抗代謝類抗腫瘤藥物對人腫瘤細胞中核苷酸代謝的影響

王 迪，魏 嵐，劉 希，劉昊昆，胡文藝，孫立新（沈陽藥科大學藥學院，沈陽 110016）

·藥劑·

抗代謝類抗腫瘤藥物對人腫瘤細胞中核苷酸代謝的影響

王 迪，魏 嵐，劉 希，劉昊昆，胡文藝，孫立新＊（沈陽藥科大學藥學院，沈陽 110016）

目的 研究抗代謝類抗腫瘤藥物對人腫瘤細胞核苷酸代謝的影響。方法 采用離子對高效液相色譜法測定藥物作用前后12種人腫瘤細胞中的12種核苷酸組分的含量，通過對主成分分析并結(jié)合單因素方差分析及受試者工作曲線分析、尋找與藥物作用相關(guān)的標記物。結(jié)果 對照組與加藥組之間核苷酸代謝模式存在差異，篩選出貢獻較大的組分為ATP、ADP、GMP和UDP，結(jié)合ROC曲線分析可知ATP、GMP和UDP具有一定的診斷準確性。結(jié)論 ATP、UDP和GMP為藥物作用相關(guān)的最佳生物標記物。

抗代謝藥；人腫瘤細胞；核苷酸；生物標記物

腫瘤從本質(zhì)上說是一種基因病，其發(fā)生是某些染色體上的DNA損傷而使基因突變的結(jié)果，涉及不同染色體上多種基因的變化［1］。研究顯示，腫瘤細胞的基因經(jīng)常在不同位點發(fā)生修飾，從脫氧核糖核酸堿基對改變的點突變到染色體交換等明顯問題都有發(fā)生。而基因是DNA的一部分，核苷酸為DNA的基本組成單位，基因突變必將導致細胞內(nèi)核苷酸水平的改變。

腫瘤細胞代謝極其旺盛，腫瘤的發(fā)生發(fā)展勢必伴隨著細胞內(nèi)外微環(huán)境的變化。在癌癥進展早期，核苷酸的缺乏將增加DNA復制壓力并導致基因不穩(wěn)定性增加［2］。據(jù)研究報道，腫瘤細胞從一個生長期轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪粋€生長期時常伴有核苷酸庫、核苷庫以及堿基庫更新速率的變化，例如，與平臺期相比，增殖期在利用嘌呤前體物質(zhì)方面更高效［3］。在各種癌癥病人的血漿中，游離脫氧核糖核酸的水平會升高，這在伴有腫瘤轉(zhuǎn)移的病人中尤其明顯，而病人治療后游離脫氧核糖核酸保持著高水平通常是預后差的標志［4］。因此，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療均與機體核苷酸水平密切相關(guān)。

目前，已有通過細胞核苷酸庫的變化來探索藥物作用機制的報道［5－10］，但對細胞內(nèi)核苷酸類代謝物的分析多集中于三磷酸核苷酸，而對單、雙及三磷酸核苷酸同時測定的報道較少。本實驗選擇抗代謝類抗腫瘤藥物5－氟尿嘧啶（5－Fu）、阿糖胞苷（Ara－C）和甲氨蝶呤（MTX）作為外界擾動，給予細胞刺激，考察細胞中12種單、雙及三磷酸核苷酸的代謝變化，尋找與藥物作用相關(guān)的生物標記物，從分子水平對其作用機制進行探討。

1 儀器與材料

1.1 儀器 L－2130高效液相色譜儀購于Hitachi High－Technologies公司；Multiskan MK3酶標儀購于賽默飛世爾（上海）儀器有限公司。

1.2 材料 ATP－Na2、dUTP－Na3、CTP－Na2、UTPNa2、dATP－Na3、dGTP－Na4和dCTP－Na3對照品，購于美國Sigma－Aldrich公司；GDP－Na2、GMP－Na2、UDP－Na2、ADP－Na2和AMP－Na2對照品，購于上海源葉生物科技有限公司；氟尿嘧啶注射液購于天津金耀集團有限公司；注射用甲氨蝶呤購于山西普德藥業(yè)有限公司；注射用鹽酸阿糖胞苷購于浙江海正藥業(yè)股份有限公司；四丁基氫氧化銨（質(zhì)量分數(shù)10%）水溶液購于天津市科密歐化學試劑有限公司；甲醇（色譜級）購于山東禹王實業(yè)有限公司；三氯乙酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鉀、二甲亞砜均為分析純，購于天津博迪化工股份有限公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、RPMI－1640培養(yǎng)基購于美國Gibico公司；四季青胎牛血清購于杭州四季青生物工程有限公司；TBD標準胎牛血清購于天津市灝洋生物制品科技有限責任公司；MTT（溴化－3－（4，5－二甲基－2－噻唑基）－2，5－二苯基四氮唑）、HEPES（4－羥乙基哌嗪乙磺酸）、胰蛋白酶購于美國Amresco公司；PBS（磷酸鹽緩沖液）購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；注射用硫酸鏈霉素購于山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司；注射用青霉素鈉購于華北制藥股份有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)及抗腫瘤活性測定 所有細胞由本實驗室傳代保種。人宮頸癌Hela細胞、人口腔癌KB細胞、人乳腺癌MCF－7細胞、人胃癌SGC7901細胞、人成纖維肉瘤HT1080細胞、人前列腺癌PC3細胞和人前列腺癌DU145細胞，采用RPMI－1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，其中含有體積分數(shù)10%TBD標準胎牛血清、2.0g·L－1碳酸氫鈉、2.4g·L－1HEPES、10萬單位·L－1青霉素、10萬單位·L－1鏈霉素；人肺癌A549細胞、人肝癌HepG2細胞、人乳腺癌T47D細胞、人卵巢癌SKOV3細胞和人橫紋肌肉瘤A204細胞采用高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，其中含有體積分數(shù)10%四季青胎牛血清、2.4g·L－1HEPES、3.7g·L－1碳酸氫鈉、10萬單位·L－1青霉素、10萬單位·L－1鏈霉素。所有細胞置于37℃、含體積分數(shù)5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

采用MTT法測定3種抗腫瘤藥物對細胞的生長抑制作用［11－12］。取對數(shù)生長期的細胞，經(jīng)胰酶消化后制成5×104·mL－1的細胞懸液，分別接種于96孔板中，每孔200μL，置于37℃、體積分數(shù)5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，棄去培養(yǎng)液，每孔加不同質(zhì)量濃度的藥液及空白培養(yǎng)液200μL，每組均設(shè)6復孔，置于37℃、體積分數(shù)5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)48h后，除去培養(yǎng)液，每孔加入5mg·mL－1MTT溶液20μL，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后，加入150μL DMSO終止反應(yīng)。用酶標儀在492nm處測定A值。計算藥物對細胞的抑制率，并進一步求得半數(shù)有效劑量IC50。

2.2 細胞給藥及樣品提取 選擇處于對數(shù)生長期的細胞，經(jīng)胰酶消化制成細胞懸液，以1×106數(shù)目接種到不同的培養(yǎng)瓶中，隨機分為對照組及給藥組，置于37℃、體積分數(shù)5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24h，用培養(yǎng)液將藥物適當稀釋，以IC50值作為給藥質(zhì)量濃度，向給藥組細胞的培養(yǎng)瓶中加入適量藥物，對照組細胞的培養(yǎng)瓶中加入等量的新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h。

樣品提取方法參照文獻方法［13］后棄去培養(yǎng)液，經(jīng)PBS清洗，用體積分數(shù)6%三氯乙酸沉淀蛋白后獲得上清液，貯存于－80℃，進行HPLC分析前以150μL 0.5mol·L－1KOH調(diào)pH至中性。

2.3 核苷酸分析 采用離子對高效液相色譜法對細胞中12種核苷酸類代謝物進行分析［13］。色譜條件如下。色譜柱：Phenomenex Synergi Hydro C18（250mm ×4.6mm，4μm）；流動相：A相為體積分數(shù)25%甲醇水溶液，含有5.6mmol·L－1氫氧化四丁基銨、50mmol·L－1KH2PO4，pH為6.93，B相為體積分數(shù)0.25%甲醇水溶液，含有8mmol·L－1氫氧化四丁基銨、10mmol·L－1KH2PO4，pH為6.93；線性梯度洗脫程序：0～50min，48%～60%A；50～68min，60%～100%A；68～77min，100%A；流速：0.8mL·min－1；檢測波長：254nm；柱溫：25℃；進樣量：20μL。

2.4 統(tǒng)計分析 通過SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，利用單因素方差分析（one－way analysis of variance significant test，ANOVA）進行顯著性檢驗分析，評估對照組和給藥組細胞核苷酸類代謝物的差異（P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義）；通過SIMCA－P 11.5Demo軟件對數(shù)據(jù)進行主成分（PCA）分析，篩選藥物作用相關(guān)的生物標記物。結(jié)合受試者工作（ROC）曲線對潛在生物標記物進行進一步驗證。

3 結(jié)果與討論

12種細胞中核苷酸含量及藥物作用后細胞中核苷酸測定結(jié)果見表1～4。

3種藥物作用于細胞后均引起細胞內(nèi)核苷酸組分的含量發(fā)生了不同程度的變化，如ATP、ADP水平顯著降低，CTP、UTP水平升高等。內(nèi)源性的ATP在細胞的新陳代謝及各種生化反應(yīng)的能量供給中扮演著角色，研究表明本實驗中選用的3種藥物作用于細胞后，可引起細胞線粒體功能的紊亂，導致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，線粒體膜電位降低，ROS形成增加等［14－16］，進而引發(fā)細胞凋亡［17－19］。線粒體功能損傷及凋亡可能是細胞中ATP水平降低的原因。由于ATP不足，細胞為了維持正常的生理活動，積極利用ATP中的另一高能磷酸鍵，最終造成細胞內(nèi)ADP水平下降；但在ATP生成減少的同時，也可引起ADP的堆積，最終使得ADP含量并未顯著降低，而T47D、PC3細胞分別給予5－Fu、Ara－C刺激后，反而引起ADP含量增加。

表1 對照組細胞中12種核苷酸的含量Tab.1 Contents of 12nucleotides in cells of control group（μg／108cells）

表2 5－Fu給藥組細胞中12種核苷酸的含量Tab.2 Contents of 12nucleotides in cells of 5－Fu－treated group（μg／108cells，n＝3）

表3 Ara－C給藥組細胞中12種核苷酸的含量Tab.3 Contents of 12nucleotides in cells of Ara－C－treated group（μg／108cells，n＝3）

表4 MTX給藥組細胞中12種核苷酸的含量Tab.4 Contents of 12nucleotides in cells of MTX－treated group（μg／108cells，n＝3）

對于CTP和UTP，與未加藥組相比，發(fā)現(xiàn)多數(shù)癌細胞受刺激后這2種組分的變化趨勢極為相似，推測可能與嘧啶核苷酸的合成代謝有關(guān)。在生物體內(nèi)，UTP在CTP合成酶的作用下，與谷氨酰胺作用生成CTP，由此可見，CTP是在UTP的基礎(chǔ)上合成的，因此，當細胞受到外界刺激后，UTP與CTP的變化具有同步性。

以5－Fu刺激細胞后，除HepG2和T47D細胞外，細胞內(nèi)UTP含量均升高；僅在MCF7和DU145細胞內(nèi)檢測到UDP含量升高；對于dATP、dGTP、dCTP，除A549和HepG2外，在細胞內(nèi)含量均下降，提示DNA的合成異常；SGC7901、A204和HepG2細胞內(nèi)dUTP水平下調(diào)，其他細胞內(nèi)dUTP含量均呈現(xiàn)上調(diào)，該現(xiàn)象可能與5－Fu代謝有關(guān)。5－Fu為嘧啶類物質(zhì)，其在細胞內(nèi)乳清酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（OPRT）和胸苷磷酸化酶（TS）的作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)榉撗跄蜍账幔‵dUMP），最終代謝為dFUTP；也可經(jīng)尿苷磷酸化酶的作用轉(zhuǎn)變?yōu)榉蜍账幔‵UMP）和FUTP，抑制胸苷酸合成酶（TS）并摻入DNA和RNA合成中，抑制細胞增殖。TS可將dUMP轉(zhuǎn)化為TMP，受抑制后，造成dUMP積累，最終引起細胞內(nèi)dUTP和FdUTP含量升高，F(xiàn)dUTP和dUTP共同競爭DNA的合成，引起dUTP的積累；而TMP合成受阻時，胸苷激酶將補救合成TMP和FdUMP，則TMP水平升高反饋調(diào)節(jié)dUMP水平下降，最終可引起dUTP水平下降；另外細胞內(nèi)dUTP焦磷酸酶通過催化dUTP水解為dUMP，同時也可促進FdUTP轉(zhuǎn)化為FdUMP，阻止dUTP和FdUTP的積累；因此細胞內(nèi)dUTP含量的變化是多態(tài)性的。此外，F(xiàn)UTP與UTP競爭摻入RNA合成，最終引起UTP的積聚。研究表明，不同癌細胞中尿苷磷酸化酶、胸苷磷酸化酶的活性不同，Pizzorno等［20］以人結(jié)腸癌HCT8細胞和HT29細胞株為研究對象，前者尿苷激酶的活性高于胸苷激酶的活性，將2種細胞株置于相同質(zhì)量濃度的5－Fu中，發(fā)現(xiàn)在相同的作用時間內(nèi)，HT28細胞中FdUMP質(zhì)量濃度顯著高于HCT8細胞；在HT28細胞中，F(xiàn)dUMP抑制TS后引起dUTP持續(xù)積累，而在HCT8細胞中未發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象，由此說明HCT8細胞主要以RNA介導的細胞毒性為主，而HT28細胞以干擾DNA合成為主。因此，細胞種類的差異可能是核苷酸變化差異的原因。

MTX作用于細胞后，也引起了細胞內(nèi)核苷酸組分代謝的變化。除MCF7和HepG2細胞外，dATP、dCTP和dGTP水平下降；提示DNA合成異常。不同細胞內(nèi)dUTP變化趨勢各不相同，該現(xiàn)象可能與MTX的作用機制有關(guān)。MTX在葉酰多聚谷氨酸合成酶的催化下形成MTX聚谷氨酸（MTXPG），其可抑制起始嘌呤（de novo purine，DNP）合成所需的轉(zhuǎn)移酶和胸腺嘧啶核苷酸合成酶（thymidylate synthase，TS），最終引起細胞內(nèi)dUTP含量減少；另外MTX可導致DNA鍵斷裂，dUTP可間接地通過細胞修復摻入DNA中，引起dUTP減少［21］；因此細胞受MTX作用后，細胞內(nèi)dUTP水平的波動也具有多態(tài)性。實驗中GMP和GDP的水平下調(diào)（MCF7細胞除外），這與其抑制四氫葉酸合成，進而抑制嘌呤合成的作用機制有關(guān)。有研究報道，在嘌呤的合成過程中，MTX可抑制5－氨基咪唑－4－羧基酰胺核糖核苷酸（5－aminoimidazole－4－carboxamide ribonucleotide，AICAR）的甲?；D(zhuǎn)移酶，導致AICAR堆積，后者通過抑制5′－單磷酸腺苷脫氨酶和腺苷脫氨酶的活性，從而抑制了5′－單磷酸腺苷和腺苷的降解，最終使細胞內(nèi)外的5′－單磷酸腺苷和腺苷增多［22］，本實驗也檢測到AMP水平顯著提高。另外，MTX可在肝醛氧化酶的作用下代謝為7－羥基MTX（7－OHMTX），MTX和7－OHMTX的聚谷氨酰胺形式對TS、甘氨酰胺核苷酸甲酰基轉(zhuǎn)移酶（GARFT）均具有抑制能力，GARFT可催化甲?；鶑?0－甲酰四氫葉酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦拾滨０泛塑账幔摲磻?yīng)為嘌呤生物合成途徑中的一個步驟［23］。Sokoloski等［7］以白血病細胞株HL60為研究對象，研究發(fā)現(xiàn)，GARFT受抑制后引起細胞內(nèi)ATP水平下降，UTP水平升高。本實驗除Hela和MCF7細胞外，研究發(fā)現(xiàn)，UTP水平均呈現(xiàn)上調(diào)，推測可能與細胞內(nèi)GARFT受抑制有關(guān)。但在HT 1 080、MCF7和A204細胞中CTP水平下調(diào)，與UTP變化趨勢不一致，可能與參與嘧啶代謝的酶活性相關(guān)，有待于進一步研究。

給予Ara－C后細胞內(nèi)UTP含量上升，除Hela和MCF7細胞外，細胞內(nèi)CTP含量也升高；dATP、dGTP下降。實驗中檢測到DU145、Hela和MCF7細胞內(nèi)dCTP含量升高，可能與Ara－C作用機制相關(guān)，Ara－C為嘧啶類抑制劑，進入細胞后首先在脫氧胞苷激酶（DCK）的作用下磷酸化成Ara－CMP，然后通過一磷酸和二磷酸嘧啶核苷酸激酶轉(zhuǎn)化為Ara－CDP和Ara－CTP。Ara－CTP是Ara－C藥理作用的主要活性形式，后者能強有力地抑制DNA多聚酶，或直接以偽代謝物形式與dCTP競爭摻入到DNA合成中，造成細胞內(nèi)dCTP積累；有研究報道，細胞內(nèi)脫氧核苷酸酶Ι（dNT－Ι）的mRNA表達與Ara－C活性具有相關(guān)性［24］，dNT－Ι水平升高會使細胞內(nèi)dCTP含量上升，其會和Ara－CTP競爭與DNA的相互作用，使Ara－C的作用減弱；而在T47D細胞和PC3細胞內(nèi)的dCTP水平下降，可能與細胞內(nèi)脫氧胞苷激酶活性較低或缺陷有關(guān)。另外，實驗中發(fā)現(xiàn)，PC3和DU145細胞內(nèi)GMP水平顯著升高，具體原因尚不明確。

采用單因素方差分析對比對照組和給藥組，結(jié)果表明，給藥前后UDP、ADP、ATP和GMP具有顯著性差異，推測藥物使腫瘤細胞內(nèi)核苷酸代謝模式發(fā)生了變化。初步推斷具有顯著性差異的核苷酸可能為藥物作用相關(guān)的生物標記物。

對測定結(jié)果進行PCA分析，結(jié)果見圖1和圖2。圖1中的每一個點代表一個樣本，樣本的位置由細胞樣本中所含核苷酸組分的質(zhì)量濃度決定，根據(jù)物以類聚的原則，處于相似生理病理狀態(tài)的細胞通常具有相似的水平，可分布在相似的位置。由圖1可知，對照組細胞和加藥組細胞被分為兩類，組內(nèi)的細胞樣本較為分散，可能是由細胞種類的差異以及藥物與細胞間相互作用的差異引起的。圖2中的每一個點代表了樣本中所檢測的核苷酸組分，載荷點距離零點位置越遠，表明其所代表的核苷酸在不同組之間的質(zhì)量濃度差異越大，對各細胞在score plot上的分型貢獻越大。從圖2可知，ATP、GMP、UDP和ADP離零點相對較遠，對2組之間的分型貢獻相對較大，可能為藥物作用相關(guān)的標記物。

圖1 對照組和給藥組細胞的得分圖（對照組；Ara－C給藥組；5－FU－給藥組；MTX給藥組）Fig.1 PCA score plot of cells from control group and drugtreated groups（control group；Ara－C－treated group；5－FU－treated group；MTX－treated group）

圖2 體現(xiàn)對照組和給藥組細胞相互關(guān)系的載荷圖

圖3 核苷酸類物質(zhì)區(qū)分對照組和給藥組細胞能力的ROC曲線分析Fig.3 ROC curve of the ability of nucleotide metabolites to discriminate cells in control group and drug－treated groups

為了尋找出更具有診斷價值的生物標記物，我們在上述數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上，采用SPSS 16.0軟件對對照組和給藥組的測定結(jié)果進行了ROC曲線分析。實驗中一般以ROC曲線下面積（AUC）值來表征統(tǒng)計結(jié)果：AUC值越接近于1，診斷效果越好；在0.5～0.7時有較低準確性，在0.7～0.9時有一定準確性，在0.9以上時有較高準確性。AUC結(jié)果ATP（0.990）＞GMP（0.987）＞UDP（0.963）＞dCTP（0.798）＞dATP（0.783）。GMP、ATP和UDP具有更高的診斷準確性，因此將其識別為與藥物作用相關(guān)的生物標記物。

4 結(jié)論

本研究將臨床常用的3種抗代謝類抗癌藥物作為外界擾動作用于12種腫瘤細胞，采用離子對高效液相色譜法分析其中的核苷酸類代謝物，并針對核苷酸的代謝變化進行了初步分析。結(jié)合PCA分析、ANOVA、ROC曲線分析結(jié)果，將GMP、ATP和UDP識別為藥物作用相關(guān)的生物標記物。雖然本研究并未對所有的核苷酸在藥物作用后的變化機制全部進行解釋，但是所得結(jié)論足以說明生物體內(nèi)生理生化過程與核苷酸的代謝變化密切相關(guān)。因此，可通過檢測該類物質(zhì)的水平波動來闡明藥物作用靶點、揭示藥物作用機制等。

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Effects of antimetabolite agents on the metabolism of nucleotides in human tumor cells

WANG Di，WEI Lan，LIU Xi，LIU Haokun，HU Wenyi，SUN Lixin＊（School of Pharmacy，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China）

Objective To study the effects of antimetabolite agents on the nucleotide pools in human tumor cells.Methods Contents of twelve nucleotides in twelve human tumor cells of control group and drug－treated group were determined by ion－pair HPLC method.Several data processing methods were combined for the identification of potential biomarkers associated with the action of drugs，including principal component analysis（PCA），one－way analysis of variance significant test（ANOVA），and receiver operating characteristic（ROC）curve.Results A significant difference has been found in nucleotides between control group and drugtreated group.The dominant metabolites were ATP，ADP，GMP and UDP，which were further validated by ROC curve analysis.Conclusion ATP，GMP and UDP were recognized as the best potential biomarkers associated with the drug action.

antimetabolite agents；human tumor cells；nucleotide；potential biomarkers

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.01.016

R94

A

1004－2407（2015）01－0059－07

2014－06－10）

地方高校國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（編號：201210163007）

王迪，女，2011級藥學專業(yè)本科生

＊通信作者：孫立新，女，教授，博士生導師