丹參多酚酸鹽對心衰大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-3及其抑制因子-1表達的影響

陳 成， 鄒襄谷， 陳國通， 林秀明， 陳永忠， 陳 慧

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院老年科，福建福州350003；2.福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州350003）

丹參多酚酸鹽對心衰大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-3及其抑制因子-1表達的影響

陳 成1， 鄒襄谷2， 陳國通2， 林秀明1， 陳永忠1， 陳 慧1

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院老年科，福建福州350003；2.福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州350003）

目的探討丹參多酚酸鹽對心衰大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）及其抑制因子-1（tissue inhibitor ofmetalloproteinase-1，TIMP-1）表達的影響。方法60只雄性SD大鼠完全隨機分成模型組，丹參多酚酸鹽低劑量組、高劑量組，卡托普利組，卡托普利和丹參多酚酸鹽高劑量聯(lián)合組 （簡稱中西藥聯(lián)合組），正常對照組。除正常對照組，其余大鼠運用阿霉素腹腔注射制造心衰模型，正常對照組大鼠腹腔注射等體積的生理鹽水，每周1次，共6周。在開始造模的同時，各組開始相關(guān)干預(yù)。8周后，檢測心功能，行心肌組織天狼猩紅染色，檢測心肌膠原容積分數(shù)（collagen volume fraction，CVF）、心肌血管周圍膠原面積與管腔面積的比例（perivasular circuMferentiall area，PVCA）。熒光PCR檢測心肌MMP-3、TIMP-1的mRNA水平，Western blot檢測心肌MMP-3、TIMP-1的表達情況。結(jié)果與模型組相比，丹參多酚酸鹽高劑量組、卡托普利組、中西藥聯(lián)合組均有不同程度的降低心肌CVF、PVCA（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01），中西藥聯(lián)合組較卡托普利組更明顯 （P＜0.05）；丹參多酚酸鹽高劑量組、卡托普利組、中西藥聯(lián)合組心肌組織中MMP-3的mRNA水平及蛋白表達較模型組均降低 （P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01），且中西藥聯(lián)合組低于卡托普利組 （P＜0.05）；與模型組相比，丹參多酚酸鹽高劑量組、卡托普利組、中西藥聯(lián)合組均能上調(diào)心肌組織TIMP-1的mRNA水平及蛋白表達（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01），且中西藥聯(lián)合組高于卡托普利組（P＜0.05）。結(jié)論丹參多酚酸鹽能降低心肌間質(zhì)膠原，其機制可能與下調(diào)MMP-3及上調(diào)TIMP-1的表達有關(guān)。

丹參多酚酸鹽；心力衰竭；基質(zhì)金屬蛋白酶-3；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1

心衰發(fā)生發(fā)展的基本機制不僅包括心肌細胞的重構(gòu)，而且還表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)重構(gòu)，表現(xiàn)為心肌細胞外基質(zhì)過度纖維化或降解增加，最終導(dǎo)致心室腔擴大、室壁變薄，導(dǎo)致心肌纖維化、心功能惡化。已有相關(guān)文獻證實丹參脂溶性的提取物抗心肌纖維化的作用［1-2］，丹參多酚酸鹽作為丹參水溶性的提取物，抗心肌缺血的作用已得到認可，但其對心衰大鼠心肌外基質(zhì)纖維重構(gòu)的影響，尚未見相關(guān)報道。本實驗從心肌膠原水平、MMP-3、TIMP-1的表達，探討丹參多酚酸鹽對心衰大鼠細胞外基質(zhì)纖維化重構(gòu)的影響。

1 材料

1.1 動物和分組 60只雄性SD清潔級大鼠，體質(zhì)量（200±10）g，福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（閩）2012-0001。隨機分為6組：模型組，丹參多酚酸鹽低、高劑量組，丹參多酚酸鹽與卡托普利聯(lián)合組 （中西藥聯(lián)合組），卡托普利組，正常對照組，每組10只。

1.2 藥物及試劑

1.2.1 藥物 注射用阿霉素 （鹽酸多柔比星），深圳萬樂藥業(yè)有限公司（生產(chǎn)批號H44024359；規(guī)格10 mg/瓶）；丹參多酚酸鹽，上海綠谷制藥有限公司 （生產(chǎn)批號Z20050248；規(guī)格100 mg/瓶）；卡托普利，江蘇鵬鷂藥業(yè)有限公司 （生產(chǎn)批號 1111221；規(guī)格 25 mg/片，100片/瓶）。

1.2.2 試劑 兔抗大鼠MMP-3多克隆抗體、兔抗大鼠TIMP-1多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；Trizol（Invitrogen公司）；TransScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix合成cDNA第一鏈（TransGen公司）；SYBR Universal PCR Master Mix，No AmpErase UNG（2X）（ABI公司）；引物由福州沃森生物技術(shù)有限公司合成；其他化學(xué)分析試劑均為分析純。1.3 儀器設(shè)備 RM6240多道生理信號采集處理系統(tǒng) （成都儀器廠）；ABI7500熒光定量PCR儀（北京新陽創(chuàng)業(yè)科技發(fā)展有限公司）；Gel DOC XR+全自動凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RAD）。

2 方法

2.1 心衰模型建立 阿霉素，按3 mg/kg劑量溶于1 mL的生理鹽水，腹腔注射，第1天給予2 mg/kg，第4天起按3 mg/kg，每周1次，共6周，累計劑量達20 mg/kg。

2.2 給藥 模型組，在心衰模型的基礎(chǔ)上，腹腔注射生理鹽水2 mL，每天1次。丹參多酚酸鹽低、高劑量組：心衰模型基礎(chǔ)上，同時分別予以丹參多酚酸鹽24.219、48.438 mg/（kg·d）溶于5%葡萄糖2 mL，腹腔注射每日1次?？ㄍ衅绽M，心衰模型基礎(chǔ)上，每天同時予以卡托普利水溶液灌胃10 mg/（kg·d）。中西藥聯(lián)合組：心衰模型基礎(chǔ)上，同時予以丹參多酚酸48.438 mg/（kg·d）溶于5%葡萄糖2 mL，腹腔注射每日1次，此外每天卡托普利水溶液灌胃，10 mg/（kg·d）。正常對照組，腹腔注射生理鹽水2 mL，每天1次。上述干預(yù)連續(xù)8周。8周后，模型組、丹參多酚酸鹽低劑量組各死亡4只，丹參多酚酸鹽高劑量組死亡3只，卡托普利組及中西藥聯(lián)合組死亡2只，正常對照組沒有死亡。

2.3 心功能測定 8周后，動物5%水合氯醛4 mL/kg麻醉后，運用導(dǎo)管、RM6240多道生物信號采集處理系統(tǒng)，記錄心室壓力曲線，計算出平均心室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、平均心室舒張壓（left ventricular end-diastolic pressure，LVDP），平均心室內(nèi)壓最大上升速率（+dP/dtmax），平均等容舒張期室內(nèi)壓最大下降速率（-dP/dtmax）。上述指標，模型組與正常對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異 （P＜0.05），即心衰模型造模成功。

2.4 心肌膠原的分析 選取大鼠左室中段心肌組織10%甲醛溶液中固定，脫水，石蠟包埋，組織切片，行天狼猩紅染色。染色后，心肌細胞呈現(xiàn)黃色，間質(zhì)膠原呈紅色。采用Motic Images Advanced 3.0軟件，測量心肌膠原容積分數(shù) （%）（CVF）、心肌血管周圍膠原面積與管腔面積的比例（%）（PVCA）。其中CVF=膠原面積/總面積，PVCA =小動脈管腔周圍膠原面積/動脈管腔面積。每個標本隨機取12個視野，即心肌內(nèi)膜4個、心肌外膜4個、心肌小血管4個視野，進行測量，計算其平均值。

2.5 熒光PCR法檢測MMP-3、TIMP-1的mRNA水平 液氮中取心肌組織，運用Trizol試劑提取心肌總mRNA。選擇大鼠的GAPDH為內(nèi)參基因，依據(jù)實時定量PCR（SYBR法）引物設(shè)計原則，設(shè)計引物 （見表1）。用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix合成cDNA第一鏈。SYBR的熒光定量PCR操作步驟：PCR反應(yīng)液：TransStart Top Green qPCR SuperMix（2×）10μL，PCR Forward Primer（10μmol/L）0.4μL，PCR Reverse Primer（10 uM）0.4μL，Rox Reference DyeⅡ（50×）0.4μL，cDNA template 2.0μL，滅菌蒸餾水加至20μL。選擇ABI7500PCR儀按以下程序進行定時定量PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)的程序設(shè)置為：94℃，30 s；94℃，5 s，60℃，34 s；40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后進行結(jié)果分析。選取15～25個擴增循環(huán)數(shù) （Ct）的熒光值，計算3個平行復(fù)孔的擴增效率，計算ΔΔCt【（Ct實驗組目的基因-Ct實驗組內(nèi)參基因）-（Ct對照組目的基因-Ct對照組內(nèi)參基因）】，計算實驗組目的基因與對照組的基因的差異表達量（2-ΔΔCt=實驗組目的基因/對照組目的基因）。

表1 MMP-3、TIMP-1和GAPDH的正向引物和反向引物

2.6 Western blot檢測心肌組織MMP-3、TIMP-1的表達

依據(jù)組織質(zhì)量20mg需要200μL裂解液的比例，加入2μL 100mmol/L的PMSF和198μL裂解液，使PMSF的最終濃度為1 mmol/L。玻璃勻裝器勻漿，直至充分裂解，離心，14 000×g，5 Min，小心吸取上清液分裝備用。按照BCA蛋白定量試劑盒使用說明書操作，測定蛋白濃度，蛋白變性后備用。配置SDS—PAGE膠，用微量加樣器將樣品加于凝膠的加樣孔中，保證每樣品含蛋白50μg。插好電極，以20 V恒壓跑10 min穩(wěn)定后調(diào)至60 V恒壓電泳分離 （待溴紛蘭至膠邊緣即可）。分別予以100 V恒壓50、30min，以相應(yīng)Marker轉(zhuǎn)完為準，轉(zhuǎn)至PVDF膜，洗膜3次，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗均為1∶500稀釋后，在4℃孵育過夜（12～16 h），洗膜3次，于二抗 （1∶5 000），室溫孵育1 h，洗膜3次，加入ECL顯影成像。顯影信號的強弱用凝膠成像及分析系統(tǒng)分析灰度值。用目標蛋白與β-actin條帶的灰度值比值來估算目標蛋白的含有量。

2.7 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示。檢驗方法：數(shù)據(jù)先進行正態(tài)性分布和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布且方差齊性，采用單因素方差分析（ANOVA，LSD）檢驗，若正態(tài)分布但方差不齊，則采用單因素方差分析 （ANOVA，Dunnett's C）進行檢驗。若呈偏態(tài)分布者，則采用多個樣本比較的非參檢驗（Kruskal-Wallis Test），采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行處理，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠心肌纖維的比較 心肌間質(zhì)膠原染成紅色，血管周圍膠原分布較多。與正常對照組相比，模型組心肌內(nèi)膜與外膜膠原CVF和PVCA明顯增高（P＜0.01）。丹參多酚酸鹽高劑量組、卡托普利組、中西藥聯(lián)合組心肌CVF和PVCA較模型組明顯降低 （P＜0.05，0.01，0.01），中西藥聯(lián)合組優(yōu)于卡托普利組 （P＜0.05）。見表2、圖1。

表2 各組大鼠心肌內(nèi)膜、外膜CVF和PVCA比較（%，x±s）

圖1 各組心肌天狼猩紅染色 （×100）

3.2 各組大鼠心肌MMP-3、TIMP-1的mRNA水平的比較

與正常對照組相比，模型組MMP-3的mRNA水平明顯增高 （P＜0.01）。與模型組相比，丹參多酚酸鹽高劑量組、卡托普利組、中西藥聯(lián)合組下調(diào)MMP-3的mRNA水平（P＜0.05，0.01，0.01），且中西藥聯(lián)合組低于卡托普利組（P＜0.05）。與正常對照組相比，模型組TIMP-1的mRNA水平明顯降低 （P＜0.01）。與模型組相比，丹參多酚酸鹽高劑量組、卡托普利組、中西藥聯(lián)合組上調(diào)TIMP-1的mRNA水平 （P＜0.05，0.01，0.01），且中西藥聯(lián)合組高于卡托普利組 （P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠心肌MMP-3、TIMP-1的MRNA水平比較（x±s）

3.3 各組大鼠心肌MMP3、TIMP-1蛋白表達的比較 與正常對照組相比，模型組MMP-3表達明顯增高 （P＜0.01）。與模型組相比，丹參多酚酸鹽高劑量組、卡托普利組、中西藥聯(lián)合組下調(diào)MMP-3表達（P＜0.05，0.01，0.01），且中西藥聯(lián)合組低于卡托普利組 （P＜0.05）。見圖2。與正常對照組相比，模型組TIMP-1的表達明顯降低 （P＜0.01）。與模型組相比，丹參多酚酸鹽高劑量組、卡托普利組、中西藥聯(lián)合組上調(diào)TIMP-1的表達（P＜0.05，0.01，0.01），且中西藥聯(lián)合組高于卡托普利組 （P＜0.05）。見表4、圖3。

圖2 各組心肌MMP-3蛋白的表達

表4 各組大鼠心肌MMP-3、TIMP-1表達的比較（x±s）

圖3 各組心肌TIMP-1蛋白的表達

4 討論

心肌細胞外基質(zhì)重構(gòu)是非心肌細胞的增生及心肌細胞外基質(zhì)的改建，具體表現(xiàn)在心肌間質(zhì)膠原的增多、膠原比例的改變。MMPs與TIMPs是參與基質(zhì)重構(gòu)的重要因素。

MMPs是一種鋅依賴的酶家族，對細胞基質(zhì)具有降解作用，能分解纖維類膠原，其家族分為間質(zhì)膠原酶、明膠酶、間質(zhì)溶解素及膜型MMPs等亞族，在心肌重構(gòu)過程中具有重要的作用。MMP-3是MMPs中的1種，廣泛存在于多種組織和細胞中，除能降解膠原、基底膜成分外，還能激活其他種類的MMPs，引起級聯(lián)反應(yīng)［3］，導(dǎo)致心肌膠原過度降解，膠原結(jié)構(gòu)破壞，使心肌膠原重構(gòu)，引起心室腔擴大、室壁變薄，促進心肌的重構(gòu)及失代償期心衰的進展［4］。有研究表明，冠心病患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶3與左心室射血分數(shù)呈負相關(guān)［5］。

擴張型心肌病患者隨心功能的惡化，心肌組織MMP-3的表達及活性明顯增加。起搏誘發(fā)的慢性充血性心衰、風(fēng)濕性心臟病患者，心肌組織MMP-3表達與其心功能亦呈負相關(guān)［6］。

TIMPs家族是能抑制MMPs活性的一組蛋白群，其以1∶1的比例與MMPs結(jié)合形成復(fù)合體，從而阻斷MMPs結(jié)合底物，阻礙MMPs進入膠原基質(zhì)發(fā)揮作用。如果心肌組織中TIMPs下降，可使MMPs增多，引起心肌膠原降解，心腔擴大、變形，導(dǎo)致心室重構(gòu)。TIMP-1作為TIMPs中的一員，能抑制絕大多數(shù)MMPs，在纖維重構(gòu)中發(fā)揮著重要的作用。動物實驗證實：左心室壓力超負荷情況下TIMP-1mRNA的表達顯著增加［7］。亦有報道，在人心力衰竭時TIMP-1表達下調(diào)［8］，隨心衰加重，TIMP-1mRNA表達下調(diào)［6］。

在心肌受損時，在兒茶酚胺、血管緊張素Ⅱ、腫瘤壞死因子α等神經(jīng)內(nèi)分泌細胞因子的作用下，MMPs表達上調(diào)，TIMPs下降，導(dǎo)致心肌間質(zhì)纖維膠原合成和降解之間動態(tài)平衡的破壞，膠原降解加速，導(dǎo)致室腔擴大、室壁變薄、心室?guī)缀涡螤罡淖?，?dǎo)致心功能惡化及心肌纖維化。有報道：充血性心衰患者心功能分級，與MMP-3呈正相關(guān)，與TIMP1呈負相關(guān)，即心功能分級越高，MMP-3值越高，而TIMP-1值越低［9］。

中醫(yī)活血法能夠改善陽虛心衰大鼠的心功能及心室的重構(gòu)，降低基質(zhì)金屬蛋白酶-9基因及蛋白的表達，增加TIMP-1mRNA的表達［10］。丹參多酚酸鹽是從活血化瘀代表性中藥丹參中提取的，為水溶性酚類化合物，其具有抗氧自由基，降低血液黏度，抗血栓形成，改善血管內(nèi)皮細胞功能，抑制超敏C反應(yīng)蛋白、腫瘤壞死因子α及白介素6［11］，降低血漿BNP水平，改善心功能［12-13］的作用。此外其尚可降低基質(zhì)金屬蛋白酶-9［14］，基質(zhì)金屬蛋白酶-2［15］，起到抗纖維化的作用。

本實驗結(jié)果表明，高劑量丹參多酚酸鹽組及中西藥聯(lián)合組的大鼠心肌CVF和PVCA，與模型組相比均有所下降，聯(lián)合組上述結(jié)果最明顯，且優(yōu)于單純卡托普利組。在心肌MMP-3方面，丹參多酚酸鹽高劑量組及中西藥聯(lián)合組都能夠降低其基因的轉(zhuǎn)錄及蛋白的表達，且中西藥聯(lián)合組與單純卡托普利組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異。在TIMP-1方面，高劑量組的丹參多酚酸鹽較心衰模型組，無論基因還是蛋白表達方面均有所增高，但丹參多酚酸鹽和卡托普利聯(lián)用時效果最為明顯，且高于卡托普利組。

本研究通過建造大鼠心衰模型，觀察丹參多酚酸鹽對心衰大鼠心肌膠原重構(gòu)的影響，證實丹參多酚酸鹽能減少心衰大鼠心肌間質(zhì)膠原的沉積，能夠減少心肌MMP-3基因的轉(zhuǎn)錄及其蛋白的表達，同時增加TIMP-1基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達，使MMP-3/TIMP-1比值下降，減少膠原的降解，起到抗心肌纖維重構(gòu)的作用。丹參多酚酸鹽的上述作用可能與其降低兒茶酚胺、血管緊張素Ⅱ、TNF-α有關(guān)，但其具體機制有待進一步研究探討。此外，關(guān)于丹參多酚酸鹽與卡托普利聯(lián)合用藥對心肌纖維重構(gòu)及MMP-3、TIMP-1的評價，究竟是何種劑量聯(lián)合方式效果最好，則有待進一步根據(jù)中效原理，或通過正交試驗設(shè)計來進行研究評定。

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R285.5

：B

：1001-1528（2015）05-1099-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.040

2014-02-18

2011年福建省衛(wèi)生廳青年科研課題 （2011-1-41）；2013年福建省中青年教師教育科研項目 （科技B類）（JB13105）

陳 成 （1981—），男，碩士，主治醫(yī)師，從事中西藥結(jié)合治療心血管病臨床研究。Tel：13850152745，E-mail：chencheng9936@163.com