血涂片常規(guī)染色的歷史變遷與發(fā)展前景

宋曉穎，袁寶軍，郝冀洪

(1.開灤總醫(yī)院，河北唐山063000;2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北石家莊050000)

血涂片常規(guī)染色的歷史變遷與發(fā)展前景

宋曉穎1，袁寶軍1，郝冀洪2

(1.開灤總醫(yī)院，河北唐山063000;2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北石家莊050000)

對血涂片常規(guī)染色的組成、功能、效果的發(fā)展歷程及其應(yīng)用前景進行闡述。強調(diào)血細(xì)胞染色是形態(tài)學(xué)檢查的基礎(chǔ)，其染色效果決定血細(xì)胞識別的質(zhì)量，直接影響著血液系統(tǒng)疾病診斷與鑒別診斷的水平。

血涂片常規(guī)染色;歷史變遷;發(fā)展前景

血細(xì)胞染色是形態(tài)學(xué)檢查的基礎(chǔ)，其染色效果又決定了血細(xì)胞識別的質(zhì)量，直接影響著血液系統(tǒng)疾病診斷與鑒別診斷的水平。自從全國形態(tài)學(xué)專家座談會召開以來，迅速引起國內(nèi)各實驗室對形態(tài)學(xué)檢驗的重視，同時也注意了不斷提高血細(xì)胞染色的質(zhì)量。DUNNING等［1］關(guān)注了瑞氏(W right)-姆薩姬(Giemsa)染色法(簡稱瑞-姬染色法)60年的進程，并提出了理想的瑞-姬染色方案。實際上瑞-姬染色是改良的羅曼諾夫斯基(Romanowsky)染色法。羅氏染液對不同的血細(xì)胞有不同染色能力，最初是從陳舊發(fā)霉的亞甲藍、伊紅混合液將紅細(xì)胞內(nèi)寄生蟲的核物質(zhì)染成鮮艷的紫色和染色質(zhì)染成紅色而發(fā)現(xiàn)的。這種染液的特性是在藍色和粉紅色之外產(chǎn)生了第3種顏色——紫色。羅氏染液染出第3種顏色的能力被稱之為“羅氏效應(yīng)”。這種效應(yīng)可能是亞甲藍的氧化產(chǎn)物天青B與伊紅組成的一種復(fù)合物。1984年，國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(the International Council for Standardization in Haematology，ICSH)推薦Romanowsky染色為參考染色法［2-3］。隨后國內(nèi)外學(xué)者又先后又推出了快速染色法、混合染色法、改良染色法、替代染色法等。大量的文獻報道印證了Romanowsky染色的變遷，也展現(xiàn)了今后血細(xì)胞染色的發(fā)展前景。

一、經(jīng)典染色法的建立

俄羅斯學(xué)者ROMANOWSKY［4-5］首創(chuàng)了含有亞甲藍和伊紅的羅氏染色法，并證明亞甲藍-伊紅液越陳舊其染色效果越好。羅氏染色劑是利用氧化劑氧化亞甲藍，使之產(chǎn)生天青，再與伊紅液混合后可立即染已固定的涂片。曾有學(xué)者根據(jù)羅氏染色劑用伊紅和亞甲藍混合而成的原理，把兩者配成甲醇溶液用以染色。這種染色液雖可使涂片同時固定和染色，但因亞甲藍未經(jīng)處理，天青的含量極微，染色效果不佳，未被推廣使用。1901年利什曼(Leishiman)、1902年瑞氏(Wright)、1902年姬姆薩(Giemsa)分別根據(jù)羅氏染色劑用伊紅和亞甲藍混合而成的原理，設(shè)計了3種不同特點的染色劑，并成批生產(chǎn)出染色粉劑，從而建立了經(jīng)典染色法，并一直使用至今。

1.利什曼染色劑配方:亞甲藍1 g，碳酸鈉0.5 g，蒸餾水100 mL;水溶性伊紅0.1 g，蒸餾水100 m L。將以上2種溶液等份混合，放置6～12 h，常攪動，即有沉淀生成，過濾取其沉淀，晾干。用甲醇配成0.15%的溶液即可用以染色。

2.瑞氏染色劑配方:亞甲藍1 g，碳酸鈉0.5 g，蒸餾水100 mL。煮沸1 h，使加速氧化，冷后緩緩加入0.1%伊紅水溶液，充分?jǐn)噭樱谐恋砩?，過濾后取其沉淀。按常規(guī)方法配制瑞氏染色液并染色。

3種經(jīng)典染色法在臨床上應(yīng)用以后，雖然利什曼染色液和瑞氏染色液均有粉劑出售，但由于這2種染色法非常近似，所以目前使用瑞氏染色法和姬姆薩染色法較為普遍。在羅氏染色法的基礎(chǔ)上，有學(xué)者制出了May-Grunwald染色粉劑，并在臨床上推廣使用。隨后在May-Grunwald染色的基礎(chǔ)上又有學(xué)者建立了May-Grunwald-Giemsa染色法。

二、快速染色法的興起

經(jīng)典染色法應(yīng)用于臨床后，由于染色時間偏長，不利于急診檢驗，因此各種快速染色法先后推出?？焖偃旧ㄖ饕袃深?兩色分染法和快速促染法。

(一)兩色分染法

1941年Field提出在不用甲醇作為溶劑的前提下，先用一種染色液染色，后用另一種染色液染色。兩色分染法的染色時間可縮短，且價格低廉。Field法原來是用于瘧原蟲染色的，守屋(1947年)對此法做了改進，可用于血液標(biāo)本染色。其特點是:(1)已固定的涂片在甲液(水溶性伊紅1.0 g、Na2HPO45.0 g、KH2PO46.25 g，蒸餾水500 mL)中浸10～20 s;(2)由甲液中取出，立刻在水中將涂片左右輕微擺動數(shù)秒鐘，以沖去染液，直到血膜中無染液外滲，玻片邊緣不沾染液為止;(3)在乙液(亞甲藍0.8 g、天青Ⅰ0.5 g、Na2HPO45.0 g、KH2PO46.25 g，蒸餾水500 mL)中浸30～60 s，清水沖洗5～10 s，使涂片直立放置，待干。

Field兩色分染法在臨床上推廣后國內(nèi)外都有改良法。1944年，Singh等對甲液進行了修改，并使用緩沖液漂洗涂片。其特點是:(1)已固定的涂片置于甲液(亞甲藍水溶液中加少量硫酸，再加入重鉻酸鉀使之生成紫色沉淀，加熱直至液體變藍色;冷卻后滴加氫氧化鉀溶液直至沉淀完全溶解，并變?yōu)樯钏{帶紫色液;過濾，濾液即可應(yīng)用)內(nèi)30 s，pH值6.2～6.6的緩沖液漂洗;(2)置于乙液(0.2%水溶性伊紅)中1 s;(3)再置于甲液中30 s，用緩沖液漂洗10 s。國內(nèi)改良法較多，多數(shù)都按甲液、乙液分染，但染液成分和染色時間略有不同。巴特爾等［6］在甲液中加入了苯酚，乙液與Field兩色分染法近似，其步驟為:涂片置甲液2 s后取出用水沖洗玻片，乙液染色5～8 s，取出后用水沖洗，待干。快速染色會加快血液常規(guī)檢驗速度，同時也可避免漏掉可疑細(xì)胞，出現(xiàn)假陰性。于芳［7］在甲液中加入了苯酚，在乙液中加入天青Ⅰ和天青Ⅱ，其步驟為:血片浸入甲液2～3 s，取出水洗;浸入乙液6～8 s取出水洗，待干鏡檢。血涂片快速染色結(jié)果和瑞氏染色結(jié)果相似，可減少患者等候時間。

本研究選取的樣本只有102份，且有些國家地區(qū)的留學(xué)生樣本量太少，對研究結(jié)果造成了一定偶然性。研究得出的結(jié)構(gòu)方程模型擬合度還不夠好，說明在維度的劃分和題項的設(shè)置上還需要進一步改進和完善。

(二)快速促染法

兩色分染法雖然染色時間大大縮短，減少了患者的等候時間，但手續(xù)繁雜，且需經(jīng)常更換染色液。因此，國內(nèi)外學(xué)者均著手研究促染技術(shù)。

1.加大磷酸鹽類促染MCDONALD［8］在染液中加入Na2HPO4和KH2PO4以控制其pH值，可縮短染色時間。田榮宗等［9］在血細(xì)胞染色液中加入pH值6.8的甘油緩沖液，染料易溶，染色快，可使染色時間縮短至15 s。趙捷等［10］用改良McDonald法(在75 mL分析甘油中加入磷酸鹽緩沖液、Na2HPO41 g和KH2PO42 g，先以4 mL蒸餾水溶解，37℃水浴24 h溶解，保存于密封的瓶中。上述甘油緩沖液1.5 mL加瑞-姬染色液50 mL，混勻)染色。結(jié)果顯示加入甘油和磷酸鹽的染色劑天青B含量明顯增加，而天青B含量是提高染色效果的決定因素。以ICSH標(biāo)準(zhǔn)判斷血片染色效果，加入甘油磷酸鹽的染色劑明顯優(yōu)于常用的瑞-姬染色液。而且這種染色法試劑配制簡便，染色時間短，非常適合急癥和門診血常規(guī)檢驗，可在臨床上推廣使用。

2.加入表面活性劑促染目前已用的表面活性劑有二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)、聚乙二醇辛基苯基醚［octyl phenoxy poly ethoxy，OP;即曲拉通X-100(Triton X-100)］、吐溫80及吐溫20等。王繼貴等［11］用PVP先加于甲醇中，再配制瑞氏染液，血片染2 min，骨髓片染5 min。細(xì)胞染色快可能與PVP作用有關(guān)。鄧福貴等［12］在瑞氏-姬姆薩染液中加PVP，使染色在30 s內(nèi)一步完成，染色效果與原法一致，此染液尤其適用于臨床常規(guī)工作。王援朝等［13］在瑞氏染液中加入Triton X-100，染色時間為1～3 min。萬汝根［14］在瑞-姬染色液中加入Triton X-100，血片自然干燥后滴加染色液覆蓋血膜，2～30 s水洗，待干鏡檢。梁維崗［15］在瑞-姬染色液中加入吐溫20，血片自然干燥后滴加染色液覆蓋涂片，固定10 s，加等量蒸餾水染色2～5 min。董事早等［16］用乙醇配制的快速瑞-姬染色液中加入吐溫80，血膜固定20 s，加pH值6.5緩沖液染色1～2 min。由于吐溫80屬表面活性劑，具有增溶、去垢、分散、均染、促進化學(xué)結(jié)合等作用，因此染料顆粒少，并增強了染料對細(xì)胞的滲透性，使染色速度加快。鄢盛愷等［17］在McDonald法的基礎(chǔ)上，在瑞-姬染色液中既加甘油緩沖液，又加入少許PVP，染色20 s，輕洗20 s。加入PVP，可增加染料的溶解度;加入甘油緩沖液，可縮短染色時間。

三、標(biāo)準(zhǔn)染色法的推廣

經(jīng)典染色法和快速染色法用于臨床以后，由于每個實驗工作者都只習(xí)慣于本實驗室的染色方法，實驗室之間用不同的染色方法進行會診時，常引起爭論甚至作出不同的形態(tài)學(xué)診斷。同樣，參考圖譜也會出現(xiàn)問題，因為圖譜里的插圖也可能使用了不同的染色方法。不同染色法的插圖甚至?xí)`導(dǎo)讀者。所以將染色方法標(biāo)準(zhǔn)化不僅是日常診斷工作中的需要，也是進行研究工作所需要的。為了克服不同種類染色的效果差異以及實驗室間不同的染色標(biāo)準(zhǔn)，ICSH成立了血和骨髓片染色和染色方法小組，并確立了一套標(biāo)準(zhǔn)的血涂片染色方法。ICSH的專家們發(fā)現(xiàn)了3個基本條件可使Romanowsky染色法的重復(fù)效果滿意。(1)使用足夠純度的天青B以及伊紅Y;(2)正確和適當(dāng)?shù)慕M合染料將其配制成染液;(3)1個標(biāo)準(zhǔn)的染色方法需要選定緩沖液濃度。

1.ICSH推薦的標(biāo)準(zhǔn)染色法ICSH確立的標(biāo)準(zhǔn)染色方法要求:(1)貯存液由天青B-DMSO溶液(天青B 3 g，DMSO 400 mL)和伊紅Y-甲醇溶液(伊紅Y 1 g，甲醇600 m L)組成，兩液混合后以棕色瓶在室溫避光保存，可穩(wěn)定3個月;(2)染色液由1體積天青B-伊紅Y貯存液和14體積的10 mmol/L N-(2-羥乙基)哌嗪-N＇-2-乙烷磺酸［4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES］緩沖液(pH值6.6)1 000 mL及二甲亞砜50 mL組成，此溶液必須是新鮮配制，可穩(wěn)定4 h; (3)染色步驟:甲醇固定涂片后，加天青B和伊紅Y染色液，血涂片染色25 min，骨髓涂片染色35 min，蒸餾水沖洗。

2.SCHENK等［18］推薦的參考染色法由于ICSH推薦的標(biāo)準(zhǔn)染色法中要使用DMSO和HEPES，對實驗條件要求較為嚴(yán)格。因此，SCHENK等［18］提出使用甲醇和磷酸鹽替代，也能取得較為滿意的染色效果，有利于在臨床推廣。(1)貯存液由天青B-甲醇溶液(天青B 260 mg，甲醇100 mL)和伊紅Y-甲醇溶液(伊紅Y 130 mg，甲醇100 mL)組成;(2)染色液由1體積天青B-甲醇溶液、1體積伊紅Y-甲醇溶液和10體積0.067 mol/L Sorensen＇s磷酸鈉緩沖液(pH值6.8)組成，此溶液必須是新鮮配制，可穩(wěn)定1 h; (3)染色步驟:甲醇固定涂片后，加天青B-伊紅Y染液，血涂片染色10 min，蒸餾水沖洗。

ICSH推薦了標(biāo)準(zhǔn)染色法，同時提出了標(biāo)準(zhǔn)染色特點，隨后SCHENK等［18］推薦的參考染色法也提出了標(biāo)準(zhǔn)染色特點，見表1。

表1 ICSH和SCHENK等［18］提出的標(biāo)準(zhǔn)染色特點

ICSH推薦的標(biāo)準(zhǔn)染色法和SCHENK等［18］推薦的參考染色法公布以后，推廣時遇到了實際困難，主要原因是天青B的純度達不到要求。按ICSH的要求，天青B純度應(yīng)不低于95%，但市售的天青B純度均未超過84%。1988年，ICSH正式提出的標(biāo)準(zhǔn)染色法中對天青B純度的要求改為80%以上。由于天青B提純的費用較高，因此標(biāo)準(zhǔn)染色法在國內(nèi)推廣緩慢。

四、混合染色法的優(yōu)點

ICSH推薦的標(biāo)準(zhǔn)染色法和SCHENK等［18］推薦的參考染色法難以在臨床上推廣，而國內(nèi)常用的瑞氏和姬姆薩染色劑中的天青B含量均不符合ICSH要求，但這2種染色法各有優(yōu)缺點，瑞氏染色對細(xì)胞質(zhì)成分及中性顆粒著色好，而對細(xì)胞核的染色不如姬姆薩染色，采用瑞氏-姬姆薩復(fù)合染色液染色，兼取兩者之長，可使血細(xì)胞的胞質(zhì)、顆粒及胞核等獲得較為滿意的染色效果。因此，混合染色法引起了國內(nèi)外實驗室的高度重視。根據(jù)其染色特點分為以下3種。

1.混合配制染液一步染色法《全國臨床檢驗操作規(guī)程》笫1版(1991年)～笫3版(2006年)［19］推薦的混合染色液為瑞氏粉1 g、姬姆薩粉0.3 g、甲醇500 m L，染色6～10 min。王國洪［20］、王建萍［21］在此基礎(chǔ)上加大了姬姆薩粉劑的用量，使染色速度加快，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰。郭秀梅等［22］則以瑞氏粉0.6 g、姬姆薩粉1 g、甲醇500 m L配制混合染色液，使血片、骨髓片沒有染料沉淀顆粒，鏡檢清晰，易于鑒別。王金芝等［23］以瑞氏粉3.2 g、伊紅B 0.6 g、天青Ⅱ0.6 g、甲醇1 000 mL及pH值6.8甘油緩沖液25 mL配制混合染色液，血片染色15 s。梁硯華等［24］以姬姆薩粉5 g、亞甲藍伊紅染料1.5 g、中性甘油30 mL、甲醇600 mL配制混合染色液，縮短了染色時間，且有利于觀察細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。

2.兩液混合一步染色法周海良等［25］按常規(guī)方法配制瑞氏染色液、姬姆薩染色液及pH值6.5～6.8磷酸鹽緩沖液，將瑞氏染色液與姬姆薩染色液按3∶1比例混合，此液可長期保存。混合液與磷酸鹽緩沖液以1∶15的比例混合即為應(yīng)用染色液。固定血片直接插入應(yīng)用染色液缸內(nèi)，染色1～3 min。該法優(yōu)點是應(yīng)用染色液可多次重復(fù)應(yīng)用。

3.兩液雙重染色法劉小蓉［26］將血涂片自然晾干，瑞氏染液染色5 min，蒸餾水沖洗數(shù)遍，0.05%乙酸分色2～3 s，蒸餾水沖洗2遍，用稀釋了的姬姆薩染色液染色10 min，蒸餾水沖洗數(shù)遍。DUNNING等［1］推薦了理想的瑞-姬染色方案，固定后的涂片在瑞氏染液中染4 min，搖動幾次，再進入瑞氏染液工作液中(200 mL磷酸鹽緩沖液貯存液，25 mL瑞氏染液貯存液，25 mL吉姆薩染液貯存液，1 h內(nèi)使用)染12～20 min，搖動幾次。

五、改良染色法的特點

實踐證明，混合染色法優(yōu)于單一染色法。為了提高血片、骨髓片染色效果，國內(nèi)外仍不斷對染色技術(shù)加以改進，有的在染色液快速溶解方面進行了改良;有的在分化劑使用方面進行了改良;有的在血膜外形成一層液態(tài)膜方面進行了改良;也有的在微波快速染色方面進行了改良。

1.各種改良染色法侯金甫［27］在配制瑞-姬染色液時加入3%過氧化氫1.0 mL，省去了原法放在乳缽里充分研磨的時間，第2天即可使用。李碧華［28］吸取了Ezzat的經(jīng)驗，在配制瑞-姬染色液時加入濃鹽酸0.5 mL，以加速染料溶解速度，待染料溶解，用300 g/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.8～7.2，經(jīng)過幾年應(yīng)用，效果很好。章克萍［29-30］在使用瑞-姬染色液進行染色的過程中，以含微量乙酸的蒸餾水或去離子水溶液(1 000 mL水滴加3～4滴乙酸)作為分化劑，其優(yōu)點是易使血細(xì)胞著色，尤其是紅細(xì)胞著色好。吳祥林［31］將血片在154 mmol/L Nacl溶液中浸2 s，然后移入瑞氏染色液中5～10 s，蒸餾水沖洗。該方法是基于生理鹽水傾蓋血膜，在血膜外形成一層液態(tài)膜，阻隔了瑞氏染液直接與紅細(xì)胞接觸，而白細(xì)胞所帶電荷相對較多，這樣延緩了紅細(xì)胞與染料結(jié)合而白細(xì)胞則受影響較小。缺點是不能觀察紅細(xì)胞的形態(tài)變化。王貴娟等［32］在瑞-姬染色過程中，微波爐選用微波火力5檔，輸出功率為20%，血涂片輻射時間70 s，骨髓涂片輻射時間2.5 min，可極大的提高工作效率，參照ICSH標(biāo)準(zhǔn)判斷染色效果，染色結(jié)果十分滿意。

2.紙片染色法梅金安［33］以甲液(伊紅水溶液)和乙液(氧化亞甲藍水溶液)分別倒入2個小方盤內(nèi)，將濾紙剪成2 cm×4 cm的紙片放入染液內(nèi)浸泡10 min，65℃烤干，黑紙包好裝入塑料袋中備用。取伊紅紙片1張放于涂片上面，滴加95%乙醇5滴，染色1 min，用水沖掉紙片，再放亞甲藍紙片1張，加數(shù)滴水濕透紙片，染色1 min，水洗干后鏡檢。

六、替代染色法的問世

1879年，Ehrlich首先發(fā)現(xiàn)普通紡織染料能用于血細(xì)胞染色，這些紡織染料可將各類血細(xì)胞染成不同顏色。KASS［4］曾以多種紡織染料進行血細(xì)胞染色研究，效果十分理想。國內(nèi)學(xué)者也先后以國產(chǎn)紡織染料染血和骨髓涂片，也取得了非常滿意的結(jié)果。

1.國外研究概況1986年，KASS［4］以一種未知成份的紡織染料Synacril黑AN染血細(xì)胞，使巨核細(xì)胞呈現(xiàn)異染性紅紫色。隨后KASS連續(xù)發(fā)表多篇文章，都是以紡織染料單染或雙染各種血細(xì)胞，既創(chuàng)立了一些新染色法，也為臨床形態(tài)學(xué)診斷和鑒別診斷做出了突出貢獻。堿性藍93是一種偶氮紡織染料。將血或骨髓涂片固定后，堿性藍93可選擇性地將粒細(xì)胞初級顆粒染成黑色。這種黑色顆粒在早幼粒細(xì)胞最多，在中、晚幼粒細(xì)胞較少，桿狀核和分葉核粒細(xì)胞中僅見幾個黑色顆粒，一般細(xì)胞越成熟顆粒越小，著色越淡。Auer小體被染成黑色。堿性藍93染色有以下優(yōu)點: (1)操作簡單;(2)其水溶液在室內(nèi)可穩(wěn)定1年; (3)染色后標(biāo)本至少可保存3年;(4)可用陳舊標(biāo)本染色。堿性藍54是一種含硫的紡織染料。將血或骨髓涂片固定后，以堿性藍水溶液染色，并經(jīng)pH值3.6的乙酸緩沖液短暫漂洗，正常和病理單核細(xì)胞的核和胞質(zhì)均染成亮紫紅色，且常含有8～20個深紅色顆粒。中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的胞質(zhì)幾乎無色，細(xì)胞核為棕色。堿性藍148也是噁嗪類紡織染料，血和骨髓涂片固定后用堿性藍148的水溶液染色，然后在pH值5.6磷酸鹽緩沖液中漂洗。T輔助性淋巴細(xì)胞核和胞質(zhì)可染為深紅～紫紅色，而其它血細(xì)胞未見這種顏色?？勺鳛橐环N對T輔助性淋巴細(xì)胞快速篩選染色法。堿性藍41是一種含硫的偶氮染料，這種染料的甲醇液可將嗜堿粒細(xì)胞顆粒染為亮紅至深紅色，嗜酸粒細(xì)胞顆粒染為亮藍綠色，紅細(xì)胞為綠橙色。其它血和骨髓細(xì)胞的著色與傳統(tǒng)的染色結(jié)果近似。酸性紅52(acid red 52)是一種偶氮紡織染料。將血或骨髓涂片固定后，用酸性紅52的水溶液染色，可將成熟中性粒細(xì)胞顆粒染成亮紅色，Auer小體可染成紅色，嗜酸粒細(xì)胞和嗜堿粒細(xì)胞中的顆粒染成深紅色。其它血細(xì)胞中未見紅色顆粒。

2.國內(nèi)研究概況李順義等［34］發(fā)現(xiàn)國產(chǎn)紡織染料耐曬黑G的乙醇溶液對粒細(xì)胞有特異性著色。耐曬黑G是一種多偶氮紡織染料，其乙醇溶液可染粒細(xì)胞，早期原粒細(xì)胞為陰性，晚期原粒細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有少數(shù)黑色顆粒，早幼粒細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有多數(shù)細(xì)小黑色顆粒，中幼粒以下階段粒細(xì)胞著色強，嗜酸粒細(xì)胞著色也強，嗜堿粒細(xì)胞陰性。淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、漿細(xì)胞、幼紅細(xì)胞和巨核細(xì)胞陰性，組織嗜酸細(xì)胞陽性。朱蕓等［35］以國產(chǎn)紡織染料堿性品藍替代血細(xì)胞常規(guī)染色，血涂片經(jīng)甲醇固定后，直接用堿性品藍水溶液染色，染色結(jié)果與瑞氏染色相近似。郝冀洪等［36］用堿性品藍對巨核細(xì)胞和血小板進行染色，通過優(yōu)選漂洗液使染色結(jié)果與其他血細(xì)胞有明顯的區(qū)別。

除紡織染料可替代瑞氏/姬姆薩染色外，徐宏瑛［37］以煌焦油藍-曙紅染色液替代瑞氏/姬姆薩染色進行白細(xì)胞分類計數(shù)，結(jié)果與瑞氏染色一致，同時這種染色液也可進行網(wǎng)織紅細(xì)胞活體染色。

七、血涂片常規(guī)染色的發(fā)展前景

血細(xì)胞染色在國內(nèi)使用最多的是瑞氏染色法和瑞-姬染色法。這2種染色法的天青B含量均達不到Romanowsky染色的要求。雖然生物學(xué)染色委員會限定天青B最低含量為80%，但國內(nèi)、外瑞氏染色劑中天青B的含量仍較低。生物學(xué)染色委員會曾調(diào)查國外9個廠家生產(chǎn)的瑞氏染色劑，其中8種染色劑天青B的含量僅為35%，亞甲藍為30%，天青A為25%，天青C為10%;剩余一種天青B含量為74%，均達不到天青B含量80%的要求。近年用高效液相色譜儀對姬姆薩染色劑的天青Ⅱ做了物質(zhì)組成分析，其中亞甲藍為63.6%、天青B為28.6%、天青A為4.4%、天青C為1.4%、硫堇為1.9%;而天青Ⅰ并不是很純，而是一種硫堇及其3，7-N-甲基的衍生物。說明姬姆薩染色劑也達不到天青B含量80%的要求。

1.ICSH推薦的Romanowsky染色法要求天青B純度較高。一般認(rèn)為94%的天青B可以生產(chǎn)，但其可溶性差，需加增溶劑，而且制作成本高，從經(jīng)濟實用方面考慮不太實際。因此目前多用于科學(xué)研究，尚難在常規(guī)工作中應(yīng)用。同時商品化天青B價格較高，在市場上很難購到，致使這種參考方法在各國推廣起來進展不快。若能在現(xiàn)有基礎(chǔ)上提高國產(chǎn)瑞氏、姬氏染料中天青B的含量，也可逐步與ICSH接軌。

2.瑞-姬染色法60年的實踐經(jīng)驗提示我們，作為經(jīng)典染色技術(shù)，瑞-姬染色法通過進一步改進仍然是理想的染色法。May-Grunwald染色和May-Grunwald-Giemsa染色也可用于血和骨髓涂片染色，并能獲得比較理想的染色效果。這些均是今后血細(xì)胞染色重要的染色技術(shù)。

3.血細(xì)胞染色是形態(tài)學(xué)檢查的基礎(chǔ)，其染色效果又決定了血細(xì)胞識別的質(zhì)量，而且國內(nèi)各實驗室用量較大。因此，從實際工作需要出發(fā)，為了提高血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查的質(zhì)量，應(yīng)組織國內(nèi)化工專業(yè)生產(chǎn)染料的工廠通過攻關(guān)，盡快生產(chǎn)出高質(zhì)量的血細(xì)胞染色劑。

4.國產(chǎn)紡織染料堿性品藍水溶液可染各種血細(xì)胞，染色結(jié)果與瑞氏染色相近似。證明應(yīng)用國產(chǎn)紡織染料開展染色研究，已取得了可喜的成果。我國是一個紡織大國，國產(chǎn)紡織染料眾多，經(jīng)過篩選，可用于血細(xì)胞染色。由于國產(chǎn)紡織染料易得，方法簡單，而且不需要特殊的儀器，有非常廣闊的發(fā)展前景。

致謝:本文承蒙河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院李順義教授審閱，特此致謝。

［1］DUNNING K，SAFO AO.The ultimate W right-Giemsa stain:60 years in the making［J］.Biotech Histochem，2011，86(2):69-75.

［2］International Committee for Standardization Haematology.ICSH reference method for staining of blood and bone marrow films by azure B and eosin Y (Romanowsky stain)［J］.Br J Haematol，1984，57 (4):707-710.

［3］HOROBIN RW.How Romanowsky stains work and why they remain valuable-including a proposed universal Romanowsky staining mechanism and a rational troubleshooting scheme［J］.Biotech Histochem，2011，86(1):36-51.

［4］KASS L.New stains for blood and bone marrow cells［J］.Stain Technol，1990，65(5):211-230.

［5］KRAFTS KP.The Malachowski-Wright-Giemsa stain: a many-splendore thing［J］.Biotech Histochem，2011，86(1):5-6.

［6］巴特爾，李曉蓮.快速染色液在血液常規(guī)涂片檢查中的應(yīng)用［J］.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志，2000，47(1):69.

［7］于芳.快速血片染色法的應(yīng)用［J］.湖北預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2001，12(S1):83.

［8］MCDONALD MJ.Modification of the W right-Giemsa stain for rapid staining［J］.Med Lab Sci，1987，44 (1):88.

［9］田榮宗，馮問秀，李榮勝，等.一種多用途的快速染色法［J］.上海醫(yī)學(xué)檢驗雜志，1992，7(2):97-98.

［10］趙捷，李順義.介紹一種快速血細(xì)胞染色法［J］.疑難病雜志，2002，1(1):50.

［11］王繼貴，相桂英，周賽琴，等.介紹一種改良血及骨髓涂片染色劑［J］.上海醫(yī)學(xué)檢驗雜志，1992，7 (1):35.

［12］鄧福貴，宋萬英.一種快速瑞氏-姬姆薩染色液［J］.臨床檢驗雜志，1995，13(2):111.

［13］王援朝.用二甲亞砜及非離子表面活性劑改進瑞氏染液的探討［J］.中華血液學(xué)雜志，1992，13(4): 209.

［14］萬汝根.改良快速瑞氏-姬姆薩染色液［J］.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，1998，21(3):37.

［15］梁維崗.加吐溫20的瑞氏-姬姆薩染色液［J］.臨床檢驗雜志，1995，13(6):316.

［16］董世早，湯正平.用乙醇配制的快速瑞氏-姬姆染色液［J］.安徽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，1998，4(2):169-170.

［17］鄢盛愷，俞善丁.介紹一種快速實用瑞-姬氏染色法［J］.臨床檢驗雜志，1992，12(3):167.

［18］SCHENK EA，STOTA EH.Note from the biological stain commission:revision of azure B assay protocol［J］.Stain Technol，1988，63(1):65-69.

［19］葉應(yīng)嫵，王毓三，申子瑜.全國臨床檢驗操作規(guī)程［M］.3版.南京:東南大學(xué)出版社，2006:124.

［20］王國洪.一種快速血片染色法介紹［J］.黔南民族醫(yī)專學(xué)報，1996，9(2):11-13.

［21］王建萍.快速瑞忒氏姬姆薩氏混合一次染色法的使用介紹［J］.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志，1998，45(6):55.

［22］郭秀梅，馮秀麗，趙毅剛.改良瑞氏染色法［J］.農(nóng)墾醫(yī)學(xué)，1998，24(3):179.

［23］王金芝，潘麗，畢瑞金.一種改良的瑞氏快速染色法［J］.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1995，12(1):39.

［24］梁硯華.介紹一種改進的血片染色法［J］.中國廠礦醫(yī)學(xué)，1995，10(6):393.

［25］周海良，戴啟宇，于賀軍.介紹一種末梢血片血細(xì)胞單一染色法［J］.臨床軍醫(yī)雜志，2000，28(2): 69-70.

［26］劉小蓉.血涂片的雙重染色法的改良［J］.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1998，18(4):328.

［27］侯金甫.介紹一種新瑞-姬氏染色法［J］.陜西醫(yī)學(xué)檢驗，1994，9(2):121-122.

［28］李碧華.介紹一種血片染色法［J］.四川醫(yī)學(xué)，1998，19(1):79.

［29］章克萍.介紹血液Wright染色改良法［J］.江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1997，42(1):119.

［30］章克萍，呂嬌鳳.一種制作血涂片染色的新方法［J］.江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2002，47(1):17.

［31］吳祥林.一種白細(xì)胞分類染色方法的改進［J］.上海醫(yī)學(xué)檢驗雜志，2001，16(2):123.

［32］王貴娟，武惠珍.血細(xì)胞微波快速W right-Giemsa染色［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2003，44(1):36.

［33］梅金安.一種紙片快速細(xì)胞學(xué)涂片染色方法［J］.中華病理學(xué)雜志，1994，40(3):187.

［34］李順義，張靜.紡織染料耐曬黑G染色在血細(xì)胞研究中的應(yīng)用［J］.中華血液學(xué)雜志，1993，14(11): 595-596.

［35］朱蕓，張靜，石廣和.堿性品藍血細(xì)胞染色法［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2001，42(5):301.

［36］郝冀洪，朱蕓，張靜，等.巨核細(xì)胞新染色方法及其臨床應(yīng)用研究［J］.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2005，28 (9):40-43.

［37］徐宏瑛.介紹一種血細(xì)胞與網(wǎng)織紅細(xì)胞兩用染色液［J］.江西醫(yī)學(xué)檢驗，1994，12(4):33.

The historical evolution and development prospect of rou tine blood smear staining

SONG Xiaoying1，YUAN Baojun1，HAO Jihong2.(1.Kailuan General Hospital，Hebei Tangshan 063000，China;2.The Second Hospital of Hebei Medical University，Hebei Shijiazhuang 050000，China)

The objection is to state of composition，function，history development and application prospect of routine blood smear staining，in order to stress that blood staining is the basis of morphological diagnosis.The staining effect determines the identification of blood cells and impacts on the level of blood system disease diagnosis and differential diagnosis.

Routine blood smear staining;Historical evolution;Prospect

1673-8640(2015)09-0962-06

R446.1

A

10.3969/j.issn.1673-8640.2015.09.022

2014-09-28)

(本文編輯:范基農(nóng))

宋曉穎，女，1986年生，學(xué)士，技師，從事醫(yī)學(xué)檢驗工作。

袁寶軍，聯(lián)系電話:0315-3025853。