水，二甲苯(上海振欣試劑廠，批號(hào)20081108)，丙酮(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，硫酸鈉(天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心，批號(hào)20060816)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 5%伊文思藍(lán)生理鹽水的配制:精密稱(chēng)取伊文思藍(lán)0.5g，溶于生理鹽水中成100mL，搖勻，備用。

2.2 丙酮－硫酸鈉液配制:稱(chēng)取無(wú)水硫酸鈉1.5g，溶于150mL 蒸餾水中，然后向硫酸鈉溶液內(nèi)緩慢加入350mL 的丙酮，即得。此液用于提取皮膚內(nèi)染料。

2.3 對(duì)照品溶液的配制:精密稱(chēng)取伊文思藍(lán)2.5g，置100mL 容量瓶中，加丙酮－硫酸鈉溶解并稀釋至刻度，即得0.025g/mL 的對(duì)照品溶液

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密量取對(duì)照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分別置于10mL 容量瓶中，加丙酮－硫酸鈉稀釋至刻度，搖勻。以第一瓶作空白，用紫外分光光度計(jì)在590nm 處測(cè)其吸收度，作A—C 標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其回歸方程。

2.5 香葉木素－7－O－β－D－葡萄糖苷溶液、地奧司明溶液的配制:取地奧司明片6.5 片放于研缽中研成粉末，將其倒入裝有250mL 生理鹽水的平底容量瓶中，并不斷用玻璃棒不斷攪拌，直至完全溶解，制成濃度為11.7mg/mL 的溶液。精密稱(chēng)取香葉木素－7－O－β－D－葡萄糖苷粉末0.2925g于25mL 容量瓶中，用生理鹽水溶解，并稀釋至刻度制成11.7mg/mL 的溶液。

2.6 分組與給藥

2.6.1 香葉木素－7－O－β－D－葡萄糖苷對(duì)小鼠腹部皮膚毛細(xì)血管滲透性的影響

取小鼠30 只，隨機(jī)分為3 組，雌雄不拘:A 組(生理鹽水)、B 組(地奧司明)和C 組(香葉木素－7－O－β－D－葡萄糖苷)。B 組小鼠分別于背部皮下注射地奧司明0.1mL/10g，C 組注射香葉木素－7－O－β－D－葡萄糖苷0.1mL/10g，A 組注射等體積生理鹽水。連續(xù)給藥3 天，1 小時(shí)后于尾部靜脈注入配制好伊文思藍(lán)溶液，每10g 體重0.1mL，隨即于小鼠腹部正中(去毛部位)滴二甲苯，每只小鼠0.03mL，20min 后小鼠脫頸椎致死，剝下腹部皮膚翻轉(zhuǎn)后貼在白色搪瓷盤(pán)上，根據(jù)皮片上藍(lán)斑的色澤深淺將其分為7 ～10 個(gè)級(jí)別，一個(gè)級(jí)別記1 分。［3］評(píng)定藍(lán)斑深淺后，每塊皮片用手術(shù)剪剪碎，浸入玻璃試管中，倒入丙酮－硫酸鈉提取液10mL，用塞子塞緊，避光放置，每日輕輕搖動(dòng)該試管2 ～3 次，3 天后2000r/min 離心10min，取上清液，用分光光度計(jì)于590nm 處測(cè)定吸光度(以未浸泡皮片的丙酮－硫酸鈉液調(diào)零)。［4，5］(注意:伊文思藍(lán)注入量一定要準(zhǔn)確;滴二甲苯務(wù)須仔細(xì)，盡量使二甲苯浸潤(rùn)的皮膚形成一個(gè)近圓形斑塊，為此，要注意二甲苯滴上皮膚時(shí)的角度，位置及小鼠安靜不掙扎，二甲苯浸潤(rùn)的皮膚面積各鼠應(yīng)力求保持大小相近;小鼠腹部皮膚去毛可用剪毛剪于實(shí)驗(yàn)前一日進(jìn)行)。按下式計(jì)算染料滲出抑制率。

染料滲出抑制率= (對(duì)照組染料量－實(shí)驗(yàn)組染料量)/對(duì)照組染料量×100%［5］

2.6.2 香葉木素－7－O－β－D－葡萄糖苷對(duì)小鼠耳腫脹的影響

另取小鼠30 只，隨機(jī)分為3 組:I 組(生理鹽水)、II 組(地奧司明)、III 組(香葉木素－7－O－β－D－葡萄糖苷)。II 組小鼠分別腹腔注射地奧司明0.1mL/10g，III 組腹腔注射香葉木素－7－O－β－D－葡萄糖苷0.1mL/10g，I 組注射等體積生理鹽水。每組小鼠每日腹腔注射給藥一次，連續(xù)3d，第三天給完藥后0.5h，三組小鼠于左耳廓前后均勻涂抹二甲苯0.1mL，右耳不涂以作為自身空白對(duì)照。60min 后將小鼠全部脫頸椎處死，沿耳廓基線剪下雙耳，重疊放置，用打孔器打下圓耳片，用精密電子天平稱(chēng)重，按以下公式計(jì)算腫脹度和抑制率。［6］

腫脹度(mg)=每組左耳片重－每組右耳片重

平均腫脹度(mg) =腫脹度/動(dòng)物數(shù)

耳腫脹抑制率= (對(duì)照組平均腫脹度－給藥組平均腫脹度)/對(duì)照組平均腫脹度×100%［7］

2.7 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 10.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差(± s)表示，采用t 檢驗(yàn)。以p ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 回歸曲線與方程見(jiàn)圖1

圖1 顯示伊文思藍(lán)濃度和吸光度之間具有良好的線性關(guān)系，R2=0.9997。

圖1 伊文思藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3.2 藥物對(duì)小鼠皮膚毛細(xì)血管通透性亢進(jìn)的影響，結(jié)果見(jiàn)表1

x ± s，n=10)

Table 1 Effects of drug induced by xylene in mice capillary permeability of the abdominal skin

表1 藥物對(duì)二甲苯所致小鼠腹部皮膚毛細(xì)血管通透性亢進(jìn)的影響結(jié)果表(

由表1 可知B 組(地奧司明)和C 組(香葉木素－7－O－β－D－葡萄糖苷)藍(lán)斑深淺計(jì)分和染料滲出量均比空白對(duì)照組A 組(生理鹽水)低，分別p ＜0.05，p ＜0.01，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。地奧司明抑制率為23.81%，香葉木素－7－O－β－D－葡萄糖苷抑制率為28.27%。說(shuō)明地奧司明和香葉木素－7－O－β－D－葡萄糖苷可以抑制腹部皮膚毛細(xì)血管通透性亢進(jìn)。

3.3 藥物對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響結(jié)果見(jiàn)表2

表2 藥物對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響結(jié)果表(x ± s，n=10)Table 2 Effects of drug in mice of ear swelling induced by xylene

由表3 可知II 組(地奧司明)和III 組(香葉木素－7－O－β－D－葡萄糖苷)平均腫脹度均比空白對(duì)照組A 組(生理鹽水)低，且p ＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。地奧司明抑制率為45.31%，香葉木素－7－O－β－D－葡萄糖苷抑制率為52.73%. 說(shuō)明地奧司明和香葉木素－7－O－β－D－葡萄糖苷能抑制炎癥引起的小鼠耳腫脹。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明地奧司明和香葉木素－7－O－β－D－葡萄糖苷對(duì)二甲苯所致的腹部皮膚毛細(xì)血管通透性亢進(jìn)均有抑制作用，抑制率分別為23.81%和28.27%.

水脹是繼血管通透性增高、滲出后發(fā)生在炎癥部位的一種變化，是急性炎癥的標(biāo)志性變化之一。根據(jù)藥物對(duì)腫脹的抑制程度可以評(píng)價(jià)其抗炎活性。用致炎劑涂抹于小鼠耳部引起小鼠耳的腫脹，在一個(gè)較短的時(shí)間內(nèi)測(cè)定用藥組與對(duì)照組致炎耳與未致炎耳重量，計(jì)算并比較抑制率，確定抗炎效果。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，與生理鹽水比較，地奧司明和香葉木素對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹均具有抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明兩種藥物對(duì)小鼠均有明顯的抗炎作用。

本實(shí)驗(yàn)以地奧司明為陽(yáng)性對(duì)照藥，對(duì)經(jīng)結(jié)構(gòu)改造后獲得的新化合物香葉木素－7－O－β－D－葡萄糖苷的抗炎作用進(jìn)行對(duì)比研究。結(jié)果表明兩者對(duì)炎癥均有較好的抑制作用，且后者效果更優(yōu)。這為藥物的結(jié)構(gòu)改造和新藥研發(fā)提供了藥理學(xué)依據(jù)。

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