新疆核桃分心木總皂苷的提取純化工藝研究

朱青梅，令狐晨，阿依吐倫·斯馬義（新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011）

新疆核桃分心木總皂苷的提取純化工藝研究

朱青梅，令狐晨，阿依吐倫·斯馬義＊（新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011）

目的 優(yōu)選核桃分心木總皂苷的最佳提取純化工藝。方法 以齊墩果酸為對(duì)照品，利用紫外可見分光光度法測(cè)定核桃分心木中的總皂苷含量；利用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、料液比和提取次數(shù)對(duì)核桃分心木總皂苷提取率的影響；利用大孔吸附樹脂對(duì)核桃分心木總皂苷進(jìn)行純化工藝研究。結(jié)果 最佳提取工藝為：加25倍量體積分?jǐn)?shù)80%乙醇，80℃回流提取2次，每次2h；最佳純化工藝為：采用D101大孔吸附樹脂，最大上樣量為180mL，水洗脫量8BV，洗脫劑體積分?jǐn)?shù)50%乙醇，洗脫體積7BV。結(jié)論 該法簡(jiǎn)易可行，效果較佳。

核桃分心木；總皂苷；提取工藝；大孔吸附樹脂；純化工藝

新疆核桃分心木（Diaphragma juglandis Fructus）為胡桃科植物胡桃果核的干燥木質(zhì)隔膜，俗稱核桃隔膜；體輕，多破碎成半圓形片狀或不規(guī)則片狀，氣微，味微澀［1］；維吾爾醫(yī)用于治療腎虛，其療效顯著［23］，也有用于治療遺精、滑精、遺尿、尿血、帶下、瀉痢等癥［4］?，F(xiàn)代研究表明，核桃隔膜具有抗氧化、抗菌、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用［5］。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于核桃屬植物及核桃楸各藥用部位的研究較多，

但對(duì)核桃分心木總皂苷類成分的研究，迄今國(guó)內(nèi)尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。作者采用了紫外可見分光光度法，以齊墩果酸為對(duì)照品，確定了核桃分心木總皂苷的最佳提取方法以及大孔吸附樹脂純化方法，從而為研究核桃分心木總皂苷的藥理作用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV2250型紫外可見分光光度計(jì)UV2250（日本島津）；EYELAN－1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；DK－S24型電熱恒溫水浴鍋、DHG－9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SK3200H型超聲清洗儀（上海漢克科學(xué)儀器有限公司）；ABl04－N型多功能電子天平（梅特勒－托利多儀器上海有限公司）；FW135型粉碎機(jī)（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；2HWY－2102C型恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器有限公司）。

1.2 試藥 齊墩果酸對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)YY20110428）；核桃分心木（購(gòu)于新疆和田地區(qū)，由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院帕麗達(dá)·阿布利孜教授鑒定為胡桃科植物胡桃果核的干燥木質(zhì)隔膜；D101型大孔吸附樹脂、X－5型大孔吸附樹脂和AB－8型大孔吸附樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；高氯酸、冰醋酸、甲醇等均為分析純?cè)噭?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 線性關(guān)系的考察

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取齊墩果酸對(duì)照品5.0mg，置于50mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得到質(zhì)量濃度為0.1mg·mL－1的對(duì)照品溶液，備用。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取齊墩果酸對(duì)照品溶液0.3，0.4，0.5，0.6，0.8，1.0和1.3mL，置于10mL具塞試管中，揮干甲醇，依次加入新配制的50g·L－1香草醛－冰醋酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，密封，搖勻，70℃水浴15min后，冰水浴中迅速冷卻，加入冰醋酸5mL，搖勻，靜置15min，待測(cè)。將對(duì)照品溶液在200～700nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在563nm處有較大吸收，故將563nm作為最佳吸收波長(zhǎng)。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，得到齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：A＝39.221C－0.026 4（r＝0.999 2），表明齊墩果酸質(zhì)量濃度在0.005 0～0.021 67g·L－1范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系［6］。

2.2 單因素考察

2.2.1 提取溫度 恒定料液比1∶20，提取1次，提取時(shí)間1h，提取溶劑乙醇，分別考察提取溫度40，50，60，70，80和85℃對(duì)總皂苷提取率的影響，結(jié)果總皂苷的提取率分別為1.05%，1.15%，1.44%，1.37%，1.57%和1.49%，故選擇80℃。

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù) 恒定料液比1∶20，提取1次，提取時(shí)間1h，提取溫度80℃，分別選取體積分?jǐn)?shù)為40%，50%，60%，70%，80%和95%的乙醇溶液進(jìn)行提取，結(jié)果總皂苷的提取率分別為0.68%，1.09%，1.10%，1.47%，2.05%和1.91%，故選擇80%的乙醇。

2.2.3 提取時(shí)間 恒定料液比1∶20，提取1次，提取溫度80℃，提取溶劑乙醇，分別考察提取0.5，1，1.5，2，2.5和3h對(duì)總皂苷提取率的影響，結(jié)果總皂苷的提取率分別為1.5%，1.58%，1.57%，1.79%，1.53%和1.45%，故每次提取2h。

2.2.4 固液比 恒定提取時(shí)間1h，提取1次，提取溫度80℃，提取溶劑乙醇，分別考察料液比1∶8，1∶10，1∶14，1∶18，1∶20，1∶25和1∶30對(duì)總皂苷提取率的影響，結(jié)果總皂苷的提取率分別為0.93%，1.12%，1.18%，1.53%，1.57%，1.65%和1.58%，故選擇固液比1∶25。

2.2.5 提取次數(shù) 恒定料液比1∶20，提取時(shí)間1h，提取溫度80℃，提取溶劑乙醇，分別考察提取1，2和3次對(duì)總皂苷提取率的影響，結(jié)果總皂苷的提取率分別為1.48%，1.92%和2.0%，故選擇提取3次。

2.3 正交實(shí)驗(yàn) 由單因素考察結(jié)果，選擇影響核桃分心木總皂苷提取的4個(gè)主要因素分別為乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、固液比和提取次數(shù)，以分心木總皂苷提取率為考察指標(biāo)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)。分別稱取核桃分心木粉末5.0g，按表1完成正交實(shí)驗(yàn)，均在溫度80℃下提取。各因素水平見表1，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Tab.1 Levels and factors of orthogonal test

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of orthogonal test

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析Tab.3 Variance analysis of orthogonal test

由表2分析可知，新疆核桃分心木的最佳提取工藝是A2B3C2D3，又由表3可知，4個(gè)因素的重要程度為：D＞A＞C＞B，即提取次數(shù)＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞固液比＞提取溫度，且D為主要影響因素，A為重要影響因素。由于提取2次和提取3次的總皂苷提取率相差不大，為節(jié)約試劑和縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，選擇提取2次。綜合考慮后選擇A2B3C2D2作為最佳提取工藝，即提取2次，每次2h，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，固液比為1∶25。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 稱取粉碎后的核桃分心木5.0g，平行3份。按照正交實(shí)驗(yàn)得到的最佳提取工藝進(jìn)行提取，即25倍量的80%乙醇提取2次，每次2h，分別測(cè)定總皂苷的提取率分別為2.67%，2.60%和2.69%，表明優(yōu)選的工藝條件穩(wěn)定可行。

2.5 核桃分心木總皂苷的純化［7］

2.5.1 預(yù)處理大孔吸附樹脂 分別取適量D101、AB－8和X－5型大孔吸附樹脂在乙醇中浸泡過(guò)夜，濕法裝柱后用乙醇沖洗至流出液與水混合（1∶5），不呈現(xiàn)白色渾濁為止，再用蒸餾水沖洗至流出液無(wú)醇味，備用。

2.5.2 制備樣品溶液 按正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到的最佳提取工藝提取新疆核桃分心木總皂苷，即取新疆核桃分心木粉末50.0g，加25倍量體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇提取2次，每次2h，將提取液濃縮至無(wú)醇味后，加蒸餾水溶解，過(guò)濾，濾液定容至1 000mL，即得樣品溶液（0.05g·mL－1）。

2.5.3 大孔吸附樹脂型號(hào)的篩選 靜態(tài)吸附分別精密稱定2.5.1項(xiàng)下備用的3種大孔吸附樹脂各1g，分別加入2.4.2項(xiàng)下制備好的樣品溶液30mL。封口后放于恒溫培養(yǎng)振蕩器中（25℃，100r·min－1），24h后取出抽濾。按照2.1.2項(xiàng)方法測(cè)定后計(jì)算總皂苷的質(zhì)量濃度。靜態(tài)吸附量＝［（初始質(zhì)量濃度－吸附后質(zhì)量濃度）×吸附液體積］／樹脂體積。結(jié)果計(jì)算得D101、AB－8和X－5型3種大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附量分別為26.93，26.98和26.24mg·g－1，靜態(tài)吸附率分別為84.60%，84.76%和82.44%。可知D101型大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附能力強(qiáng)于另外2種。

將靜態(tài)吸附項(xiàng)中抽濾后的大孔吸附樹脂分別轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，加入30mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇。封口放置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中（25℃，100r·min－1），24h后取出抽濾。按照2.1.2項(xiàng)方法測(cè)定并計(jì)算總皂苷的質(zhì)量濃度。解吸率＝（洗脫液質(zhì)量濃度×洗脫液體積）／靜態(tài)吸附量×100%。結(jié)果，D101、AB－8和X－5型3種大孔吸附樹脂的解吸率分別為99.04，96.89和90.12%?？芍狣101型大孔吸附樹脂的解吸率最高，綜合整個(gè)靜態(tài)實(shí)驗(yàn)，D101型大孔吸附樹脂吸附率和解吸率均最高，故選擇D101型大孔吸附樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)。

2.5.4 泄露曲線考察 準(zhǔn)確稱取處理好的D101型樹脂（相當(dāng)于干樹脂4g），濕法裝柱，取上樣液300mL，以流速1mL·min－1通過(guò)樹脂柱，每30mL接收一次流出液，并測(cè)定每份流出液中的總皂苷質(zhì)量濃度，以流份份數(shù)與流出液中總皂苷質(zhì)量濃度做圖，結(jié)果見圖1。在第6個(gè)流份開始泄漏，因此確定上樣量為180mL。

圖1 D101型大孔吸附樹脂吸附總皂苷的動(dòng)態(tài)曲線Fig.1 Dynamic adsorption curve of total saponins on D101 macroporous resin

2.5.5 水洗脫量考察 準(zhǔn)確稱取處理好的D101型樹脂（相當(dāng)于干樹脂4g），濕法裝柱，取上樣液180mL，以流速1mL·min－1通過(guò)樹脂柱，用蒸餾水沖洗，每個(gè)流分為1BV，分別進(jìn)行Molish反應(yīng)，觀察反應(yīng)的現(xiàn)象。結(jié)果蒸餾水平衡至8BV時(shí)，流出液變澄清，且Molish反應(yīng)呈陰性，故選擇用8BV蒸餾水沖洗樹脂柱。

2.5.6 洗脫溶劑體積分?jǐn)?shù)考察 準(zhǔn)確稱取處理好的D101型樹脂（相當(dāng)于干樹脂4g），濕法裝柱，取上樣液180mL，以流速1mL·min－1通過(guò)樹脂柱，用8BV蒸餾水平衡樹脂后依次用體積分?jǐn)?shù)10%，30%，50%和70%乙醇洗脫，洗脫至流出液變澄清，分別收集流出液，測(cè)定體積分?jǐn)?shù)10%，30%，50%和70%乙醇流出液分心木總皂苷含量分別為48.3，54.9，41.7和4.95mg，洗脫率分別為26.8，30.5，23.1和2.75%，體積分?jǐn)?shù)10%，30%和50%洗脫下來(lái)的核桃分心木總皂苷的總洗脫率為80.4%，故選擇體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇。

2.5.7 洗脫溶劑用量考察 準(zhǔn)確稱取處理好的D101型樹脂（相當(dāng)于干樹脂4g），濕法裝柱，取上樣液180mL，以流速1mL·min－1通過(guò)樹脂柱，用8BV蒸餾水平衡樹脂后用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇洗脫，每1BV柱體積收集1份，洗脫至流出液變澄清，確定洗脫溶劑用。第7份開始流出液變澄清，故洗脫劑用量為7BV。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)核桃分心木總皂苷的提取工藝進(jìn)行了研究，采用乙醇回流法提取新疆核桃粉心木，并利用紫外可見光分光光度法在563nm處測(cè)定核桃分心木總皂苷的含量，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定了各因素對(duì)總皂苷提取率影響程度為：提取次數(shù)＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞固液比＞提取時(shí)間，最佳提取工藝為加25倍量體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇提取2次，每次2h。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)核桃分心木總皂苷的純化工藝進(jìn)行了研究，研究表明D101型大孔吸附樹脂對(duì)核桃分心木皂苷具有良好的吸附性能，具有較大的吸附量，且易吸附、易解吸，最大上樣量為180mL，水洗脫量8BV，洗脫劑體積分?jǐn)?shù)50%乙醇，洗脫體積7BV。實(shí)驗(yàn)中確定的總皂苷提取純化工藝可為進(jìn)一步提取純化分心木總皂苷提供借鑒，從而為進(jìn)一步開發(fā)分心木有效部位奠定基礎(chǔ)。

［1］茹克婭·沙德克.維吾爾醫(yī)常用藥材學(xué)（維吾爾文）：下冊(cè)［M］.烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1993：323.

［2］阿巴拜克熱·熱合曼.維吾爾醫(yī)常用生藥（維吾爾文）［M］.烏魯木齊：新疆人民衛(wèi)生出版社，2004：772.

［3］穆塔力甫·艾力，阿吉·艾米提.維吾爾醫(yī)常用草藥（維吾爾文）［M］.烏魯木齊：新疆人民衛(wèi)生出版社，2005：695.

［4］全國(guó)中草藥匯編編寫組.中草藥大辭典：上冊(cè)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1975：667.

［5］高莉，王艷梅，帕提古麗·馬合木提.核桃分心木粗提物抑菌活性的研究［J］.食品科學(xué)，2008，29（11）：69－71.

［6］宋藝君，王昌利，郭濤.正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選穿山龍總皂苷的提取工藝［J］.西北藥學(xué)雜志，2010，25（2）：101－102.

［7］劉霞，岐琳，李延，等.大孔吸附樹脂純化鹿藥總皂苷和總黃酮的研究［J］.西北藥學(xué)雜志，2012，27（6）：516－519.

Study on extraction and purification process for total saponins from Xinjiang Diaphragma juglandis Fructus

ZHU Qingmei，LINGHU Chen，Aytulun SZMAYIL＊（College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China）

Objective To optimize the extraction and purification process of total saponins from Diaphragma juglandis Fructus.Methods Taking oleanolic acid as a reference substance，the content of total saponins was determined by UV.Effect of extraction time，solid－liquid ratio，ethanol concentration and extraction times on the yield of total saponins was investigated by single factor test and orthogonal test.The total saponins were purified by macroreticular resin.Results The optimized extraction conditions were as follows：the powder of Diaphragma juglandis Fructus was subjected to reflux extraction for 2times with 80%ethanol at 80℃，each extraction lasting for 2h.For each extraction，the solid－liquid ratio was 25.The optimized purification conditions were as follows：D101macroreticular resin，impurities removed with 8folds of water，eluted with 7folds of 50%ethanol.Conclusion The process was simple and feasible.The result was satisfactory.

Diaphragma juglandis Fructus；total saponins；extraction technology；macroreticular resin；purification technology

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.01.006

R282

A

1004－2407（2015）01－0020－04

2014－07－29）

烏魯木齊市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：Y121310009）

朱青梅，女，在讀碩士研究生

＊通信作者：阿依吐倫·斯馬義，女，教授，碩士生導(dǎo)師