醫(yī)學實驗室血清球蛋白不確定度評定

趙芳 季伙燕 李海泉 王建新 蘇建友 沈榮春 王惠民▲ 邵可可

1.江蘇省血液中心輸血研究室，江蘇南京210042；2.南通大學附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇南通226001；3.江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院檢驗科，江蘇鹽城224001

醫(yī)學實驗室血清球蛋白不確定度評定

趙芳1，2季伙燕2李海泉2王建新2蘇建友2沈榮春2王惠民2▲邵可可3

1.江蘇省血液中心輸血研究室，江蘇南京210042；2.南通大學附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇南通226001；3.江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院檢驗科，江蘇鹽城224001

目的以醫(yī)學實驗室血清球蛋白為例，研究如何用top-down法評定測量不確定度，為臨床決策提供一定依據(jù)。方法應用top-down法評定不確定度，先評定出有證參考物質(zhì)（CRM）總蛋白（TP）和白蛋白（Alb）的不確定度，再把這兩項的不確定度合成，即為球蛋白（Glb）不確定度。結果濃度為70.10 g/L的TP、37.2 g/L的Alb的相對合成不確定度分別為1.77%、1.83%。Glb相對合成不確定度為2.55%，相對擴展不確定度為5.10%（k=2）。結論用top-down法評定Glb不確定度具有可行性，其可判斷患者兩次測量結果是否具有統(tǒng)計學差異，對患者的臨床診斷和治療具有潛在指導作用。

測量不確定度；血清球蛋白；偏移；期間不精密度

測量不確定度（measurement uncertainty，MU）簡稱不確定度，指根據(jù)所用到的信息，表征賦予被測量量值分散性的非負參數(shù)[1]，是反映測量結果準確性的重要參數(shù)。MU在廣泛計量領域應用已經(jīng)很多年，但在檢驗醫(yī)學應用較少。目前用于實驗室的國際標準主要是ISO/IEC 17025《檢測和校準實驗室能力的通用要求》[2]，ISO 15189《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力的專用要求》[3]。在認可活動中，中國合格評定國家認可委員會（CNAS）等同采用的文件分別是CNAS-CL01《檢測和校準實驗室能力認可準則》[4]和CNAS-CL02《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則》，兩者都要求提出評定MU[5]。建立參考體系的臨床實驗室必須按ISO 15193（Measurement of quantities in samples of biological origin-Presentationofreferencemeasurementprocedures）、ISO 15194（Measurement of quantities in samples of biological origin-Description of reference materials）[6，7]規(guī)范參考測量方法的應用、參考物質(zhì)管理和實驗室的管理，而且在這些活動過程中，都必須對測量不確定度進行評定。由于每個測量或校準結果必然受到某種因素的影響，而MU的評定提供了可能存在誤差范圍的信息，所以其可用于實驗室向臨床提供正確地解釋和應用各種測量結果。楊振華教授曾指出：檢驗醫(yī)學界在臨床實驗室各項檢測結果不確定度如何進行計算[8]是應用“不確定度”時遇到的主要問題。本文自2013年來研究血清球蛋白（Glb）不確定度評定，可為臨床肝臟疾病病變的嚴重性提供客觀指標[9-12]，為臨床醫(yī)師診斷疾病、判斷病情及預后提供重要參考價值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

總蛋白為NIST的國際有證參考物質(zhì)（TP SRM 927d），白蛋白為IRMM國際有證參考物質(zhì)（Alb ERMDA470K/IFCC）?？偟鞍祝═P，雙縮脲法）、白蛋白（Alb，溴甲酚綠法）測定試劑盒購自上海復星長征醫(yī)學科學有限公司；室內(nèi)質(zhì)控品均購自美國（Bio-Rad）公司；校準血清購自英國（Randox）公司。Advia 2400全自動生化分析儀購自德國Siemens公司；德國Sartorius BT 25S電子天平（精度0.01mg）；Fluke-1521電子溫度計；德國Eppendorf reference移液器；Millipore Direct-Q 3UV純水儀；藥勺、藥杯、燒杯、容量瓶[13]。

1.2 方法

在臨床生化檢測中，Glb濃度=TP濃度－Alb濃度，因此Glb濃度測量不確定度為TP濃度不確定度與Alb濃度不確定度的合成不確定度。用top-down法[14]評定不確定度[15-19]時，不確定度分量包括偏移和實驗室內(nèi)重復性、期間不精密度或復現(xiàn)性，本論文采用期間不精密度。使用Excel 2007，運用公式對結果中的數(shù)據(jù)（正態(tài)分布下的定量資料）進行處理、分析。

1.3 血清白蛋白及總蛋白復溶

1.3.1 白蛋白（ERM-DA470K/IFCC）復溶實驗前1 d下午將白蛋白（ERM-DA470K/IFCC）從冰箱中取出，在室溫下平衡1 h。輕輕敲擊試劑瓶，確保內(nèi)容物完全落至試劑瓶底部。小心打開試劑瓶蓋并拔出橡膠塞，將其放在電子天平上稱量，待天平讀數(shù)穩(wěn)定后按“去皮”鍵置零。使用移液器沿瓶壁緩緩加入純水，精確稱量至（1.0000±0.0001）g。蓋上橡膠塞及試劑瓶蓋，在室溫下復溶1 h后，輕輕混勻至少5次。將試劑瓶配制好的溶液置室溫下靜置12 h。使用前1 h內(nèi)再輕輕顛倒混勻5次。

1.3.2 總蛋白（NIST 927d）復溶將總蛋白（NIST 927d）從-4℃冰箱取出平衡至室溫后輕輕混勻數(shù)次。

1.3.3 白蛋白、總蛋白濃度測定按照常規(guī)測量系統(tǒng)標準操作程序，每次實驗前用常規(guī)配套校準品對西門子Advia 2400全自動生化分析儀進行校準，校準通過后首先測量質(zhì)控樣本，如質(zhì)控結果在允許范圍內(nèi)，則可對上述復溶的Alb和TP樣本進行測量，每天測量3次，連續(xù)測量5 d。

1.4 白蛋白、總蛋白濃度偏移的不確定度及相對不確定度評定

與偏移相關的測量不確定度（ubias）分量包括偏移（b）、有證參考物質(zhì)（CRM）的不確定度（uCref）及CRM測量重復性。

其中b為實驗所得偏移的量值，x為重復測量CRM所得均值，為CRM的靶值。

其中uCref為CRM的標準測量不確定度，UCref為CRM的擴展不確定度，k為95%可信區(qū)間的包含因子。

其中sCRM為重復測量CRM的標準差，n為測量天數(shù)。依據(jù)不確定度傳播律，如果實驗室不修正偏移，應按公式（4）計算偏移的合成標準不確定度。

1.4.4 偏移的相對不確定度計算

其中ubias偏移的合成標準不確定度，xCRM為有證參考物質(zhì)的靶值。

1.5 白蛋白、總蛋白期間不精密度評定

利用醫(yī)學實驗室的常規(guī)質(zhì)控結果計算實驗室內(nèi)期間不精密度（CV）。根據(jù)澳大利亞生物化學學會（AACB）推薦，使用2013年1～6月份連續(xù)6個月的實驗室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)可計算實驗室期間不精密度。按公式（6）計算CV。

1.6 白蛋白、總蛋白相對合成標準不確定度評定

根據(jù)不確定度傳播律原則，將偏移的相對不確定度及期間不精密度進行合成即為相對合成不確定度，即

1.7 球蛋白相對不確定度評定

Glb濃度相對測量不確定度為TP濃度相對不確定度與Alb濃度相對不確定度的合成不確定度，根據(jù)不確定度傳播律原則，Glb的相對不確定度為：

1.8 球蛋白相對擴展不確定度評定

相對擴展不確定度U由相對合成不確定度乘以包含因子（k）獲得，本論文評定95%置信水平下的不確定度，因此k=2，則

2 結果

2.1 白蛋白、總蛋白濃度測定結果

在德國西門子Advia 2400全自動生化分析儀上，嚴格按照常規(guī)測量程序要求，測量TP和Alb濃度，每天重復測量3次，連續(xù)測量5 d，結果數(shù)據(jù)見表1。

2.2 白蛋白、總蛋白濃度偏移的不確定度及相對不確定度

根據(jù)1.2.3所述，偏移的不確定度包括偏移（b）、CRM的不確定度（uCref）、重復測量引起的不確定度S2CRM/n，運用公式（4）計算偏移的不確定度，運用公式（5）計算偏移的相對不確定度，測量計算結果原始數(shù)據(jù)見表1。

2.3 白蛋白偏移的不確定度及相對不確定度

2.4 總蛋白偏移的不確定度及相對不確定度

2.5 白蛋白、總蛋白期間不精密度

2.5.1 白蛋白的期間不精密度使用醫(yī)學實驗室2013年連續(xù)6個月的室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)計算白蛋白的期間不精密度，具體數(shù)據(jù)見表2。

其中，SD1～SD6分別代表白蛋白2013年1～6月份室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)的期間不精密度。

2.5.2 總蛋白的期間不精密度使用醫(yī)學實驗室2013年連續(xù)6個月的室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)計算總蛋白的期間不精密度，具體數(shù)據(jù)見表2。

2.6 白蛋白、總蛋白相對合成標準不確定度

用top-down方法評定白蛋白、總蛋白的相對合成不確定度為偏移的相對不確定度與期間不精密度的合成值，具體結果數(shù)據(jù)見表3。

表1TP、Alb測量結果及相關數(shù)據(jù)

表2醫(yī)學實驗室TP、Alb室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)

2.6.1 球蛋白相對合成不確定度根據(jù)公式（10）和表3中的數(shù)據(jù)計算球蛋白的相對不確定度。

表3TP、Alb相對合成不確定度

2.6.2 球蛋白相對擴展不確定度根據(jù)公式（11），計算血清球蛋白的相對擴展不確定度。

%U=%uc×k（k=2）

%UGlb=2.55%×2=5.10%

通過本研究得出血清球蛋白濃度的相對合成不確定度為2.55%，相對擴展不確定度5.10%（k=2）。當醫(yī)師需要決定同一患者不同時間段的兩個測量結果間是否有差異，通過不確定度評定就可以實現(xiàn)。

如某一患者第一次測量血清球蛋白濃度為30 g/L，再次測量升高為36 g/L，如果已知球蛋白合成不確定度是0.765 g/L，兩次測量結果前后差異6 g/L，確實有差異嗎？如果二次測量結果相比超出2.77×uc（Glb），即超出2.12 g/L，這樣兩次結果有統(tǒng)計學差異，此處高出6 g/L，說明該患者兩次測量結果的差異有統(tǒng)計學意義。

3 討論

血清球蛋白（Glb）是臨床生化檢驗較為重要的指標。本研究主要用top-down方法對Glb測量不確定度進行評定，探討測量不確定度在臨床檢驗中的應用，為檢驗質(zhì)量的持續(xù)改進提供重要依據(jù)。top-down法評定不確定度需要考慮偏移和不精密度兩個分量，偏移可經(jīng)過測定CRM，并將測定均值與靶值相減獲得，不精密度評定可利用實驗室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)，因此topdown法評定MU適用于醫(yī)學常規(guī)實驗室。

在臨床中對判定肝臟病理程度，測量Glb不確定度有一定的參考價值，而A/G值能更準確地反映肝臟病理程度。血清Glb對臨床醫(yī)師診斷疾病、判斷病情及預后具有重要參考價值。因此，系統(tǒng)評定醫(yī)學實驗室Glb不確定度是十分有必要的。臨床醫(yī)師經(jīng)常需要比較同一患者不同時間段檢驗報告測量結果，并分析判斷兩次測量結果差異是否有臨床意義，通過比較測量結果是否大于2.77×uc即可判斷，而通過不確定度評定還可判斷患者檢測結果是否超出參考范圍，因此MU的評定具有一定的臨床應用價值。

本文研究血清Glb的不確定度評估方法，并探討其臨床應用價值，研究相對而言比較局限，不僅是對Glb的測量不確定度評定的研究，而是為了在今后的工作中可以Glb不確定度評定方法為參考，對醫(yī)學實驗室的每一個檢驗項目的測量不確定度都進行評定，加強實驗室與臨床的聯(lián)系，及時向臨床提供檢測結果的不確定度信息，從而幫助臨床改進對患者結果的解釋；進一步促進檢驗與臨床的合作，從而更準確地利用檢驗結果診斷疾病，提高醫(yī)療水平和服務質(zhì)量。

本研究以測量不確定度的相關理論[21，22]為基礎，以血清Glb為研究對象，用top-down法對醫(yī)學實驗室常規(guī)生化檢驗項目的測量不確定度進行評定，并在如何評定偏移的不確定度和精密度方面進行了一些探索研究。主要運用top-down法評定醫(yī)學實驗室測量不確定度——基于正確度和實驗室期間不精密度，使用一個有賦值和聲稱不確定度的國際有證參物質(zhì)（CRM），通過實驗、數(shù)據(jù)處理和分析，可靠地求得偏移（bias）及偏移的不確定度（ubias），再利用實驗室室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)求得實驗室期間不精密度，最終通過不確定度傳播律求得血清Glb的合成不確定度和擴展不確定度。并根據(jù)Glb不確定度評定結果判斷患者不同次測量結果間是否具有統(tǒng)計學差異，從而確定了不確定度評定的臨床應用價值。不確定度為實驗室檢測結果的可靠性提供了合理解釋，對于患者的臨床診斷和治療具有潛在指導作用。

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Evaluation of measurement uncertainty of serum globulin in medical laboratory

ZHAO Fang1,2JI Huoyan2LI Haiquan2WANG Jianxin2SU Jianyou2SHEN Rongchun2WANG Huimin2SHAO Keke3
1.Research Room of Blood Transfusion,Jiangsu Blood Center,Nanjing210042,China;2.Department of Laboratory, Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong226001,China;3.Department of Laboratory,Yancheng First People’s Hospital in Jiangsu Province,Yancheng224001,China

ObjectiveTo study how to use the top-down method to evaluate the measurement uncertainty based on the seroglobulin in medical laboratories in order to provide certain reference for clinical decision making.MethodsThe top-down method was used to evaluate the uncertainty,which included evaluating the uncertainties of certified reference materials(CRM)such as total protein(TP)and albumin(Alb)at first and then combining the two uncertainties to get the uncertainty of globulin(Glb).ResultsThe relative combined uncertainties of 70.10 g/L of TP and 37.2 g/L of Alb were 1.77%and 1.83%respectively.The relative combined uncertainty of Glb was 2.55%and its relative expanded uncertainty was 5.10%(k=2).ConclusionThe application of the top-down method in evaluating Glb uncertainty is feasible,can determine if there exists statistical difference between patient’s two measurements,and it is of potential guiding effect on the clinical diagnosis and treatment for patients.

Measurement uncertainty;Serum globulin;Bias;Intermediate imprecision

R446

A

1673-9701（2015）27-0008-04

2015-06-03）

江蘇省南通市科技項目（HS2012009）；國家質(zhì)檢總局公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目（201210066）

▲通訊作者