石榴皮多糖提取過程的動力學分析

王占一， 戴 博， 王玉海， 張立華， 李卓瓦， 畢海丹

（1.棗莊學院生命科學學院，山東棗莊277160；2.空軍總醫(yī)院藥學部，北京100142）

石榴皮多糖提取過程的動力學分析

王占一1， 戴 博2， 王玉海1， 張立華1， 李卓瓦1， 畢海丹1

（1.棗莊學院生命科學學院，山東棗莊277160；2.空軍總醫(yī)院藥學部，北京100142）

目的以動力學模型分析熱水浸提石榴皮多糖的參數(shù)值。方法石榴皮石油醚脫脂后不同溫度條件下進行恒溫提取多糖，以總糖和還原糖為檢測指標，求解提取動力學的速率常數(shù)k、相對萃余率、表面擴散系數(shù)DS、表觀活化能Ea和半衰期t1/2等數(shù)值。結果石榴皮多糖提取過程的動力學基本符合一級動力學方程。提取系統(tǒng)溫度越高，石榴皮多糖質(zhì)量濃度達到平衡所需要的時間越短，k值和DS值呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，相對剩余量下降越快，Ea值大體上呈現(xiàn)下降趨勢，t1/2值均隨之減小。結論所得石榴皮多糖提取動力學參數(shù)值提示溶質(zhì)的內(nèi)擴散為浸提過程的關鍵控制步驟。

石榴皮；多糖；提?。粍恿W分析

石榴Punica granatuML.又名山力葉、若榴木，其果皮干燥品入藥稱為石榴皮。石榴皮是最常用的中藥材品種之一，早在南北朝時期 《雷公炮炙論》中就有記載。多糖是石榴皮中一類重要的化學成分［1］，越來越多的研究證明其具有復雜的多方面的生物活性和功能?？麓毫值龋?］研究發(fā)現(xiàn)石榴皮多糖具有很強的還原能力和清除羥自由基的活性，李左龍等［3］研究發(fā)現(xiàn)石榴皮多糖能顯著提高實驗小鼠免疫器官質(zhì)量及巨噬細胞的吞噬能力。

目前，對于石榴皮多糖提取方面的研究僅限于簡單的工藝優(yōu)化設計［2，4］，而對于石榴皮多糖提取過程動力學研究很少。建立一個可信度較高的提取過程動力學模型，不僅可以全面地研究提取過程機理，也為提高石榴皮多糖的提取效率，以及后期中試生產(chǎn)工藝設備設計提供參考，從而有效節(jié)約生產(chǎn)成本、提高經(jīng)濟效益［5-7］。此外，以往天然產(chǎn)物提取動力學模型的研究對象大多數(shù)為小分子物質(zhì)，本實驗研究對象為石榴皮多糖這類大分子物質(zhì)，對于大分子物質(zhì)是否可以應用常用動力學模型來研究，以及模型適應程度如何，這些都是嶄新的研究內(nèi)容。鑒于此，本研究以經(jīng)典Fick第二定律為基礎的動力學數(shù)學模型來探討石榴皮多糖提取的動力學參數(shù)。

1 材料與試劑

石榴皮干燥品，購自棗莊市農(nóng)貿(mào)市場，經(jīng)棗莊學院生命科學學院李思建副教授鑒定為正品石榴皮；葡萄糖對照品 （批號 110833-201205，規(guī)格100 mg，純度＞99%），由中國食品藥品檢定研究院提供；濃硫酸、苯酚、3，5-二硝基水楊酸、石油醚、氫氧化鈉、亞硫酸鈉、蒸餾水等均為分析純。

2 儀器與設備

8453型紫外-可見光分光光度計（美國Agilent公司）；DK-S26型數(shù)顯恒溫水浴鍋 （上海三發(fā)科學儀器有限公司）；SHB-ⅢA型循環(huán)水式多用真空泵 （鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；AR1140型電子分析天平 （美國奧豪斯國際貿(mào)易有限公司）；DHG-9141A型電熱恒溫干燥箱 （上海精宏實驗設備有限公司）。

3 試驗方法

3.1 石榴皮多糖的提取方法

3.1.1 石榴皮多糖的提取工藝流程 精密稱取10 g石榴皮干燥顆粒 （半徑R約為0.03 cm），共計20份，分別置于20只干燥三口燒瓶中，均用一定量石油醚脫脂后，將20只三口燒瓶隨機分為4組，每組5只。再以小組為單位，分別加入不同體積 （50、100、150、200 mL）已經(jīng)預熱到規(guī)定溫度的蒸餾水，不停攪拌，在不同溫度條件下（318、328、338、348、358 K）進行恒溫提取，操作進行30 min后，每隔30 min取樣0.1 mL，進行石榴皮多糖的質(zhì)量濃度測定［8-9］，整個提取工藝試驗進行3次，試驗數(shù)據(jù)取平均值。

3.1.2 石榴皮多糖質(zhì)量濃度修正 由于每次取樣對石榴皮多糖質(zhì)量濃度進行測定時，均要取走提取液體積0.1 mL，整個試驗過程要重復9次，這樣會使得取樣后的整個提取系統(tǒng)體系發(fā)生改變，因此要通過公式 （1）對石榴皮多糖質(zhì)量濃度進行修正［8，10］：

Cn為第n次取樣測得石榴皮多糖質(zhì)量濃度的修正值，mg/mL；Ci為第n次取樣石榴皮多糖的質(zhì)量濃度測定值，mg/mL；VT為提取溶液體積數(shù)，（VT=50，100，150，200），ML；n為取樣次數(shù)，n=1，2，…，9。

3.2 石榴皮多糖質(zhì)量濃度測定方法

3.2.1 總糖質(zhì)量濃度測定方法［11-12］將葡萄糖對照品于105℃干燥至恒定質(zhì)量后，精密稱取5 mg置于50 mL量瓶中，以水作為溶劑配制成0.1 mg/mL的葡萄糖對照品溶液。精密量取對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL分別置于25 ML具有橡膠塞的試管中，用蒸餾水將試管中溶液體積補充至2 mL，充分搖勻后，于各試管中均加入體積分數(shù)為6%重蒸苯酚試液2 mL，并迅速小心沿試管內(nèi)壁滴加10 mL濃硫酸，充分震蕩搖勻并靜置20 min。取葡萄糖對照品加入量為0的試管內(nèi)溶液作為空白對照，利用紫外-可見光分光光度計，在490 nm波長下按照濃度梯度由小到大的順序測定吸光值。以各試管中葡糖糖系列濃度作為橫坐標，以相應的吸光值作為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線。得到回歸方程式為：A=12.35C+0.003 8，相關系數(shù)r2=0.999 2。

3.2.2 還原糖質(zhì)量濃度測定方法［13-15］精密稱取3，5-二硝基水楊酸0.315 g于燒杯中，加入少量水溶解后，移入500 mL量瓶中，依次加入2 mol/L的NaOH溶液16.1 mL，含有9.25 g酒石酸鉀鈉水溶液200 mL，苯酚及亞硫酸鈉各0.25 g，加熱并充分攪拌使固體物質(zhì)溶解，冷卻后加蒸餾水定容至500 mL，貯存于棕色瓶中作為DNS試劑。精密量取 “3.2.1”項下對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL分別置于25 mL具塞試管中，用蒸餾水將每支試管中的溶液體積補充至2 ML，充分搖勻后，分別加入DNS試劑1.5 mL，置于水浴鍋中煮沸5 min，取出放冷后，以蒸餾水為溶劑定容至25 mL，塞緊橡膠塞并搖勻。取葡萄糖對照品加入量為0的試管內(nèi)溶液作為空白對照，利用紫外-可見光分光光度計，在540 nm波長下按照濃度梯度由小到大的順序測定吸光值。以各試管中葡糖糖系列濃度作為橫坐標，以相應的吸光值作為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線。得到回歸方程式為：A= 1.09C-0.007 5，相關系數(shù)r2=0.999 0。

3.2.3 多糖質(zhì)量濃度的計算方法 樣品中總糖質(zhì)量濃度（CZ，mg/mL）可以通過“3.2.1”項下方法測得，樣品中還原糖質(zhì)量濃度（CH，mg/mL）可以通過 “3.2.2”項下方法測得，樣品中多糖質(zhì)量濃度 （CD，mg/mL）計算公式如下［14-15］：

3.3 石榴皮多糖提取過程動力學模型 通常情況下，從天然藥物中提取有效成分的過程是相當復雜的，藥材粉碎后的顆粒形態(tài)、藥材質(zhì)地及細胞破碎程度、溶劑穿透性能、有效成分分子質(zhì)量大小等均是影響有效成分提取的主要因素。盡管影響因素多種多樣，但是其本質(zhì)都是溶質(zhì)從物料的固相向溶劑的液相傳質(zhì)的過程，歸納起來，其過程一般可以分為3個步驟：第一步，提取溶劑向物料內(nèi)部的滲透以及物料的潤濕過程；第二步，有效成分穿破細胞壁等屏障溶解于提取溶劑中；第三步，由于物料內(nèi)外存在濃度差，有效成分依靠溶劑化效應從物料內(nèi)部向物料表面的擴散以及由物料表面向溶劑主體的擴散。一般認為，溶解了有效成分的溶劑在物料中由內(nèi)向外擴散的過程是影響整個提取過程的關鍵因素，即為控制步驟。

為了便于試驗研究，本實驗將粉碎后的石榴皮顆粒形態(tài)簡化并看作球形，同時，要求滿足下列條件：A.粉碎后的干燥石榴皮粉末為均勻的球形顆粒；B.石榴皮多糖的內(nèi)擴散軌跡為徑向擴散；C.提取過程的任意時刻，石榴皮原料顆粒內(nèi)部多糖成分分布均勻，其質(zhì)量濃度以及擴散系數(shù)不發(fā)生任何變化；D.由于整個提取體系攪拌良好，溫度分布均勻一致；E.石榴皮顆粒表面的傳質(zhì)阻力忽略不計。

本實驗以Fick第二定律為理論基礎，建立石榴皮多糖浸提工藝的動力學模型。前文已經(jīng)假設石榴皮顆粒為球形，設定其半徑為R，cm；浸入到顆粒內(nèi)部的提取溶液體積為V＇，mL；顆粒外部溶液體積為V，mL；整個提取過程，t時刻顆粒內(nèi)距離球心為r處的石榴皮多糖質(zhì)量濃度為c，mg/mL；顆粒外主體溶劑系統(tǒng)中石榴皮多糖質(zhì)量濃度為C，mg/mL；表面擴散系數(shù)為DS，10-6cm2/min；則Fick第二定律可以表達為［8-9］：

其邊界條件是：f=0，r=0，r=R

（5）式中的S表示石榴皮顆粒與提取介質(zhì)之間的接觸面積，假設t=0時刻，物料內(nèi)部石榴皮多糖的平均質(zhì)量濃度為c0，那么初始條件為：t= 0，f=c0·r；當達到提取平衡時刻，石榴皮顆粒內(nèi)外溶質(zhì)的質(zhì)量濃度近似相等，如果用c∞和C∞分別代表提取平衡時刻顆粒內(nèi)、外石榴皮多糖的質(zhì)量濃度，則有t=∞，C∞=c∞；假設顆粒外主體溶劑系統(tǒng)中石榴皮多糖初始質(zhì)量濃度為C0，根據(jù)傅里葉變換法可以得到：

由于石榴皮多糖的質(zhì)量濃度分布式為無窮級數(shù)，其高次項趨近于0，因此 （6）式中n=1，則

令k為表觀速率常數(shù)，對方程式 （7）兩邊取對數(shù)有［9-10］：

方程式 （7）、（8）即為建立的石榴皮多糖提取動力學模型，該方程能直觀反映石榴皮顆粒的半徑、提取時間、提取溫度以及料液比與石榴皮多糖質(zhì)量濃度之間的函數(shù)關系。

4 結果與分析

4.1 石榴皮多糖提取速率常數(shù)的求解［9-10］石榴皮多糖的質(zhì)量濃度在不同的提取時間、提取溫度及料液比的試驗條件下，實驗數(shù)據(jù)如表1所示：

由表1可以看出，提取條件中，無論料液比例如何，提取系統(tǒng)溫度越高，石榴皮多糖質(zhì)量濃度達到平衡所需要的時間越短；而在相同的提取時間下，提取系統(tǒng)溫度越高，溶液中的石榴皮多糖質(zhì)量濃度越高。一般情況下，如果提取液中溶質(zhì)質(zhì)量濃度長時間保持恒定，就認為提取過程已經(jīng)達到平衡，該時刻石榴皮多糖質(zhì)量濃度即為平衡濃度（C∞）。根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)，以ln［C∞/（C∞-C）］作為縱坐標，以 t為橫坐標作圖［16-17］，結果見圖1和表2。

由圖1和表2中的數(shù)據(jù)可以明顯的看出，ln［C∞/（C∞-C）］對t的作圖呈現(xiàn)良好的線性關系（R2＞0.95），這說明公式推導的提取動力學方程與試驗的真實結果擬合度良好，石榴皮多糖的提取符合一級動力學數(shù)學模型。比較不同料液比、不同提取溫度條件下速率常數(shù)k值發(fā)現(xiàn)，隨著所設定的提取溫度的提高，速率常數(shù)k值呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢，說明提高提取系統(tǒng)的溫度有利于石榴皮多糖的提取［8-9］。

表1 不同提取條件下石榴皮多糖的質(zhì)量濃度 （n=3）Tab.1 Mass concentration of polysaccharides froMGranati PericarpiuMunder different extraction conditions（n=3）

圖1 不同提取條件下，ln［C∞/（C∞-C）］與t的關系Fig.1 Relationship between ln［C∞/（C∞-C）］and t under different extraction conditions

在不同提取溫度及料液比提取條件下，石榴皮多糖相對萃余率的擬合方程同樣適合指數(shù)模型，相關系數(shù)r2均大于0.95，說明指數(shù)方程式擬合精度較高。比較不同料液比、不同提取溫度條件下的曲線坡度可以看出，設定的提取溫度越高，石榴皮多糖質(zhì)量濃度相對剩余量下降越快，到達因為提取操作前，并沒有對石榴皮顆粒進行浸泡，因此C0= 0，設定石榴皮多糖相對萃余率Y=（C∞-C）/ C∞，則方程式 （7）可以轉變?yōu)閅=（6/π2）exp（-kt），利用表1中的數(shù)據(jù)，以提取時間t為橫坐標，以石榴皮多糖相對萃余率Y為縱坐標作圖，考察趨勢線擬合度［10］，以對ln［C∞/（C∞-C）］與t的線性關系進一步補充驗證，結果見圖2。

提取平衡所需的時間越短，同樣說明提高提取系統(tǒng)的溫度有利于石榴皮多糖的提取。通過對相對萃余率 ［（C∞-C）/C∞］與t的關系的求解，可以求算出不同料液比、不同提取溫度條件下速率常數(shù)k值，這里求算k值與表2中求算的k值完全吻合，這不僅補充論證了ln［C∞/（C∞-C）］與t線性關系的真實性，也進一步證明了方程式 （7）、（8）所建立的石榴皮多糖提取動力學模型與實際測定的真實數(shù)值擬合良好，該方程能夠很好的反映石榴皮顆粒的半徑、提取時間、提取溫度以及料液比與石榴皮多糖質(zhì)量濃度之間的函數(shù)關系［18-19］。

表2 不同提取條件下，ln［C∞/（C∞-C）］與t的回歸方程Tab.2 Regression equation of ln［C∞/（C∞-C）］and t under different extraction conditions

4.2 表面擴散系數(shù) （DS）的求解［18］由方程（8）k=π2DS/R2變形得DS=k R2/π2，表2已經(jīng)求算出不同料液比、不同提取溫度下的速率常數(shù)k值，帶入方程DS=k R2/π2（半徑R2≈9×10-4cm2），求得DS值，結果見表3。

此時所得的表面擴散系數(shù)DS數(shù)值均為所設定提取溫度、料液比條件下的數(shù)值，并不具備連續(xù)性和廣泛應用性，鑒于此，以提取溫度T為橫坐標，DS數(shù)值為縱坐標作圖，結果見表4，圖3。

由圖3、表4可以看出，石榴皮多糖表面擴散系數(shù)DS值和提取溫度T的指數(shù)方程擬合度良好，線性關系r2均在0.95以上。同時可以得出：無論料液比例如何，隨著系統(tǒng)提取溫度的提高，石榴皮多糖DS值均隨之增大，這是因為提取溫度的升高，會使石榴皮多糖分子運動速度加快，增大了單位時間內(nèi)石榴皮顆粒表面的濃度差值，使得石榴皮多糖DS值增大。

4.3 表觀活化能 （Ea）的求解［19-20］通常情況下，在化學反應過程中，速率常數(shù)的數(shù)值與反應溫度變化密切相關，阿倫尼烏斯公式正是描述二者關系的經(jīng)驗公式，公式為：k=A·exp-Ea/RT，將該公式取對數(shù)并相應轉化可得：-ln k=-ln A+（Ea/RT），式中：k為速率常數(shù)，1/min；R為摩爾氣體常數(shù)，數(shù)值為8.314 J/（mol·K），A為指前因子；T為提取系統(tǒng)溫度，K；Ea為表觀活化能，kJ/moL。利用表2或表3中k的數(shù)據(jù)，以-ln k為縱坐標，以1/T為橫坐標作圖，結果見表5，圖4。

表4 石榴皮多糖DS和提取溫度T的指數(shù)方程Tab.4 Exponential equation between polysaccharides froMGranati PericarpiuMDSand teMperatu re T

圖3 石榴皮多糖DS和提取溫度T的關系Fig.3 Relationship between polysaccharides froMGranati PoricarpiuMDSand temperature T

表5 石榴皮多糖提取-ln k和1/T的線性方程Tab.5 Linear equation between-lnk and 1/T of polysaccharides froMGranati PericarpiuMextraction

圖4 石榴皮多糖提取-ln k和1/T的關系Fig.4 Relationship between-lnk and 1/T of polysaccharides froMGranati PericarpiuMextraction

由表5，圖4可知，石榴皮多糖提取過程中，-ln k與1/T擬合方程線性關系良好，不同料液比條件下，相關系數(shù)r2均大于0.96，分析線性方程推算出的不同料液比條件下表觀活化能Ea數(shù)值變化規(guī)律可得，料液比由1∶5→1∶20逐漸變化過程中，表觀活化能Ea數(shù)值大體上呈現(xiàn)下降趨勢。原因是根據(jù)能量守恒定律，提取條件中的溶劑量越大，使其溫度升高到規(guī)定數(shù)值時所需要吸收的熱量就越大，在總能量保持不變的情況下，轉化為表觀活化能Ea的能量就會相應減少。

4.4 半衰期 （t1/2）的求解［17］半衰期 （t1/2）為反應物質(zhì)量濃度變?yōu)樵瓉硪话霑r的反應時間，即：C=C∞/2，C0=0，則方程（8）ln［C∞/（C∞-C）］=kt+ln［π2C∞/6（C∞-C0）］可以轉化為t1/2=［ln2-ln（π2/6）］/k，表2或表3可以提供速率常數(shù)k的數(shù)據(jù)，因此t1/2數(shù)值可求得。此時所得的半衰期 （t1/2）數(shù)值均為所設定提取溫度、料液比條件下的數(shù)值，并不具備連續(xù)性和廣泛應用性，鑒于此，以提取溫度T為橫坐標，以求算的半衰期 （t1/2）數(shù)值為縱坐標作圖，結果見圖5，表6。

圖5 石榴皮多糖提取t1/2和提取溫度T的關系Fig.5 Relationship between t1/2and teMperature T for extraction of polysaccharides froMGranati Pericarpium

表6 石榴皮多糖提取t1/2和提取溫度T的指數(shù)方程Tab.6 Exponential equation between t1/2and temperatures T for extraction of polysaccharides froMGranati Pericarpium

由圖5、表6可以看出，石榴皮多糖提取t1/2值和提取溫度T的指數(shù)方程擬合度良好，線性關系r2均大于0.95。由圖5可以得出：無論料液比例如何，隨著體系提取溫度的提高，石榴皮多糖t1/2值均隨之減小，t1/2值越小說明系統(tǒng)的提取效率越高，對整個工作流程越有利。這是因為隨著體系提取溫度的升高，會使石榴皮多糖分子運動速度加快，使得提取效率明顯提高，從而有效縮短了提取時間。

5 討論

本實驗以Fick第二定律為理論基礎，以石榴皮藥材顆粒為原料，熱水浸提為提取模式，通過對整個提取過程的浸提機制和擴散原理的深入分析，建立球形顆粒提取動力學模型，研究ln［C∞/C∞-C）］與提取時間 t之間的線性關系函數(shù)以及［（C∞-C）/C∞］與t之間的指數(shù)關系函數(shù)，通過對兩種函數(shù)關系式的求解得到提取速率常數(shù)、表面擴散系數(shù)、表觀活化能及半衰期等一系列動力學參數(shù)。結果表明：試驗數(shù)據(jù)與動力學模式預測值吻合良好，該數(shù)學模型在一定程度上可以反映石榴皮多糖質(zhì)量濃度與石榴皮顆粒半徑、料液比、提取時間和提取溫度等工藝參數(shù)之間的函數(shù)關系。

研究結果還證實了石榴皮多糖提取是一個復雜的固液相轉移過程，由于中藥材自身組織結構的差異性、所含功能成分的多樣性及浸提過程的復雜性等諸多因素，建立一個普遍應用的提取工藝動力學模型是十分困難的。當前及今后針對這一研究領域的重點應該放在：如何根據(jù)中藥材物料的不同，建立更加合適的動力學模型；如何通過有效的改進模型可靠性驗證方法及相關聯(lián)參數(shù)的確定方法，以提高提取動力學模型在實際生產(chǎn)工藝中的廣泛應用性和預測的精確性。

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DynaMics analysis of the extraction of polysaccharides froMGranati Pericarpium

WANG Zhan-yi1， DAIBo2， WANG Yu-hai1， ZHANG Li-hua1， LIZhuo-wa1， BIHai-dan1
（1.College of Life Science，Zaozhuang University，Zaozhuang 277160，China；2.Department of Pharmacy，Air Force General Hospital，People's Liberation Army，Beijing 100142，China）

AIMTo obtain the parameters for hotwater extraction of polysaccharides froMGranati PericarpiuMbased on dynamic mathematicalmodel.METHODSPolysaccharides were extracted thermostaticlly in different temperatures after Granati PericarpiuMbeing defatted by petroleuMether.With the total sugar and reducing sugar as indice，extraction parameters，such as kinetic rate constant k，the relative rates of raffinate，surface diffusion coefficient DS，the apparentactivation energy Ea，half-life values t1/2，were thus obtained.RESULTSThe dynamic extraction process fitted the first order reaction equation.The higher the temperature for extraction，the shorter time for polysaccharides froMGranati PericarpiuMconcentration to reach the required balanced state，k values and DSvalues intended to increase gradually，butwith a relative rapid decline of raffinate，and both Eavalues and t1/2values generally presented to decrease.CONCLUSIONThe extraction kinetics parameters for polysaccharides froMGranati PericarpiuMsuggest that the critical proceduremay lie in the inner diffusion of the solvent duringmaceration.

Granati Pericarpium；polysaccharide；extraction；dynamics analysis

R969.1

：A

：1001-1528（2015）05-0971-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.010

2014-09-09

國家星火計劃項目 （2012GA740049）；山東省自然科學基金 （ZR2013BL018）

王占一 （1980—），男，碩士，講師，執(zhí)業(yè)藥師，從事天然藥物有效成分提取分離工作。Tel：（0632）3785886，E-mail：zhyiwang@126.com