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    五子衍宗方對環(huán)磷酰胺致小鼠肝臟細胞DNA損傷的保護作用

    2015-01-13 09:01:53黃威峰劉苗苗張長城
    中成藥 2015年5期
    關(guān)鍵詞:五子環(huán)磷酰胺肝臟

    黃威峰, 劉苗苗,2, 袁 丁, 彭 奔, 張長城*

    (1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖北宜昌443002;2.三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,湖北宜昌443002)

    五子衍宗方對環(huán)磷酰胺致小鼠肝臟細胞DNA損傷的保護作用

    黃威峰1, 劉苗苗1,2, 袁 丁1, 彭 奔1, 張長城1*

    (1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院,湖北宜昌443002;2.三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,湖北宜昌443002)

    目的研究五子衍宗方對環(huán)磷酰胺(CTX)誘導(dǎo)的小鼠肝臟細胞DNA損傷的保護作用。方法將BALB/c小鼠隨機分為正常對照組,模型組,五子衍宗方低、高劑量組,每組10只。五子衍宗方組預(yù)給藥一周之后,除正常對照組之外,其余各組注射CTX(100 mg/kg)隔天給藥共3次,末次注射CTX 12 h后處死小鼠。檢測小鼠的肝臟指數(shù),血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 (AST)活力。硫代巴比妥酸法檢測肝臟中丙二醛 (MDA)的量,ELISA檢測肝臟中8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)的量,單細胞凝膠電泳技術(shù)檢測肝臟細胞的DNA損傷。結(jié)果五子衍宗方能夠升高小鼠的肝臟指數(shù),降低ALT、AST的活力,降低肝臟中的8-OHdG、MDA的量,五子衍宗方組均可以使小鼠Olive尾矩、尾長、尾距和尾部DNA%降低。結(jié)論五子衍宗方能拮抗CTX造成的小鼠肝臟細胞的DNA損傷,提高肝臟的抗氧化能力。

    五子衍宗方;環(huán)磷酰胺;DNA損傷;氧化損傷

    環(huán)磷酰胺 (CTX)是臨床上廣泛使用的烷化劑類抗腫瘤藥和免疫抑制劑。CTX在體外沒有烷化活性,需在體內(nèi)經(jīng)肝臟的P-450混合功能氧化酶代謝生成具有烷化活性的4羥基環(huán)磷酰胺、磷酰胺氮芥、丙烯醛和大量的活性氧自由基。磷酰胺氮芥和丙烯醛能夠與DNA交聯(lián),代謝產(chǎn)生的自由基也會和DNA發(fā)生結(jié)合,引起DNA單雙鏈的斷裂,從而抑制細胞增殖,促進細胞凋亡,最終導(dǎo)致細胞的死亡。CTX在臨床上有廣泛的應(yīng)用,但其同時也會對正常的細胞表現(xiàn)出嚴重的毒性,在用CTX治療的病人中出現(xiàn)二次癌癥的幾率非常高,國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)把CTX作為致癌物。CTX的臨床應(yīng)用因?qū)φ<毎亩拘远幌拗?,因此減少CTX引起的正常細胞的DNA損傷顯得非常重要[1]。

    五子衍宗方是由菟絲子、枸杞子、五味子、車前子、覆盆子五味中藥組成,藥理研究發(fā)現(xiàn)五子衍宗丸具有抗自由基、抗衰老、增強免疫力等功效。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),五子衍宗方具有提高環(huán)磷酰胺模型小鼠免疫功能、增強抗氧化損傷能力的藥理作用,對小鼠免疫低下、骨髓抑制、生精障礙等都有較好的防治作用。進一步研究顯示,五子衍宗方可提高環(huán)磷酰胺小鼠體內(nèi)的抗氧化能力,降低小鼠血漿、睪丸組織中MDA水平,增加SOD活力,提示五子衍宗方通過抗氧化損傷來拮抗環(huán)磷酰胺毒性[2-3]。近期研究證明,五子衍宗方、菟絲子和枸杞子可以減少自由基,提高機體的抗氧化能力,減少外周血白細胞線粒體的DNA缺失,保護老年大鼠骨骼肌線粒體DNA的損傷,說明五子衍宗方、菟絲子和枸杞子對DNA氧化損傷具有良好的保護作用[4-5]。但五子衍宗丸能否拮抗環(huán)磷酰胺造成的肝臟細胞DNA損傷仍有待進一步研究。

    1 材料

    1.1 實驗動物 8~9周齡的SPF級BALB/c種小鼠,體質(zhì)量22~25 g,由湖北省實驗動物中心提供,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(鄂)2008-0005。在相對濕度55%~65%,溫度 (20±2)℃的環(huán)境下分籠飼養(yǎng)。

    1.2 藥品 MDA、考馬斯亮藍試劑盒購自南京建成生物工程研究所。環(huán)磷酰胺購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。五子衍宗方由400 g枸杞子、400 g菟絲子、200 g覆盆子、100 g車前子、50 g五味子組成。按照傳統(tǒng)方法煎取,濃縮至浸膏,提取率為18.8%。

    1.3 儀器 穩(wěn)流可調(diào)式電泳儀 (北京六一儀器廠),BX51型Olympus熒光顯微鏡并配有CCD攝像裝置(日本),紫外分光光度計。

    2 方法

    2.1 分組和給藥方法 40只雄性BALB/c小鼠,隨機分為空白組、模型組、五子衍宗方低、高劑量組每組10只。五子衍宗方組預(yù)給藥一周之后,除空白對照組腹腔注射生理鹽水,其余各組注射CTX100 mg/kg隔天給藥共3次,末次注射環(huán)磷酰胺12 h后處死小鼠。

    2.2 指標檢測

    2.2.1 小鼠肝臟指數(shù)的測定 末次給藥12 h后稱定質(zhì)量,處死小鼠,迅速取出肝臟,用生理鹽水洗凈之后,經(jīng)濾紙擦去表面的水分并稱定質(zhì)量,以肝臟質(zhì)量 (mg)/體質(zhì)量(g)來計算肝臟指數(shù)。

    2.2.2 小鼠血清中生化指標的測定 各組小鼠取血后靜置30min,3 500 r/min離心10 min,常規(guī)分離血清,送至宜昌市中心醫(yī)院檢測血清ALT、AST水平。

    2.2.3 肝臟中MDA和8-OHdG的測定 取0.1 g肝臟組織用PBS洗兩次,加入9倍的生理鹽水,倒入玻璃勻漿管中,在冰上勻漿5min,將組織勻漿以3 000 r/min離心15 min,棄下面的沉淀留上清。按照說明書,用比色法測定肝臟中MDA和組織中蛋白的水平,ELISA法檢測肝臟勻漿中8-OHdG水平。

    2.2.4 堿性單細胞凝膠電泳 取0.1~0.3 g肝臟組織,加1 mL PBS用剪刀剪碎,200尼龍網(wǎng)過濾,用細胞計數(shù)板計數(shù),調(diào)整細胞密度至1×106個/mL。在載玻片上粘上小玻璃條制成微電泳槽,第1層膠是將PBS配制的1%正常熔點的瓊脂糖煮沸后取100μL鋪在微電泳槽內(nèi),于4℃固化5 min。第2層膠是將100μL于37℃水浴中保溫的0.5%的低熔點的瓊脂糖與100μL的肝臟細胞懸液混勻后加到第1層膠上,4℃固化5 min。將載玻片浸入新鮮配制的4℃的裂解液,4℃避光裂解2 h。取出后用蒸餾水沖去多余的鹽分,將凝膠載玻片放入電泳槽中,加入4℃預(yù)冷的電泳液至蓋過膠面2~3 cm,4℃避光解旋20 min。調(diào)節(jié)至電壓25 V,電流300 mA,4℃避光電泳20 min。電泳結(jié)束后,將載玻片從電泳槽中取出浸入pH 7.0 Tris-HCl中和液中,中和15 min每5min換液1次。在凝膠上滴加EB(10 μg/L)100μL,2 min后用蒸餾水洗滌2次。將染色好的載玻片放在熒光顯微鏡的40倍鏡下拍照,采用casp彗星分析軟件對彗星圖像進行分析。選取彗星圖像的Olive尾矩、尾距、尾長和尾部DNA%進行分析。

    2.3 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13.0軟件處理,實驗各個指標均用均數(shù) ±標準差表示 (x±s),以單因素方差分析(one-way ANOVA)進行多組間差異的比較,以Dunnett-t檢驗比較兩組間均數(shù)的差異。

    3 結(jié)果

    3.1 五子衍宗方對小鼠體質(zhì)量及肝臟指數(shù)的影響 模型組小鼠注射CTX以后有4只陸續(xù)死亡,其余體質(zhì)量明顯降低,肝臟質(zhì)量及肝臟指數(shù)顯著低于正常對照組,五子衍宗方低、高劑量組均可增加小鼠的體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量及肝臟指數(shù)。結(jié)果見表1。

    表1 五子衍宗方對小鼠體質(zhì)量,肝臟質(zhì)量,肝臟指數(shù)的影響(x±s,n=6)

    3.2 五子衍宗方對小鼠血清中ALT和AST變化影響 模型組中ALT、AST的活力較正常對照組顯著升高,五子衍宗方高劑量組可顯著降低ALT、AST的活力。結(jié)果見表2。

    表2 五子衍宗方對小鼠ALT、AST活力的影響(x±s,n=6)

    3.3 五子衍宗方對模型小鼠肝臟MDA、8-OHdG水平的影響 與正常對照組比較,模型組中MDA和8-OHdG的水平顯著升高。五子衍宗方組能夠顯著降低CTX引起的小鼠肝臟組織中MDA、8-OHdG水平。結(jié)果見表3。

    3.4 五子衍宗方對小鼠肝臟DNA損傷的影響 模型組的小鼠肝臟細胞的彗星電泳圖像的Olive尾矩、尾距、尾長和尾部DNA%都有明顯增加,五子衍宗方低、高劑量組都能明顯降低小鼠肝臟細胞的彗星圖像的Olive尾矩、尾距、尾長和尾部DNA%。各組的單細胞凝膠圖像結(jié)果如圖1,五子衍宗方對CTX造成的小鼠肝臟細胞DNA損傷的指標的結(jié)果見表4。

    表3 五子衍宗方對模型小鼠肝臟MDA、8-OHdG水平的影響(x±s,n=6)

    圖1 肝臟細胞的彗星實驗圖像

    表4 五子衍宗方對小鼠肝臟細胞中O live尾矩、尾距、尾長和尾部DNA%的影響(x±s,n=4)

    4 討論

    環(huán)鱗酰胺 (CTX)是常用的氮芥類的抗腫瘤藥物,常用來治療各種惡性腫瘤與非惡性腫瘤,也是臨床上常用的免疫抑制劑[6]。CTX代謝時會產(chǎn)生大量的活性氧自由基,自由基能夠和體內(nèi)所有的生物分子如脂類,蛋白質(zhì),碳水化合物和遺傳物質(zhì)DNA等發(fā)生結(jié)合,影響體內(nèi)生物酶的活性,從而影響DNA的正常合成和修復(fù)[7-8]。其活性代謝產(chǎn)物磷酰胺氮芥可引起DNA鏈內(nèi)和鏈間的交叉連接,丙烯醛也可以與DNA發(fā)生加成,同時丙烯醛也會干擾體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng),引起氧化應(yīng)激。研究表明,氧化應(yīng)激是CTX導(dǎo)致正常細胞及組織DNA損傷的主要原因之一[9]。

    肝臟是藥物代謝的重要器官,CTX經(jīng)肝臟的代謝產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物和自由基造成DNA損傷,因此肝臟既是CTX的代謝器官,也是CTX的毒性靶器官。藥物性肝損傷的臨床分析發(fā)現(xiàn),74例藥物性肝損傷研究的患者有23例是腫瘤化療藥物引起的,占31.1% 居首位[10]。臨床研究發(fā)現(xiàn)CTX能夠引起血清中轉(zhuǎn)氨酶輕度升高,肝臟組織中GSH和SOD的活力降低,MDA的水平升高,肝臟組織形態(tài)發(fā)生變化,膽汁分泌發(fā)生異常[11]。Tripathi等研究發(fā)現(xiàn)CTX能夠降低肝臟中GSH、HO-1和NQO-1的水平,升高MDA的水平,升高P53和P38的蛋白表達,引起彗星實驗彗星數(shù)目和彗星尾距、尾長和尾部DNA%的增加,引起肝臟細胞氧化應(yīng)激,DNA損傷和細胞的凋亡[12]。Ibrahim等發(fā)現(xiàn)CTX可以增加肝臟中8-OHdG和MDA的水平,增加肝臟細胞的DNA片段的比例,引起大鼠肝臟細胞的氧化應(yīng)激及DNA損傷[13]。

    8-OHdG是由活性氧引起的DNA中鳥嘌呤氧化損傷的產(chǎn)物,在體內(nèi)穩(wěn)定存在,是DNA的氧化損傷和突變的標志物,8-OHdG是最終代謝產(chǎn)物,能夠穩(wěn)定的存在,因此檢測肝臟組織的8-OHdG,可以檢測肝細胞DNA的氧化損傷[14-15]。單細胞凝膠電泳技術(shù)具有簡便快捷,靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點,目前常用的用來檢測真核細胞的單細胞的DNA鏈斷裂和修復(fù)的研究[16-17]。

    本實驗結(jié)果表明,小鼠注射CTX后,小鼠的體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量以及肝臟指數(shù)顯著低于空白對照組,血清中ALT、AST的活力顯著降低,肝臟中MDA、8-OHdG的水平顯著增加,五子衍宗方組能顯著降低模型小鼠的MDA、8-OHdG的水平,說明五子衍宗方能夠減輕CTX引起的小鼠肝臟DNA的氧化損傷。通過單細胞凝膠電泳實驗我們發(fā)現(xiàn)五子衍宗方各組對模型組的Olive尾矩、尾距、尾長和尾部DNA%都有顯著提高,表明五子衍宗方能夠顯著減輕CTX造成的DNA損傷。因此,五子衍宗方能夠拮抗CTX引起的肝臟細胞的DNA損傷,其機制可能與五子衍宗方清除CTX代謝過程中產(chǎn)生的自由基,提高機體的抗氧化能力及增強損傷DNA修復(fù)的能力有關(guān)。

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    R285.5

    :B

    :1001-1528(2015)05-1093-04

    10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.038

    2014-03-15

    國家自然科學(xué)基金項目 (81173375)

    黃威峰(1989—),男,碩士生,主要從事中藥藥理方面的研究。E-mail:huangweifeng7120@sina.coM*通信作者:張長城(1973—),男,博士,教授,主要從事中藥藥理方面的研究。E-mail:greatwall@ctgu.edu.cn

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