芪白平肺膠囊對COPD痰瘀阻肺證大鼠肺動脈Rock-1表達的影響

王傳博， 方 莉， 王婕瓊，3， 尹婷婷， 童佳兵，3， 楊 程，3， 李澤庚，3*

（1.安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院中醫(yī)科，安徽合肥230601；2.安徽中醫(yī)藥大學中醫(yī)肺病學科 （國家中醫(yī)藥管理局重點學科），安徽合肥230031；3.安徽省中醫(yī)藥科學院呼吸病研究所，安徽合肥230038）

芪白平肺膠囊對COPD痰瘀阻肺證大鼠肺動脈Rock-1表達的影響

王傳博1，2，3， 方 莉2， 王婕瓊2，3， 尹婷婷2， 童佳兵2，3， 楊 程2，3， 李澤庚2，3*

（1.安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院中醫(yī)科，安徽合肥230601；2.安徽中醫(yī)藥大學中醫(yī)肺病學科 （國家中醫(yī)藥管理局重點學科），安徽合肥230031；3.安徽省中醫(yī)藥科學院呼吸病研究所，安徽合肥230038）

目的探討芪白平肺膠囊對慢性阻塞性肺疾病 （COPD）痰瘀阻肺證模型大鼠肺動脈Rock-1表達的影響。方法

芪白平肺膠囊；慢性阻塞性肺疾?。惶叼鲎璺巫C；Rho關聯(lián)卷曲蛋白激酶

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是一種可以預防和可以治療的常見疾病，其特征是持續(xù)存在的氣流受限。氣流受限呈進行性發(fā)展，伴有氣道和肺對有害顆粒或氣體所致慢性炎癥反應的增加［1］。COPD由于長期的氣道阻塞造成肺泡缺氧及二氧化碳潴留，促使肺血管收縮、肺血管重構(gòu)，從而引起缺氧性肺動脈高壓，易發(fā)生右心衰竭和死亡［2］。Rho/Rho激酶信號通路的關鍵信號分子包括Rho GTP酶、Rho激酶和肌球蛋白磷酸酶。Rho通過激活下游靶分子-Rho激酶調(diào)節(jié)細胞的多種生物學行為和功能，包括收縮、黏附、遷移、增殖、凋亡、基因表達等。新近研究發(fā)現(xiàn)，肺血管收縮和結(jié)構(gòu)重建與Rho/Rho激酶信號通路的異常激活有關［3］。本研究在前期研究基礎上，以益氣化痰活血之法，應用芪白平肺膠囊調(diào)控Rho激酶，干預COPD肺血管重構(gòu)。

1 材料

1.1 動物 清潔級健康SD雄性大鼠50只，體質(zhì)量在（230±20）g，實驗動物由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供（許可證號：SCXK2011002）。隨機分組為正常組、模型組、芪白平肺膠囊低劑量組、芪白平肺膠囊高劑量組、法舒地爾組，每組10只。動物飼養(yǎng)室為清潔級，控制溫度 （22± 2）℃。

1.2 藥物與試劑 芪白平肺膠囊，由安徽中醫(yī)藥大學制劑中心提供；法舒地爾注射液2 mL：30 mg，天津紅日藥業(yè)股份有限公司（批號H20040356）。Western blot一抗試劑：Anti-ROCK1 antibody英國艾美捷科技有限公司；Anti-Myosin Phosphatase（phospho T853）antibody，英國艾美捷科技有限公司。二抗試劑：Goat anti-rabbit IgG-HRP上海盈東生物科技有限公司，Goat anti-mouse IgG-HRP上海盈東生物科技有限公司。

1.3 儀器與設備 動物強迫游泳裝置、熏煙箱 （安徽中醫(yī)藥大學制）；動物實驗低氧裝置 （長沙華曦電子科技有限公司）；紅梅牌香煙 （含焦油為13 mg，含煙堿為1.1 mg，紅塔卷煙集團）。

2 方法

2.1 模型建立 參照肖詩亮等［4］、李澤庚等［5］的造模方法，建立慢性阻塞性肺疾病痰瘀阻肺證大鼠模型。每天將大鼠放入恒溫 （43±1）℃水槽中強迫游泳30 min，然后置于1 m3熏煙箱內(nèi)香煙熏1 h，最后將大鼠置于常壓低氧裝置內(nèi)7 h，自動測氧儀調(diào)控氧濃度至 （10±0.5）%，造模每周進行6 d，第7天暫停，連續(xù)4周。

2.2 給藥方法 每天造模結(jié)束后分別予以藥物灌胃1次，每周進行6 d，第7天暫停，連續(xù)4周。正常組、模型組每天生理鹽水灌胃10 mL/kg，芪白平肺膠囊高劑量組每天給藥量為10mL/kg（每1mL含芪白平肺膠囊100mg），芪白平肺膠囊低劑量組每天給藥量為10 mL/kg（每1 mL含芪白平肺膠囊25 mg），法舒地爾組每天劑量10 mL/kg（每1 mL含法舒地爾3 mg）。造模結(jié)束次日進行指標檢測。

2.3 Western blot檢測Rock-1及磷酸化MYPT-1蛋白表達 腹主動脈放血處死大鼠，分離肺葉外肺動脈，將少量組織約200mg置于培養(yǎng)皿中，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎 （在冰塊上操作，盡量減少蛋白的損失），然后將其移入勻漿器中；加入300μL組織蛋白裂解緩沖液，并且在冰上充分研磨，重復數(shù)次；充分裂解后用移液器取100μL裂解液于0.5mLEP管中，在40℃下15 000 r/min離心10 min，取上清分裝于0.5 mL離心管中，加等體積的蛋白上樣液，在液氮中速凍后置于-80℃冰箱保存，備用。測定總蛋白濃度用BSA試劑盒。計算上樣量，使每孔蛋白上樣量一致。SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將膜用（PBST+5%的脫脂奶粉）封閉后，加入抗HMGB1單抗（稀釋度1∶1 000），室溫孵育2 h，將膜漂洗3次后加入二抗山羊抗兔IgG（稀釋度1∶5 000）室溫孵育1 h，用PBST將膜漂洗3次，加入化學發(fā)光試劑，X線膠片曝光顯影記錄影像，結(jié)果用凝膠成像分析系統(tǒng)分析，計算相對表達量，以Rock-1與GAPDH比值作為相對表達水平。

2.4 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)分析應用SPSS 17.0統(tǒng)計學分析軟件，計量資料結(jié)果全部采用均數(shù)±標準差 （x±s）表示，采用單因素方差分析，經(jīng)正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗后，方差齊時采用最小顯著法（Least-significant Difference，LSD）進行兩兩比較，方差不齊時用Games-Howell法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 大鼠肺動脈ROCK-1以及磷酸化MYPT-1蛋白表達

芪白平肺膠囊高劑量組、法舒地爾組Rock-1、PMYPT-1積分光密度值較模型組顯著降低 （P＜0.01）；芪白平肺膠囊高劑量組與法舒地爾組Rock-1、P-MYPT-1積分光密度值比較差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）。結(jié)果表明，芪白平肺膠囊與法舒地爾均可降低模型大鼠肺動脈Rock-1和P-MYPT-1的表達，進而干預肺血管重構(gòu)。具體見表1、圖1。

表1 各組大鼠肺動脈Rock-1和P-MYPT-1吸光度積分比較 （x±s）

圖1 各組大鼠ROCK1、P-MYPT-1的W estern b lot結(jié)果

4 討論

肺血管重構(gòu)是慢性阻塞性肺疾病 （COPD）并發(fā)肺動脈高壓的重要病理生理過程，其形成過程較為復雜，研究認為長期低氧是其發(fā)生的始動因素，并涉及神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等多個系統(tǒng)。目前已認識到只有對COPD肺血管病變的綜合防治才能阻止COPD肺動脈高壓的發(fā)生與發(fā)展，從而達到早期防治的目的。有研究顯示Rho激酶的活化與血管平滑肌的增生和血管的重構(gòu)有著密切的關系，參與了動脈粥樣硬化、高血壓、肺心病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程［6］，Rho激酶有Rock-1和Rock-2兩個亞基，研究顯示［7］Rock-1對血管平滑肌細胞的促增殖作用較明顯。

慢性阻塞性肺疾病屬中醫(yī)學 “肺脹”范疇。在長期研究的基礎上，觀察COPD出現(xiàn)肺血管重構(gòu)、肺動脈高壓階段時表現(xiàn)如下：氣喘胸悶，口唇爪甲青紫，或喘促氣短，動則喘甚，肢冷面青，下肢浮腫，小便短少，舌質(zhì)紫暗或有瘀斑，脈細澀或沉弱等。據(jù)此癥狀表現(xiàn)當同于肺脹之痰瘀阻肺證。我們采用 “益氣化痰散瘀”之法，創(chuàng)制 “芪白平肺膠囊”（此方在國家級名老中醫(yī)韓明向臨床經(jīng)驗方的基礎上，由李澤庚教授帶領的呼吸學科經(jīng)過長期的實驗及臨床驗證，優(yōu)化而形成）。本方證候乃肺氣虧虛，陽氣微弱，痰瘀互結(jié)所致。肺為氣之主，主一身之氣。肺氣虛則宣肅失常而咳嗽、喘促；肺氣虛則治節(jié)失常，水液不循常道凝聚為痰，血液運行無力停滯為瘀，可見咳痰、下肢浮腫；病程日久，氣損及陽，陽氣虧損則畏寒肢冷；舌脈之象乃氣虛陽微痰瘀互結(jié)之征。方中黃芪甘溫而入脾肺經(jīng)，大補脾肺之氣，生曬參補元氣、益脾肺，合為君藥，共奏益氣溫陽之功；川芎活血行氣，使瘀去血行，薤白理氣通陽，葶藶子瀉肺平喘，行水消腫，三者共為臣藥；五味子味酸收斂，甘溫而潤，能上斂肺氣，下滋腎陰，為治療久咳虛喘之要藥。地龍清肺定喘、通行經(jīng)絡，合為佐藥。諸藥合用，益氣、溫陽、化痰、散瘀。

芪白平肺膠囊經(jīng)長期臨床應用證實能減輕COPD患者咳、痰、喘癥狀，改善生活質(zhì)量等良好作用［8-10］。既往動物實驗表明［11-15］，芪白平肺膠囊可以改善COPD模型大鼠肺功能、右心肥厚、T淋巴細胞亞群的表達，緩解低氧血癥等。本實驗表明芪白平肺膠囊可以降低COPD痰瘀阻肺證模型大鼠肺組織Rock-1、P-MYPT-1表達，減輕肺血管重構(gòu)現(xiàn)象。

［1］中華醫(yī)學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組.慢性阻塞性肺疾病診治指南 （2013年修訂版）［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2013，36（4）：1-10.

［2］倪子俞.慢性阻塞性肺疾病與慢性肺源性心臟?。跰］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2009：121.

［3］趙雪鋒，彭 峰，蔡 茜，等.RhoA/Rho激酶信號通路與肺動脈高壓［J］.國際病理科學與臨床雜志，2011，16（3）：256-258.

［4］肖詩亮，高思海，楊辰垣.常壓缺氧性大鼠肺動脈高壓模型的改進［J］.臨床心血管病雜志，2001，17（4）：190.

［5］李澤庚，王傳博，彭 波，等.慢性阻塞性肺疾病痰瘀阻肺證大鼠模型的建立［J］.天津中醫(yī)藥，2010，27（1）：43-45.

［6］Nossaman B D，Kadowitz P J.The role of the RhoA/rho-kinase pathway in pulmonary hypertension［J］.Curr Drug Discov Technol，2009，6（1）：59-71.

［7］Mcmurtry IF，Abe K，Ota H，etal.Rho kinase-mediatedvasoconstriction in pulmonary hypertension［J］.Adv Exp Med Biol，2010，661（4）：299-308.

［8］李澤庚，王傳博，彭 波，等.芪白平肺膠囊對慢性阻塞性肺疾病患者BODE指數(shù)的影響［J］.中醫(yī)雜志，2010，51（11）：987-989.

［9］王傳博，李澤庚，彭 波，等.芪白平肺膠囊對慢阻肺患者圣喬治呼吸問卷積分的影響［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2012，30（2）：266-268.

［10］王傳博，王婕瓊，李澤庚，等.基于肺氣虛證分度的慢性阻塞性肺疾病分證診治思路與方法［J］.中醫(yī)雜志，2013，54（18）：1550-1552.

［11］王傳博，李澤庚，彭 波，等.芪白平肺膠囊對慢性阻塞性肺疾病痰瘀阻肺證模型大鼠NO、ET-1及FIB的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（1）：91-93.

［12］王傳博，李澤庚，彭 波，等.芪白平肺膠囊對慢阻肺痰瘀阻肺證模型大鼠右心肥厚指標的影響［J］.國際中醫(yī)中藥，2010，32（1）：5-6.

［13］李澤庚，王傳博，彭 波，等.芪白平肺膠囊對慢阻肺痰瘀阻肺證模型大鼠血氣分析的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21（3）：569-570.

［14］李澤庚，王傳博，彭 波，等.芪白平肺膠囊對慢阻肺痰瘀阻肺證模型大鼠肺功能的影響［J］.上海中醫(yī)藥大學學報，2009，23（6）：51-53.

［15］李澤庚，王傳博，彭 波，等.芪白平肺膠囊對慢阻肺痰瘀阻肺證模型大鼠T淋巴細胞亞群的影響［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2012，30（1）：7-9.

R285.5

：B

：1001-1528（2015）05-1096-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.039

2014-06-15

國家自然科學基金 （81202808，81373598）；安徽醫(yī)科大學?；?（2012xkj061）

王傳博 （1977—），男，碩士，從事中醫(yī)藥防治肺病研究。

*通信作者：李澤庚 （1962—），男，碩士，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，從事中醫(yī)藥防治肺病研究。Tel：（0551）65169269，E-mail：wangcb120@163.com

復制COPD痰瘀阻肺證大鼠模型，給予芪白平肺膠囊、法舒地爾干預，Western blot檢測大鼠肺動脈Rock-1及磷酸化MYPT-1蛋白表達。結(jié)果模型組、芪白平肺膠囊低劑量組Rock-1、P-MYPT-1積分光密度值較正常組顯著增高（P＜0.01）；與模型組相比，芪白平肺膠囊高劑量組、法舒地爾組Rock-1、P-MYPT-1積分光密度值較模型組顯著降低 （P＜0.01）；芪白平肺膠囊低劑量組Rock-1積分光密度值較模型組顯著降低 （P＜0.01）；芪白平肺膠囊低劑量組P-MYPT-1積分光密度值較模型組降低（P＜0.05）；芪白平肺膠囊高劑量組與法舒地爾組Rock-1、P-MYPT-1積分光密度值比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論芪白平肺膠囊可降低COPD痰瘀阻肺證模型大鼠Rock-1、P-MYPT-1表達，減輕肺血管重構(gòu)。