高良姜素對H2O2誘導(dǎo)A375細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

彭曉明，霍仕霞，高 莉，甘 萍，何 燕，閆 明＊（.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)實(shí)驗室，烏魯木齊 830049；.石河子大學(xué)藥學(xué)院，石河子 83003）

高良姜素對H2O2誘導(dǎo)A375細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

彭曉明1，霍仕霞1，高 莉1，甘 萍2，何 燕2，閆 明1＊（1.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)實(shí)驗室，烏魯木齊 830049；2.石河子大學(xué)藥學(xué)院，石河子 832003）

目的 探討高良姜素對人A375黑素瘤細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。方法 以700μmol·L－1的H2O2處理人A375黑素瘤細(xì)胞，建立氧化損傷模型，并以1，5和10μg·mL－1的高良姜素拮抗其作用。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；采用MTT比色法檢測細(xì)胞存活率；并檢測各組細(xì)胞上清液中丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（T－AOC）、過氧化氫酶（CAT）、一氧化氮合酶（NOS）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－PX）。結(jié)果 高良姜素能明顯改善H2O2損傷后的A375細(xì)胞形態(tài)，顯著提高人A375黑素瘤細(xì)胞的存活率。與模型組相比，高良姜素給藥后均能提高A375細(xì)胞T－AOC、CAT、SOD和GSH－Px活力（P＜0.05），而MDA和NOS明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論 高良姜素對H2O2誘導(dǎo)的A375細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用。

高良姜素；H2O2；人A375黑素瘤細(xì)胞；氧化損傷

白癜風(fēng)是臨床常見的色素脫失性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚無定論，主要包括自體細(xì)胞毒素學(xué)說、免疫學(xué)說、神經(jīng)學(xué)說與遺傳學(xué)說。近年來，白癜風(fēng)的氧化應(yīng)激學(xué)說越來越受到關(guān)注［1－3］。氧化應(yīng)激是由于白癜風(fēng)患者的氧化與抗氧化機(jī)制失衡，導(dǎo)致局部微環(huán)境中聚集大量活性自由基，可直接或間接地催化產(chǎn)生一系列的活性氧化產(chǎn)物（包括超氧陰離子、H2O2、羥自由基），在局部蓄積使黑素細(xì)胞破壞或?qū)е潞谒厣烧系K。

高良姜素（galangin）是一種天然的黃酮類化合物，主要提取自中藥材高良姜的根莖［4］。已有文獻(xiàn)報道［5－6］，高良姜素具有抗氧化能力，本研究以H2O2誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)人黑素瘤細(xì)胞A375為研究對象，觀察不同質(zhì)量濃度的高良姜素對A375細(xì)胞的氧化損傷保護(hù)作用，為高良姜素在制備通過氧化應(yīng)激治療白癜風(fēng)藥物中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 超凈工作臺（SW－CJ－1F，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；倒置顯微鏡（37XB，上海光學(xué)儀器六廠）；CO2培養(yǎng)箱（MCO－18AIC，日本三洋公司）；全波長酶標(biāo)儀（Multiskan Go 1510，美國Thermo Fisher公司）。

1.2 試藥 高良姜素（批號20110921，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.9%）購自上海永恒生物有限公司。雙氧水（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H2O2），分析純，購于天津市福晨化學(xué)試劑廠；達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基（DMEM）購自Gibco公司；胎牛血清為Hyclone產(chǎn)品；氨芐青霉素鈉和硫酸鏈霉素購自Amersco公司；維生素E（VE）和HEPES購自上海源葉生物科技有限公司；碳酸氫鈉（NaHCO3）購自于天津市福晨化學(xué)試劑廠。超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（批號20130717）、微量丙二醛（MDA）測定試劑盒（批號20130711）、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒（批號20130628）、總抗氧化能力（T－AOC）測定試劑盒（批號20130628）、一氧化氮合酶（NOS）測定試劑盒（批號20130717）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－Px）測定試劑盒（批號20130723），均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 細(xì)胞株 人A375黑素瘤細(xì)胞系購自于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人A375黑素瘤細(xì)胞以1×106個·mL－1接種于含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、3.7g·L－1NaHCO3、2.5g·L－1HEPES、100u·mL－1青霉素和100u·mL－1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2d換1次液。

2.2 細(xì)胞損傷模型的建立 當(dāng)培養(yǎng)瓶中A375細(xì)胞融合率達(dá)到80%左右時，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%胰酶消化細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至3×105個·mL－1，200μL／孔鋪至96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)24h后吸棄培養(yǎng)基，分別加入400，500，600，700和800μmol·L－1的H2O2作用24h。然后于每孔加入5mg·mL－1的MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄培養(yǎng)液，加入DMSO 200μL充分震蕩溶解后，于全波長Multiskan Go 1510酶標(biāo)儀測定490nm處吸光度（A）值，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率＝A給藥／A正?！?00%，正常組細(xì)胞存活率記作100%。篩選細(xì)胞存活率在50%～80%之間的H2O2濃度作為最佳誘導(dǎo)濃度。

2.3 細(xì)胞給藥及細(xì)胞存活率測定 A375細(xì)胞培養(yǎng)48h后分組給藥，將細(xì)胞分為6組：正常對照；H2O2模型組；維生素E（20μg·mL－1）陽性藥組、高良姜素低（1μg·mL－1）、中（5μg·mL－1）、高（10μg·mL－1）劑量組；模型組和給藥組先用700μmol·L－1H2O2作用24h，棄去原培養(yǎng)液，正常組與模型組加入不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，陽性藥組加入含20μg·mL－1維生素E，高良姜素低、中、高劑量分別加入含1，5和10μg·mL－1的新鮮培養(yǎng)基，孵育24h，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。按照2.2項下方法測定490nm處吸光度（A）值，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率＝A給藥／A正?！?00%，正常組細(xì)胞存活率記作100%。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)液中生化指標(biāo)測定 細(xì)胞分組及給藥方法同上，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照購買試劑盒說明書描述的方法，測定各組細(xì)胞上清中MDA含量、T－AOC抗氧化能力及CAT、NOS、SOD和GSH－Px活性。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用統(tǒng)計學(xué)分析軟件SPSS17.0處理，所有數(shù)據(jù)均采用x±s表示，應(yīng)用t檢驗進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示差異極顯著。

3 結(jié)果

3.1 H2O2誘導(dǎo)A375氧化損傷的濃度篩選 如表1所示，采用700μmol·L－1的H2O2孵育24h可使人A375黑素瘤細(xì)胞的存活率降至58.43%，故確定該濃度為氧化損傷最佳誘導(dǎo)濃度。

表1 不同濃度H2O2損傷人A375黑素瘤細(xì)胞存活率的影響Tab.1 The effect of H2O2on A375cell survival rate

3.2 高良姜素對H2O2誘導(dǎo)的A375細(xì)胞形態(tài)的影響 見圖1。由圖1可知，正常A375細(xì)胞輪廓層次較分明，細(xì)胞膜光滑完整，有光澤，細(xì)胞胞體較大，細(xì)胞數(shù)量也較多，細(xì)胞形態(tài)主要以梭形為主、雙極或三級貼壁生長，可與周圍細(xì)胞融合，呈片狀，形成單細(xì)胞層；H2O2模型組的細(xì)胞輪廓層次較差，樹突縮短或消失，貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，胞體皺縮，且部分細(xì)胞呈圓形，懸浮于培養(yǎng)液中。給予陽性藥VE及高良姜素低、中、高各劑量組，其相對于模型組而言，A375細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞突起增多并交織呈網(wǎng)狀，胞體皺縮現(xiàn)象明顯改善。提示高良姜素對H2O2損傷人A375黑素瘤細(xì)胞具有保護(hù)作用。

圖1 高良姜素對H2O2誘導(dǎo)人A375黑素瘤細(xì)胞損傷保護(hù)的細(xì)胞形態(tài)局部圖（×200）1.正常組；2.模型組；3.VE（20μg·mL－1）；4.高良姜素（1μg·mL－1）；5.高良姜素（5μg·mL－1）；6.高良姜素（10μg·mL－1）Fig.1 The effect of galangin on A375morphology induced by H2O2（×200）1.normal group；2.model group；3.VE（20μg·mL－1）；4.galangin（1μg·mL－1）；5.galangin（5μg·mL－1）；6.galangin（10μg·mL－1）

3.3 高良姜素對H2O2誘導(dǎo)的A375細(xì)胞存活率的影響 如表2所示，MTT檢測發(fā)現(xiàn)氧化損傷后的A375細(xì)胞經(jīng)高良姜素（1，5和10μg·mL－1）作用24h后，其細(xì)胞存活率由66.67%提高至91.43%，105.24%和114.66%。

表2 不同濃度高良姜素對H2O2損傷人A375黑素瘤細(xì)胞存活率的影響Tab.2 The effect of galangin on cell survival rate of A375induced by H2O2 ±s，n＝8）

表2 不同濃度高良姜素對H2O2損傷人A375黑素瘤細(xì)胞存活率的影響Tab.2 The effect of galangin on cell survival rate of A375induced by H2O2 ±s，n＝8）

注：與正常組比較＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 濃度／μmol·L－1 A490 存活率／% 114.66 0.39±0.08 100模型組 0.26±0.02＃＃ 66.67 VE 20 0.35±0.01＊ 88.38高良姜素 1 0.36±0.03＊＊ 91.43高良姜素 5 0.41±0.03＊＊ 105.24高良姜素 10 0.45±0.04＊＊正常組

3.4 高良姜素對H2O2損傷人A375黑素瘤細(xì)胞氧化指標(biāo)的影響 見表3。由表3可知，A375細(xì)胞經(jīng)H2O2誘導(dǎo)24h后，與正常組比較，其細(xì)胞上清液中MDA含量、NOS活性升高，T－AOC、CAT、SOD和GSH－Px等酶活性則出現(xiàn)不同程度的降低。而經(jīng)高良姜素（1，5和10μg·mL－1）處理24h后，與模型組比較，除低劑量組（1μg·mL－1）外，細(xì)胞MDA和NOS均顯著降低（P＜0.05），而T－AOC、CAT、SOD和GSH－Px等酶活性則明顯升高（P＜0.05）。

表3 高良姜素對H2O2誘導(dǎo)的A375細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA、T－AOC、CAT、NOS、SOD和GSH－Px的影響Tab.3 The effect of galangin on MDA，T－AOC，CAT，NOS，SOD and GSH－Pxin A375induced by H2O2 （±s，n＝8）

表3 高良姜素對H2O2誘導(dǎo)的A375細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA、T－AOC、CAT、NOS、SOD和GSH－Px的影響Tab.3 The effect of galangin on MDA，T－AOC，CAT，NOS，SOD and GSH－Pxin A375induced by H2O2 （±s，n＝8）

注：與正常組比較＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與模型組比較＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 劑量／μg·mL－1MDA／nmol·mL－1T－AOC／mmol·mL－1CAT／U·mL－1NOS／U·mL－1SOD／U·mL－1GSH－Px／U·mL－198±0.69 53.77±4.01模型組 0.61±0.02＃＃ 1.21±0.03＃＃ 0.23±0.01＃＃ 2.24±0.08＃ 10.04±0.02＃＃ 28.81±8.96＃VE 20 0.49±0.01＊ 1.60±0.01＊ 0.58±0.01＊＊ 1.21±0.02＊ 17.79±0.54＊＊ 44.62±6.32＊高良姜素 1 0.57±0.04 1.23±0.01 0.23±0.02 1.98±0.04 10.45±0.09 30.61±9.11高良姜素 5 0.47±0.01＊＊ 1.49±0.02＊＊ 0.25±0.02＊ 0.88±0.04＊＊ 12.36±0.74＊＊ 35.49±4.17＊高良姜素 10 0.41±0.02＊＊ 1.62±0.03＊＊ 0.73±0.01＊＊ 0.90±0.02＊＊ 19.42±0.51＊＊ 50.77±3.22正常組 0.33±0.01 2.15±0.01 3.21±0.04 1.05±0.01 13.＊＊

4 討論

白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制至今仍未明確，但越來越多的證據(jù)表明［7－9］，白癜風(fēng)患者體內(nèi)存在氧化應(yīng)激現(xiàn)象。正常生理狀態(tài)下，表皮氧化與抗氧化系統(tǒng)處于動態(tài)平衡狀態(tài)。人體在代謝過程中會不斷產(chǎn)生活性氧簇ROS（O2－、H2O2、OH－等）與機(jī)體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)（SOD、GSH－Px、CAT等）處于平衡狀態(tài)。但當(dāng)機(jī)體受到外來藥物或刺激時所產(chǎn)生的ROS量超出機(jī)體自身清除量時，這種平衡即被打破，進(jìn)而發(fā)生氧化應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。Schallreuter等［9］在進(jìn)展期白癜風(fēng)患者表皮檢測到高濃度H2O2聚集。谷梅等［10］研究發(fā)現(xiàn)，正常人表皮黑素細(xì)胞經(jīng)一定濃度H2O2處理后，使得酪氨酸酶活性降低，黑素合成減少，丙二醛含量增多，提示H2O2在白癜風(fēng)發(fā)病中可能起到一定的作用。

白癜風(fēng)的基本病理改變是表皮黑素細(xì)胞部分或完全缺失，同時伴有外周血及皮損區(qū)的生化指標(biāo)改變。Jalel等［11］研究表明，白癜風(fēng)小鼠外周血中MDA水平顯著高于對照組，而CAT、SOD、GSH－Px活性低于對照組，進(jìn)一步從動物實(shí)驗水平揭示了白癜風(fēng)與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。此外，白癜風(fēng)患者表皮中誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（iNOS）活性增加［1］，進(jìn)而引起NO含量增加。NO可影響黑素細(xì)胞與細(xì)胞外機(jī)制的粘附，抑制黑素細(xì)胞增殖，高濃度的NO能導(dǎo)致黑素細(xì)胞死亡。H2O2是一種重要的活性氧，極易通過細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)通過Fenton反應(yīng)形成高活性的自由基，進(jìn)一步造成細(xì)胞損傷［12］。本研究利用700μmol·L－1的H2O2誘導(dǎo)A375細(xì)胞24h，與正常組細(xì)胞相比，其細(xì)胞存活率降至66.67%，表明氧化損傷模型成功建立。經(jīng)不同質(zhì)量濃度高良姜素（1，5和10μg·mL－1）作用后，A375細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞存活率明顯改善。與模型組比較，除低劑量組（1μg·mL－1）外，其余各給藥組細(xì)胞MDA和NOS均顯著降低（P＜0.05），而T－AOC、CAT、SOD和GSH－Px等酶活性則明顯升高（P＜0.05）。研究結(jié)果表明，高良姜素在5～10μg·mL－1范圍內(nèi)，對H2O2誘導(dǎo)A375細(xì)胞具有顯著保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與其激活抗氧化防御系統(tǒng)、抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧簇的生成有關(guān)。

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Protective effects of galangin on oxidative damage of A375induced by H2O2

PENG Xiaoming1，HUO Shixia1，GAO Li1，GAN Ping2，HE Yan2，YAN Ming1＊（1.Institute of Xinjiang Traditional Uyghur Medicine，Prescription Laboratory of Xinjiang Traditional Uyghur Medicine，Urumqi 830049，China；2.Pharmaceutical College of Shihezi University，Shihezi 832003，China）

Objective To investigate the protective effect of galangin on oxidative damage of A375induced by H2O2.Methods A375 oxidative damage cellular model was established by 700μmol·L－1H2O2treatment.And the damage effect was antagonized by different concentration（1，5and 10μg·mL－1）galangin.The cell morphology was observed by inverted microscope，the cell survival was determinated by MTT，and the changes of MDA，T－AOC，CAT，NOS，SOD and GSH－Pxwere measured.Results The galangin could significantly improve the cell morphology and the cell survival.Compared with the model group，galangin could significantly increase the activity of T－AOC，CAT，SOD and GSH－Px（P＜0.05），and the production of MDA and NOS was inhibited obviously（P＜0.05）.Conclusion The galangin has significant protective effect on the A375oxidative damage cellular model induced by H2O2.

galangin；H2O2；A375；oxidative damage

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.01.014

R965

A

1004－2407（2015）01－0051－04

2014－06－20）

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（編號：2013211B65）

彭曉明，男，碩士

＊通信作者：閆明，男，研究員