表面拉曼增強效應(yīng)在生物醫(yī)藥檢測中的應(yīng)用

韓 冬，胡 琴（.南京醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南京20029；2.南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南京266）

·綜述·

表面拉曼增強效應(yīng)在生物醫(yī)藥檢測中的應(yīng)用

韓 冬1，胡 琴2＊（1.南京醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南京210029；2.南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南京211166）

目的 綜述近年來的表面拉曼增強光譜在生物樣品和藥物檢測方面的應(yīng)用成果和研究進展。方法 大量搜集最近幾年國內(nèi)外關(guān)于表面拉曼研究和應(yīng)用的相關(guān)文獻(xiàn)報道，尤其是有關(guān)生物醫(yī)藥方面的檢測，從中歸納出表面拉曼的研究應(yīng)用的現(xiàn)況并對其前景做出推斷。結(jié)果 表面拉曼增強光譜已成為分子領(lǐng)域檢測技術(shù)的研究熱點，在生物樣品的檢測方面，對蛋白質(zhì)、核酸、藥物等都具有很好的應(yīng)用潛力；在實際應(yīng)用的過程中，檢測技術(shù)和理論在不斷進步，應(yīng)用的方向一直在適應(yīng)人類生理和社會的需要。結(jié)論 表面拉曼增強光譜由于其獨特的優(yōu)勢，目前在生物醫(yī)藥檢測中的運用越來越廣泛，并顯示出良好的研究和應(yīng)用前景。

表面拉曼增強光譜；生物樣品；藥品；檢測應(yīng)用

一束單色光入射到試樣后有3個可能去向：一部分光透射；一部分光被吸收；還有一部分光則被散射。散射光中的大部分波長與入射光相同，這種散射稱為瑞利散射（Rayleigh scattering）；而一小部分波長由于試樣中分子振動和分子轉(zhuǎn)動的作用而發(fā)生偏移，這種波長發(fā)生偏移的散射，就是拉曼散射，也稱為拉曼光譜（Raman spectra）。拉曼光譜技術(shù)具有快速、無損等特點，已成功應(yīng)用于生命科學(xué)、生化材料以及藥物的檢測和分析中［1－4］，可以在分子水平分析生物組織、細(xì)胞的物質(zhì)組成及含量變化。然而，普通拉曼散射由于固有的截面小的特點導(dǎo)致其靈敏度較低，尤其是對于生物分子。這就需要更強的激光或者更長的圖譜采集時間，反而會損壞生物樣品。另外，普通拉曼散射常常疊加在很強的熒光背景上，使拉曼信號被遮蓋，導(dǎo)致分辨率較低［5］。

1974年，表面增強拉曼光譜（Surface－enhance Raman scattering，SERS）第一次被報道，F(xiàn)leischman等發(fā)現(xiàn)了吸附在被電化學(xué)腐蝕的銀電極上的嘧啶的表面增強拉曼光譜［6］。1977年，Van Duyne和Creighton等通過系統(tǒng)地理論和實驗研究，證明當(dāng)一些分子被吸附到某些粗糙的金屬（如銀、銅、金等）表面上時，它們的拉曼散射強度會極大地增強。后來科學(xué)界把這一現(xiàn)象命名為表面增強拉曼散射效應(yīng)，簡稱SERS［7－8］。SERS可使信號增強106～1014倍，具有極高的探測靈敏度和分辨率，可實現(xiàn)單分子檢測，目前已被廣泛應(yīng)用于人體組織、細(xì)胞、血液的檢測分析研究中，國內(nèi)外相關(guān)課題組在這些領(lǐng)域都開展了有意義的研究［9］。

1 SERS在生物樣品檢測中的應(yīng)用

1.1 蛋白質(zhì)檢測 研究較早的蛋白質(zhì)主要是那些有色的蛋白質(zhì)，有臨床意義的主要包括兒茶酚胺、神經(jīng)遞質(zhì)、血紅蛋白、黃素、視網(wǎng)膜色素、膽色素和晶狀體提取物［10］。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，目前對蛋白質(zhì)的SERS技術(shù)實現(xiàn)了多種技術(shù)的綜合，對某些特異蛋白質(zhì)尤其是熱點蛋白質(zhì)的檢測技術(shù)實現(xiàn)了長足的發(fā)展。例如，利用主成分分析（PCA）方法比較皮疹患者和健康人血清拉曼信號的差異，發(fā)現(xiàn)皮疹患者血清中蛋白質(zhì)的有序結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，糖蛋白、糖質(zhì)含量減少，這一發(fā)現(xiàn)可以準(zhǔn)確區(qū)別皮疹患者血清和健康人血清［11］；利用以靜電效應(yīng)改變?yōu)榛A(chǔ)的SERS，可以實現(xiàn)對血凝素的可靠、可再生、快速方便的檢測［12］；設(shè)計一個3D分層血漿納米結(jié)構(gòu)可實現(xiàn)SERS對蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物的敏感檢測，利用這一技術(shù)已能成功檢測乳腺癌患者血漿的血管內(nèi)皮生長因子含量［13］；基于鍍銀聚苯乙烯探珠用SERS可以探究大腸桿菌的FtsZ蛋白，F(xiàn)tsZ蛋白是一種重要的細(xì)菌分裂物質(zhì)［14］。

免疫測定是一種特殊的蛋白質(zhì)檢測方法，是一種通過特異抗體靶向定位抗原的測量方法。目前，大多數(shù)腫瘤學(xué)研究都集中精力于以SERS為基礎(chǔ)的免疫測定法，這種方法正是基于抗原－抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)［5］。例如，研究已經(jīng)證實胰腺癌細(xì)胞會異常表達(dá)黏液蛋白MUC4，血清MUC4水平可作為胰腺癌的標(biāo)志物，使用傳統(tǒng)方法如ELISA和RIA都難以檢測，Gufeng Wang等研究表明，用SERS技術(shù)成功檢測癌癥患者血清中MUC4［15］；Gang Chen等配制了癌胚抗原（CEA）的SERS探針，用于患者血清CEA的定量測量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌患者血清中出現(xiàn)高敏感、特異的CEA探測區(qū)，這種方法很有可能作為一種新的方法分析血液中的腫瘤標(biāo)記物［16］；Ping Wu等構(gòu)建了配體－Ag－Au探針檢測人類乳腺癌細(xì)胞（MCF－7），并可分辨MCF－10A細(xì)胞和其他類型腫瘤細(xì)胞（如HepG2細(xì)胞），他們認(rèn)為這一技術(shù)可用于癌癥的早期診斷［17］；Christina M.MacLaughlin等改進了原來的技術(shù)，所用探針可標(biāo)記早期慢性白血病和淋巴瘤病人的惡性淋巴細(xì)胞，創(chuàng)造了一種基于SERS探針標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)［18］。

通過對某些疾病特定蛋白質(zhì)的SERS檢測，既能實現(xiàn)疾病的診斷，又能幫助揭示疾病發(fā)生的分子機制，SERS因其快速、敏感、無創(chuàng)等特點，將來必會發(fā)揮更大的作用。

1.2 DNA檢測 基因作為一類十分重要的生物大分子，是遺傳信息的載體，對人們從分子水平上了解生命現(xiàn)象的本質(zhì)起到了重要作用。通過對血液、體液或細(xì)胞內(nèi)基因的檢測，人們可以找到許多治療和預(yù)防疾?。ㄈ绨┌Y、糖尿病和心臟病等）的新方法。根據(jù)是否有探針特異性標(biāo)記可分為免標(biāo)記檢測和標(biāo)記檢測，前者通過DNA－銀納米粒子的混合物拉曼信號，可獲得DNA的堿基、磷酸鹽骨架及DNA構(gòu)造等信息；后者通常是先把拉曼活性物分子與寡核苷酸鏈結(jié)合形成拉曼檢測探針，然后利用此探針與目標(biāo)鏈雜交，將信號分子轉(zhuǎn)移到金屬基底表面上，從而產(chǎn)生表面增強拉曼信號［19］。

Justin L.Abell等發(fā)明了一種再生性較高的SERS底物用于定量測量雜交前后的核酸堿基A、C、G和T／U，使用的微小RNA序列可用于臨床檢測［20］。Aoune Barhoumi等用實驗證明，SERS可用于DNA堿基修飾（例如腺嘌呤的甲基化、胞嘧啶的甲基化或羥甲基化、鳥嘌呤的氧化等）的檢測和評估，可能成為一種重要的臨床診斷方式［21］。Ming Li等用銀結(jié)合到金納米陣列，增強了表面等離子共振，使SERS能夠在優(yōu)勢對數(shù)評分（LOD）等于50的水平完成對乙型肝炎病毒DNA單個堿基突變的檢測［22］。代劍華等通過測試并分析胃黏膜正常上皮細(xì)胞、高、中、低和未分化胃癌細(xì)胞基因組DNA的表面增強拉曼光譜，發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞與癌細(xì)胞基因組DNA的譜圖在拉曼譜峰數(shù)量、頻移等方面表現(xiàn)出了特征性差異［23］。Sajanlal R.Panikkanvalappil等利用癌細(xì)胞DNA的拉曼標(biāo)記物可區(qū)分癌細(xì)胞和正常細(xì)胞，提供的DNA修飾信息可應(yīng)用于癌癥診斷［24］。

SERS技術(shù)不僅能提供獨特的分子振動信息，而且具有單分子水平的檢測靈敏度，有望成為一種基因分析的理想工具?？梢灶A(yù)見，最新發(fā)展的可應(yīng)用于基因分析的SERS技術(shù)必將在各種疾病和癌癥的早期診斷中發(fā)揮越來越重要的作用。

1.3 細(xì)胞檢測 細(xì)胞是生命活動的基本單位，細(xì)胞之間的信號傳導(dǎo)是實現(xiàn)各種生命功能的基礎(chǔ)，而疾病的發(fā)生發(fā)展也與細(xì)胞表面成分改變、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞的增殖分化等密切相關(guān)，越來越多的工作傾向于從單細(xì)胞、單分子水平上探究生命問題。目前，對單細(xì)胞研究的技術(shù)主要包括熒光光譜技術(shù)、掃描探針顯微技術(shù)、微流控技術(shù)、毛細(xì)管電泳技術(shù)等，但大多數(shù)技術(shù)存在侵入性，會對細(xì)胞產(chǎn)生破壞，并且無法從分子水平上獲得細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的具體信息。SERS由于其獨特的優(yōu)越性，在細(xì)胞體系中也得到了應(yīng)用。

基本方法分為：直接方法和間接方法。直接檢測主要是將待測的生物樣品（如蛋白、DNA、細(xì)胞等）直接作用于SERS活性基底，獲得該生物樣品自身的分子振動信息。間接檢測通常是將具有明確譜峰并且拉曼信號很強的分子（這類分子一般具有很大的π共軛體系，或在所采用的激發(fā)光波長處具有共振增強效應(yīng)）標(biāo)記在具有SERS效應(yīng)的納米粒子上，然后在SERS標(biāo)記的納米粒子上修飾具有特異識別能力的生物分子（如抗體、DNA、適配子等），進而將SERS（SERRS）標(biāo)記的納米粒子靶向到細(xì)胞特定的位點。

近年來SERS（SERRS）光譜技術(shù)在生命醫(yī)學(xué)中得到越來越廣泛的應(yīng)用，也逐漸由基礎(chǔ)研究走向?qū)嶋H應(yīng)用，并實現(xiàn)了基于SERS的流式細(xì)胞術(shù)、膠體Au免疫檢測等，展現(xiàn)出該學(xué)科發(fā)展的潛力［25］。

1.4 其他生物樣品的檢測 SERS在蛋白質(zhì)、抗原、DNA、基因、細(xì)胞、藥物等生物樣品檢測研究方面取得了進展，在一些特殊的生物樣品檢測方面也出現(xiàn)了新的應(yīng)用。

2011年，He等建立了一種通過免疫磁珠分離技術(shù)和SERS技術(shù)對復(fù)雜基質(zhì)（如牛奶等）中的蓖麻毒素進行快速檢測的方法［26］，與其他的方法如免疫技術(shù)、紫外分光光度法、紅外分光光度法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法、質(zhì)譜法等相比，有快速、方便等優(yōu)勢［27］。2012年，Ming Li等利用一種基于SERS的簡單而超靈敏、高選擇性的生物感應(yīng)元件，完成了對三磷酸腺苷（ATP）的定量測量［28］；2012年，Ansoon Kim等使用一種便攜的SERS原理的感應(yīng)系統(tǒng)，實現(xiàn)了對牛奶中三聚氰胺含量簡單而快速的測量［29］；2012年，Zhu等建立了一種全新、快速、超靈敏的對微囊藻毒素LR的SERS免疫檢測方法［30］。

SERS適用的研究必會越來越廣泛，它所影響的領(lǐng)域必會越來越廣。

2 SERS在藥品檢測中的應(yīng)用

利用SERS來檢測藥品，一直是重要的研究領(lǐng)域。在20世紀(jì)，已有人利用表面增強拉曼光譜技術(shù)進行藥物與DNA化合物拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的相關(guān)性［31］等方面的研究。

近年來，隨著SERS技術(shù)的不斷改進，人們實現(xiàn)了對血液、唾液、尿液等樣本中藥物特異性更強、靈敏度更高的檢測。例如，以微波處理金聚苯乙烯薄膜作為SERS基底測定血漿中抗癌物質(zhì)紫杉醇，SERS圖譜獲得只需要10s，血漿濃度測量值范圍為1×10－8～1×10－7mol·L－1，誤差范圍0～3.8×10－9mol·L－1［32］；一種檢測治療帕金森病的藥物脫水嗎啡的方法，只要滴一滴包含脫水嗎啡的血漿在含銀膠的二氧化硅薄層色譜（TLC）基底上，在幾分鐘內(nèi)就能完成，實現(xiàn)迅速、微創(chuàng)的分子水平檢測，但該種方法的靈敏度還需要進一步研究，需從10－4提高到治療水準(zhǔn)10－7～10－8［33］；還有報道檢測唾液中的藥物含量，如5－氟尿嘧啶，50μg·mL－1可輕松檢測出，估計最低檢測質(zhì)量濃度可達(dá)2μg·mL－1，整個過程需要時間低于5min［34］。

得益于檢測特異性和靈敏度的提高，SERS在藥物的研究與開發(fā)方面，在藥物的檢測方面，以及在藥物的濃度監(jiān)測與使用方面，都展現(xiàn)出了特殊的應(yīng)用潛力。

在藥物的研發(fā)與研究方面，SERS作為一種實驗手段，正發(fā)揮著不可替代的作用。2012年，Igor Chourpa等利用SERS研究了抗癌藥物5－碘尿嘧啶藥物劑型與生物過程之間的關(guān)系，對藥物生產(chǎn)方式的改進有一定指導(dǎo)意義［35］。同年，Jing Yang等利用SERS實現(xiàn)了第1次對2種藥物（6－巰基嘌呤和甲硫咪唑）在活細(xì)胞中擴散和代謝的同時監(jiān)測［36］。2013年，Shenfei Zong等使用一種在SERS下可追蹤的納米載體，研究了細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)環(huán)境中的藥物轉(zhuǎn)運，他們認(rèn)為這種載體可以提高癌癥化療的有效性［37］。在未來，SERS將為藥物研發(fā)和研究提供一種更加方便、快捷、可靠的手段。

在藥物的檢測方面，利用SERS已可以判斷出多種藥物在特定介質(zhì)中的存在情況。2012年，Li Zhaifu等利用SERS成功設(shè)計出快速檢測豬尿中β－agonist（一種興奮劑）的方法，這種方法如果能運用于人，在某些場合例如運動比賽或許可以發(fā)揮一定的作用［38］。2013年，Chrysafis Andreou等利用SERS和微流控技術(shù)快速測定人唾液中的甲基苯丙胺（冰毒），此種方法在毒品檢控方面有一定的應(yīng)用潛力［39］。SERS作為一種新的檢測手段，由于其獨特的優(yōu)勢，將來或許可以替代一些傳統(tǒng)的檢測方式。

在藥物的濃度監(jiān)測和使用方面，SERS也展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。SERS有可能更多的用于指導(dǎo)臨床、治療疾病，為人類的健康事業(yè)貢獻(xiàn)力量。2010年，Clement Yuen等應(yīng)用一種特殊的SERS底物可以針對血漿中抗癌藥物進行迅速而準(zhǔn)確的監(jiān)測，為癌癥化療提供隨時的治療指導(dǎo)［32］。2011年，Anne M?rz等使用芯片實驗－SERS（LOC－SERS），分析裂解紅細(xì)胞硫代嘌呤S－甲基轉(zhuǎn)移酶（TPMT）的酶活性，這樣在使用6－巰基嘌呤前確定TPMT活性，就可以為每一位患者選擇合適的劑量并可防止嚴(yán)重毒性反應(yīng)的發(fā)生［40］。2012年，Murat Kaya和Mürvet Volkan發(fā)明了一種新方法測定多巴胺，這種方法具有高敏感性和高特異性，對帕金森病的診斷和治療有一定的研究意義［41］。誠然，SERS用于臨床的潛力，還需要科研工作者和臨床醫(yī)生的進一步挖掘和實踐。

在其他方面，SERS也表現(xiàn)出了一些特殊的作用。例如，有人研究獲得了30個品種拉曼光譜圖譜，圖譜清晰，特征峰強，重復(fù)性好，該法得到的注射液拉曼光譜圖譜可建立一個注射液對照圖譜庫，可在藥品快檢車快速鑒別注射液真?zhèn)畏矫嫱茝V應(yīng)用［42］。在中藥方面，已有人利用SERS分析了黃芪的拉曼光譜［43］，相比高效液相色譜指紋圖譜［44］等方法有其獨特的優(yōu)勢，以后可為黃芪或其他中藥飲片生化檢測分析、質(zhì)量監(jiān)控和鑒別提供一種更加新穎、快速、有效的檢測新方法。

應(yīng)用SERS對藥物進行檢測，正在向更快、更精確、更靈敏的方向發(fā)展，SERS在藥物的研究研發(fā)、檢測監(jiān)測和使用等方面將產(chǎn)生越來越多元化的影響。

3 SERS的應(yīng)用前景

SERS作為一種高靈敏、無損傷、可進行指紋分析的圖譜技術(shù)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)嶄露頭角，正在發(fā)揮其特有的優(yōu)勢和作用。利用SERS檢測疾病過程的某些物質(zhì)的特異改變，可用于疾病的預(yù)防和診斷；利用SERS進行定量和動態(tài)研究，可以用于探究疾病發(fā)生的機制；利用SERS檢測疾病后的某些指標(biāo)，可以評價預(yù)后和恢復(fù)；利用SERS檢測藥物含量和分布情況，可以研究藥物的代謝或調(diào)整藥物使用；等等。

為了適應(yīng)更多的研究和應(yīng)用，SERS技術(shù)本身也在完善，例如光源、電極、基底等器材以及表面增強拉曼理論都在進步更新，促使SERS擁有更高的分辨率和靈敏度，已能夠達(dá)到實際應(yīng)用中的標(biāo)準(zhǔn)。同時，其越來越依賴于與其他技術(shù)方法共同使用解決一個問題，如同向電泳、主成分分析、薄層色譜、實驗芯片等，利用這些復(fù)雜的組合方法可達(dá)到一定的實驗?zāi)康?，完成對某些特殊物質(zhì)的成功檢測。

總之，SERS的應(yīng)用依賴于儀器的進步、化學(xué)測量技術(shù)的發(fā)展以及對各種實驗方法和實驗成果的綜合。隨著技術(shù)的進步和發(fā)展，表面增強拉曼效應(yīng)在生物醫(yī)藥檢測應(yīng)用方面必會發(fā)揮越來越重要的作用。

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Application of surface－enhanced Raman effect to biomedical detection

HAN Dong1，HU Qin2＊（1.The First Clinical Medical College，Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China；2.School of Pharmacy，Nanjing Medical University，Nanjing 211166，China）

Objective To summarize the progress and application of surface－enhanced Raman scattering（SERS）in the detection of biological and pharmaceutical samples.Methods Documents or reports related to applying SERS to the detection of biological and pharmaceutical samples were reviewed and compared.Results SERS has become a detection technique in biomolecule field，which shows great potentiality to detect proteins，nucleic acids，drugs and so on.During the process of its application，the technology and theory of SERS are being improved to meet the humans′and social demands at the same time.Conclusion In recent years，the latest progress in research and application of SERS to the detection of biological and pharmaceutical samples has been made and its good prospects have been exhibited because of its unique advantages.

surface－enhanced Raman scattering；biological samples；drugs；detection application

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.01.030

R917

1004－2407（2015）01－0100－05

2014－06－26）

國家自然科學(xué)基金資助項目（編號：81173016）

韓冬，男，本碩連讀在讀生

＊通信作者：胡琴，女，教授，博士生導(dǎo)師