赤芍、當(dāng)歸和漏蘆對(duì)醋延胡索中延胡索乙素的影響

郭志燁， 韓 麗*， 楊 明，2， 劉李梅， 何 婧， 鄒文銓

（1、成都中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都611137；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330004；3.四川大學(xué)，四川成都610064）

赤芍、當(dāng)歸和漏蘆對(duì)醋延胡索中延胡索乙素的影響

郭志燁1， 韓 麗1*， 楊 明1，2， 劉李梅1， 何 婧1， 鄒文銓3

（1、成都中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都611137；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330004；3.四川大學(xué)，四川成都610064）

目的考察醋延胡索與赤芍、當(dāng)歸、漏蘆合提對(duì)延胡索乙素含有量的影響。方法制備醋延胡索與赤芍、當(dāng)歸、漏蘆合提水提液，采用高效液相色譜 （HPLC）法測(cè)定各提取液或者濃縮液中延胡索乙素質(zhì)量濃度并計(jì)算提取率或轉(zhuǎn)移率，采用pH計(jì)測(cè)量各提取液pH值。結(jié)果醋延胡索與赤芍、當(dāng)歸合提均會(huì)降低延胡索乙素提取率，其中赤芍影響較大；配伍導(dǎo)致的pH值的改變對(duì)提取率無(wú)影響；常壓濃縮和減壓濃縮過(guò)程會(huì)損失少量延胡索乙素。結(jié)論堿性的延胡索乙素與合提藥物中酸性的鞣質(zhì)反應(yīng)生成沉淀是合提液中延胡索乙素質(zhì)量濃度較低的主要原因。

醋延胡索；延胡索乙素；合提；赤芍；當(dāng)歸；漏蘆；沉淀反應(yīng)

延胡索為罌粟科Papaveraceae紫堇屬植物延胡索Corydalis yanhusuo W.T.Wang的干燥塊莖，據(jù)古醫(yī)藥書(shū)籍記載有活血散瘀、理氣止痛的功效?，F(xiàn)代科學(xué)研究［1］表明延胡索具有很好的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和催眠的藥理作用，其藥效成分為生物堿類(lèi)，其中尤以延胡索乙素作用最強(qiáng)。有研究表明［2］游離生物堿難溶于水，經(jīng)醋炙后，其生物堿與醋酸結(jié)合成易溶于水的醋酸鹽，煎煮時(shí)易于溶出，從而更好地發(fā)揮藥效，所以臨床延胡索常以醋炮制品水煎煮入藥。前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)以醋延胡索計(jì)生藥濃度相同的醋延胡索單獨(dú)提取的提取液和醋延胡索與其他藥物 （赤芍、當(dāng)歸、漏蘆）合提后濃縮的濃縮液中延胡索乙素質(zhì)量濃度相差很大，針對(duì)此現(xiàn)象以及延胡索乙素的性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC等檢測(cè)方法，拆方配對(duì)等研究方法，從醋延胡索以外其他成分的作用、濃縮時(shí)溫度的影響這兩個(gè)方面進(jìn)行探究，以期為其他含有醋延胡索的復(fù)方的提取工藝的確定以及工藝指標(biāo)的選擇提供依據(jù)。

1 儀器藥材與試劑

1.1 儀器 LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司，LC-20AT 228-45001-38輸液泵，SPD-20A 228-45003-38紫外檢測(cè)器，20A 228-45003-91混合器）；BP211D電子分析天平（德國(guó)sartorius）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式多用真空泵 （鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；

1.2 試藥 延胡索乙素對(duì)照品 （中國(guó)食品藥品檢定研究院，規(guī)格20 mg，純度≥98%，批號(hào)110726-200409）；醋延胡素飲片 （購(gòu)自成都市科倫中藥飲片公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室盧先明教授鑒定為罌粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W.T.Wang的干燥塊莖的炮制品）；赤芍飲片、當(dāng)歸飲片、漏蘆飲片均購(gòu)自成都市科倫中藥飲片公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室盧先明教授鑒定分別為毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根、傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels.的干燥根菊科植物祁州漏蘆RhaponticuMuniflorum（L.）DC.的干燥根；HPLC分析用甲醇為色譜純 （上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；超純水（Millipore超純水凈化系統(tǒng)制得）；磷酸、三乙胺、氨水為分析純 （成都市科倫化工試劑廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 延胡索乙素的測(cè)定

2.1.1 色譜條件 WelchroMC18色譜柱（250 mM×4.6 nm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH值至6.0）（65∶35）為流動(dòng)相，體積流量為1.0 mL/min，檢查波長(zhǎng)為280 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量10μL［3-5］。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取延胡索乙素對(duì)照品5.29 mg，于100 mL棕色量瓶中用甲醇溶解定容，配成質(zhì)量濃度為0.052 9 mg/mL的對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、10 mL，置10 mL量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.005 290、0.010 58、0.015 87、0.021 16、0.026 45、0.052 90 mg/mL的對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下HPLC條件，進(jìn)樣分析。以進(jìn)樣量 （x）對(duì)峰面積（y）作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。其回歸方程為y= 12.60×106x+1.186×104，r=0.999 8，n=6。延胡索乙素對(duì)照品在5.29～52.90μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積間呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取延胡索乙素對(duì)照品溶液10μL，按“2.1.1”項(xiàng)下HPLC條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積值，6次測(cè)定結(jié)果的RSD為1.25%。

2.1.4 回收率試驗(yàn) 精密稱取醋延胡索適量6份，按 “2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法處理，進(jìn)行質(zhì)量濃度測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果平均回收率為101.08%，RSD為1.52%。見(jiàn)表1。

2.2 復(fù)方中赤芍、當(dāng)歸、漏蘆的配伍對(duì)延胡索乙素提取率的影響 復(fù)方的化學(xué)成分不是由組成復(fù)方的各單味藥成分的簡(jiǎn)單加和，復(fù)方中化學(xué)成分的變化也不是某一個(gè)有效成分發(fā)生了變化，而是從整體上發(fā)生了變化。這種變化可能有量的變化，如各自主要成分的提取率，也可能有質(zhì)的變化，如某些成分消失或新成分產(chǎn)生。故實(shí)驗(yàn)的第一步就是通過(guò)拆方配對(duì)研究的方法確認(rèn)是復(fù)方中哪味藥對(duì)延胡索乙素產(chǎn)生了干擾，并初步探討產(chǎn)生干擾的原因。

表1 延胡索乙素加樣回收率測(cè)定結(jié)果Tab.1 Recovery of tetrahyd ropalmatine

2.2.1 提取液的制備 稱取醋延胡索飲片5份，每份6 g，按處方配伍比例稱取赤芍、當(dāng)歸、漏蘆飲片，制備5種供試品 （醋延胡索，醋延胡索配伍赤芍，醋延胡索配伍當(dāng)歸，醋延胡索配伍漏蘆，醋延胡索配伍赤芍、當(dāng)歸、漏蘆），5份飲片均加入10倍體積水，煎煮提取3次，每次1 h，合并提取液，定容到相同體積即得A組、B組、C組、D組、E組5種提取液，每種提取液平行制備3份。

2.2.2 提取液中延胡索乙素的測(cè)定 吸取相同體積的5種提取液10 mL，加入氨水-甲醇 （1∶20）50 mL，80 Hz超聲30 min，抽濾，濾液蒸干后甲醇定容到10 ML，溶液3 500 r/min離心10 min，上清液用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算延胡索乙素質(zhì)量濃度及提取率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2、圖1。

表2 醋延胡索不同配伍組對(duì)延胡索乙素提取率的影響（n=3）Tab.2 In fluence to extraction yield of tetrahydropalmatine by formula alterations（n=3）

由表2可知，醋延胡索與赤芍、當(dāng)歸配伍提取時(shí)，延胡索乙素提取率顯著降低。

2.3 配伍后延胡索乙素提取率降低的原因的探討

圖1 對(duì)照品、不同提取液及陰性對(duì)照色譜圖Fig.1 HPLC chromatograMof reference substance，different extracts and negative control extract

2.3.1 配伍后提取液pH改變的影響的研究 由“2.2.2”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知醋延胡索與不同藥配伍延胡索乙素提取率差異很大。提取液中延胡索乙素主要以鹽的形式存在，為強(qiáng)堿弱酸鹽，部分以游離化合物存在。在水提液中延胡索乙素醋酸鹽的溶解度高于游離延胡索乙素，但當(dāng)溶液顯堿性時(shí)，延胡索乙素醋酸鹽向延胡索乙素轉(zhuǎn)化，在提取液中很快形成飽和甚至過(guò)飽和溶液，致使延胡索乙素不能進(jìn)一步溶出，從而質(zhì)量濃度降低。因此醋延胡索單獨(dú)提取和與其他藥物配伍提取時(shí)提取液的pH可能是導(dǎo)致延胡索乙素質(zhì)量濃度不同的原因之一。故實(shí)驗(yàn)的第二步就是精密測(cè)定各提取液pH，并分析延胡索乙素提取率與pH的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 醋延胡索不同配伍組提取液pHTab.3 pH values of differen t extraction solution for vinegar-processed Corydalis yanhusuo Rhizoma in altered formulas

采用SPSS軟件對(duì)不同配伍提取液的pH及延胡索乙素質(zhì)量濃度結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以延胡索乙素提取率為應(yīng)變量 （Y），以pH為變量 （X），對(duì)兩因素做曲線擬合，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 延胡索乙素提取率 （Y）與pH（X）曲線擬合圖Fig.2 Curve fitting of extraction yield of tetrahydropalmatine（Y）and pH（X）

由表3可知5種提取液均呈酸性，且pH較接近 （5.47～6.74）。由圖2可知延胡索乙素提取率與pH不具有相關(guān)性。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在（5.47～6.74）的pH范圍內(nèi)，pH的大小對(duì)延胡索乙素提取率影響不大。醋延胡索與其他藥物配伍提取導(dǎo)致延胡索乙素提取率降低是除pH以外其他因素的影響。

2.3.2 配伍后沉淀反應(yīng)生成的研究 進(jìn)一步觀察本實(shí)驗(yàn)中延胡索乙素提取率最低的B組提取液發(fā)現(xiàn)有紅棕色沉淀，將A組提取液、延胡索乙素對(duì)照品溶液分別與赤芍單提液混合，均產(chǎn)生紅棕色沉淀；3種沉淀均不溶于水、三氯甲烷；微溶于丙酮、甲醇、乙醇，易溶于二甲亞砜；將兩沉淀溶于酸性液中，碘-碘化鉍鉀、碘-碘化鉀試管反應(yīng)陽(yáng)性，提示沉淀中有生物堿成分。所以初步推斷是復(fù)方中其他藥物所含成分與延胡索乙素發(fā)生沉淀反應(yīng)從而對(duì)提取率產(chǎn)生了影響。

2.3.3 沉淀物化學(xué)組成的探討 對(duì)B組提取液、赤芍單提液中芍藥苷提取率進(jìn)行測(cè)定，分別是92.96%、94.01%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明二者沒(méi)有顯著性差異，初步推斷可能是赤芍中芍藥苷以外的其他物質(zhì)對(duì)延胡索乙素的溶出產(chǎn)生了影響，且此物質(zhì)在赤芍、當(dāng)歸中均含有。有研究表明［6］某些復(fù)方臨床多用散劑的原因是酸堿物質(zhì)重組生成水不溶性復(fù)合物使有效成分提取率降低，比如延胡索散中的生物堿與甘草酸反應(yīng)生成沉淀導(dǎo)致生物堿質(zhì)量濃度降低。有研究表明［7］延胡索的有效成分生物堿易與收澀類(lèi)藥物所含鞣質(zhì)在水溶液中生成難溶性沉淀。赤芍、當(dāng)歸中均含有鞣質(zhì)，且鞣質(zhì)含有量赤芍大于當(dāng)歸［8-10］，與延胡索乙素提取率減少百分率的大小順序?qū)?yīng)，所以進(jìn)一步推斷是復(fù)方中其他藥物所含鞣質(zhì)與延胡索乙素發(fā)生沉淀反應(yīng)從而降低了延胡索乙素提取率。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將鞣質(zhì)溶液與延胡索乙素溶液混合，產(chǎn)生紅棕色沉淀，其性質(zhì)類(lèi)似于“2.3.2”項(xiàng)下；對(duì)此紅棕色沉淀與 “2.3.2”項(xiàng)下紅棕色沉淀都進(jìn)行鞣質(zhì)鑒別反應(yīng)，結(jié)果呈陽(yáng)性。證明以上推斷的正確性即復(fù)方中其他藥物所含鞣質(zhì)與延胡索乙素發(fā)生沉淀反應(yīng)從而降低了延胡索乙素提取率。

2.4 濃縮方式對(duì)延胡索乙素轉(zhuǎn)移率的影響 醋延胡索飲片中延胡索乙素含有量很低 （飲片全檢結(jié)果是0.055%），當(dāng)與其他藥物配伍提取時(shí)因溶劑量較大從而導(dǎo)致提取液中延胡索乙素質(zhì)量濃度較低。在前期實(shí)驗(yàn)時(shí)為使延胡索乙素峰面積適宜，對(duì)四味藥合提的提取液進(jìn)行測(cè)定之前采用了常壓濃縮。有研究表明延胡索乙素具有熱不穩(wěn)定性［11］，所以實(shí)驗(yàn)的第二步是考察不同的濃縮方式對(duì)延胡索乙素轉(zhuǎn)移率的影響。

2.4.1 濃縮液的制備 量取相同體積的 “2.2.1”項(xiàng)下E提取液6份，其中3份采用常壓沸騰濃縮法濃縮，剩余3份采用60℃減壓濃縮法濃縮。

2.4.2 濃縮液中延胡索乙素測(cè)定 吸取相同體積的兩種濃縮液10 mL，加入氨水-甲醇 （1∶20）50 mL，80 Hz超聲30 min，抽濾，濾液蒸干后甲醇定容到10 mL，溶液3 500 r/min離心10 min，上清液用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算延胡索乙素質(zhì)量濃度及轉(zhuǎn)移率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4濃縮方式對(duì)延胡索乙素轉(zhuǎn)移率的影響（n=3）Tab.4 Influence of different enrichment methods to extraction yield of tetrahydropalmatine（n=3）

由表4可知，常壓濃縮與減壓濃縮的延胡索乙素轉(zhuǎn)移率均較高，且SPSS軟件成組t檢驗(yàn)結(jié)果表明兩種濃縮方式之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

赤芍、當(dāng)歸、漏蘆對(duì)延胡索乙素提取率影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：赤芍、當(dāng)歸所含鞣質(zhì)對(duì)延胡索乙素的提取產(chǎn)生了影響，其中以赤芍影響最大。通過(guò)對(duì)以上文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的綜合分析，得出結(jié)論醋延胡索與赤芍配伍提取能生成沉淀，沉淀中有生物堿和鞣質(zhì)，從而降低延胡索乙素提取率。生成沉淀的原因是鞣質(zhì)為酸性物質(zhì)，能與堿性的延胡索乙素相互結(jié)合，生成分子質(zhì)量較大的水不溶性復(fù)合物［12］。實(shí)驗(yàn)結(jié)論提示對(duì)于既有赤芍又有醋延胡索的復(fù)方制劑，不宜采用液體劑型。傳統(tǒng)上延胡索配伍當(dāng)歸、川芍、桂枝、赤芍是治療血瘀疼痛的基本藥物［13］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映了其多為固體劑型且能起到緩釋作用的意義，同時(shí)為本復(fù)方新藥研發(fā)時(shí)劑型的選擇提供參考［7］。

濃縮方式對(duì)延胡索乙素轉(zhuǎn)移率影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明醋延胡索與其他藥物配伍提取濃縮時(shí)延胡索乙素轉(zhuǎn)移率的降低與濃縮過(guò)程關(guān)系不大，主要是提取時(shí)其他藥物成分的影響；減壓濃縮與常壓濃縮之間無(wú)顯著性差異。

本實(shí)驗(yàn)曾對(duì)延胡索乙素測(cè)定的供試品溶液制備方法進(jìn)行探索，分別用氨水-甲醇超聲、三氯甲烷萃?。?4］、乙醚萃?。?5］進(jìn)行制備，結(jié)果表明氨水-甲醇超聲法較好，延胡索乙素轉(zhuǎn)移率較高，故本實(shí)驗(yàn)均采用此制備方法。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定不同配伍水提液中延胡索乙素的量，發(fā)現(xiàn)醋延胡索與赤芍、當(dāng)歸配伍后，主要藥效成分延胡索乙素量不同程度的減少，為探索方劑配伍規(guī)律，篩選和優(yōu)化延胡索類(lèi)復(fù)方制劑的配方以及為臨床用藥和新藥開(kāi)發(fā)提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

［1］鄒 薇，張 鶴，包永睿，等.延胡索提取工藝的優(yōu)化及化學(xué)成分與藥效指標(biāo)相關(guān)性分析［J］.中草藥，2012，43（4）：694-698.

［2］馬家驊，楊 明，許潤(rùn)春，等.醋延胡索炮制工藝的研究［J］.中草藥，2005，36（11）：1657-1659.

［3］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：2010年版一部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥出版社，2010.

［4］鄭加豪，李笑慧，周曙華，等.HPLC測(cè)定 “冬病夏治”貼膏中延胡索乙素的含量［J］.中國(guó)中藥雜志，2011，36（12）：1610-1612.

［5］雷世庸，張榮發(fā).延胡索乙素的提取及含量測(cè)定方法研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥業(yè)，2009，18（16）：83-84.

［6］邱蓉麗，李 祥，陳建偉.中藥延胡索散復(fù)方中酸、堿物質(zhì)重組對(duì)有效成分提取率［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2002，18（4）：228-229.

［7］李春桃.含生物堿與鞣質(zhì)類(lèi)中藥臨床配伍使用分析與探討［J］.中藥與臨床，2013，4（1）：30-32.

［8］程 明，楊連菊，馮學(xué)鋒，等.赤芍野生品和栽培品總鞣質(zhì)含量比較研究［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2010，17（11）：39-40.

［9］陳建真，呂圭源，宋玉良.當(dāng)歸頭、身、尾的鞣質(zhì)含量測(cè)定［J］.浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，28（3）：72-73.

［10］崔英杰，李玉琴，于學(xué)美，等.中藥材祈州漏蘆幾種有效成分的高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（9）：2399-2400.

［11］徐 敏，付曉泰，朱正勇，等.中藥浸膏中延胡索乙素的熱穩(wěn)定性的研究［J］.中成藥，2007，29（5）：746-747.

［12］李春桃，高 天.延胡索與鞣質(zhì)類(lèi)藥物配伍時(shí)相互作用和影響的處方調(diào)查［J］.華西藥學(xué)雜志，2012，27（2）：228-229.

［13］馬守成.元胡不同配伍對(duì)延胡索乙素溶出量的影響及藥效關(guān)系的研究 ［D］.蘭州：蘭州大學(xué)，2008.

［14］陳德利，馬 霖，曹 玉，等.HPLC法測(cè)定蒲元胃康膠囊中延胡索乙素的含量［J］.中國(guó)藥房，2009，20（9）：690-691.

［15］唐柏平，李瓊英，賀清源，等.HPLC法測(cè)定新傷跌打膠囊中延胡索乙素的含量［J］.中國(guó)藥師，2012，15（11）：1655-1656.

Effects of Paeoniae Rubrae Radix，Angelicae sinensis Radix and Rhapontici seu Echinops Radix on tetrahydropalmatine froMvinegar-processed Corydalis yanhusuo Rhizoma

GUO Zhi-ye1， HAN Li1*， YANGMing1，2， LIU Li-mei1， HE Jing1， ZOUWen-quan3

（1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Key Laboratory for Systematic Research and Development of Traditional Chinese Medicine Resources，Chengdu 611137，China；2.Key Laboratory for Modern TCMPreparations，Ministry of Education，Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004，China；3.Sichuan University，Chengdu 610064，China）

vinegar-processed Corydalis yanhusuo Rhizoma；tetrahydropalmatine；co-extraction；Chishao（Paeoniae Rubrae Radix）；Danggui（Angelicae sinensisRadix）；Loulu（Rhapontici seu EchinopsRadix）；sediment

R284.2

：A

：1001-1528（2015）05-0981-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.012

2014-06-24

四川省科技支撐項(xiàng)目 （2014SZ0071-09）

郭志燁 （1988—），女，碩士，從事中藥新技術(shù)、新工藝、新制劑研究。Tel：（028）61800127，E-mail：guozhiyejiayou@ 163.com

*通信作者：韓 麗 （1965—），女，教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥新技術(shù)、新工藝、新制劑研究。Tel： （028）61800127，E-mail：hanliyx@163.com